实验四、五：目的基因的PCR扩增.ppt

实验四、五：目的基因的PCR扩增、 PCR产物的琼脂糖凝胶检测与 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 教学目的：PCR反应、产物检测的基本原理与实 验技术 2.能力目标：具有PCR扩增体系设计、参数设置基本 能力，掌握扩增产物检测方法 二、实验原理 1.PCR(聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)原理:体外快速扩增特定基因或DNA序列 PCR动画 2.聚丙烯酰胺凝胶检测原理 聚丙烯酰胺凝胶有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度 和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘 稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加， 并形成DNA分子通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺丙烯 酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。聚 丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表 明它能分离大小相差只有1-2bp 的DNA 三、仪器、材料和试剂 (一)仪器 PCR扩增仪、 琼脂糖凝胶电泳系统（琼脂糖水平电泳槽和电泳仪）、紫 外透射仪或凝胶成像分析系统、移液器（2,10,20,200,1000l）、磁力搅 拌器、垂直板电泳槽、水平摇床、枪头等耗材。 （二）试剂、材料 1.试剂：10PCR缓冲液(含Mg2) 、 dNTP混合物、 Taq酶、质粒DNA模 板、引物对（正向引物和反向引物） 、PCR 管、丙烯酰胺、过硫酸胺 、N,N,N,N-四甲基二乙胺（TEMED）、Tris碱、硼酸、Na2EDTA2H2O、 冰醋酸、无水乙醇、Na2OH、AgNO3、甲醛、10 m mol/L dNTP混合物、 5U/uL Taq DNA聚合酶、10 PCR Buffer、50xTAE、引物对（鲤微卫星 引物对）、过硫酸铵。 2.材料：1ng/ uL DNA模板 3.教师预备实验：引物对筛选。（说明，该引物对为教师科研过 程中筛选引物对，参考文献：岳兴建, 邹远超，王永明等.元江鲤种群 遗传多样性. 生态学报. 2013, 33(13).） 4.储存液 5TBE 、10%过硫酸铵(AP) 、30%丙烯酰胺母液 四、实验步骤 (一)PCR 1.PCR方案编制 6个样本/同学， 建议编制8个样 本量以便分样 取样后 要标记 2.在1.5mL离心管中混合反应液，振荡混合 3.0.2mLPCR管加模板 4.分液 n5.振荡混合，置于PCR仪内 n6.PCR仪上参数设定， Run。 （二）琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果 （三）PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染过程中所用的溶液配制 (1)10%过硫酸铵(AP) (2)8-12%聚丙烯酰胺凝胶的配制（自行选择，建议6%-10%） (3)染色液、显影液 2.聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 n(1)清洗制胶玻璃板，烘干后，组装玻璃板，用1.0%的琼脂糖封底； n(2)按照配方表将各组分混匀，混匀后迅速灌胶；（注意防止气泡产生） n(3)当胶灌至离玻璃板上缘0.5 cm 时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿 下不能有气泡，室温下聚合13小时； n(4)凝胶聚合完全后，轻轻拔出梳子； n(5)在PCR产物中加入5 L左右上样缓冲液，用微量进样器取8L混 合液，加到点样孔，同时留出1个点样孔加入分子量标记物Marker 3.聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染检测（4步） 参考文献：梁宏伟，王长忠，李忠，等. 聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法的 建立.遗传.2008,30（10）. n1)电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液1TBE，取出凝胶，剥到染色盒 中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗1一2次,1-2min/次； n(2)固定：加入固定液，在摇床上轻摇固定30min，把固定液倒入到一个容器 中，以便做终止使用；用双蒸水洗2次，每次漂洗时间不超过1min，洗的过程 中缓慢摇动，倒去双蒸水；（通常有这步，我们省掉.Why?见通过染色液、固 定液配方分析） n(3)染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色20min，然后双蒸水迅速漂洗2次， 每次漂洗时间不超过20s，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水； n(4)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的 条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2次（通常是这样操作，我们使用自 来水冲洗，便可省掉下一步。Why?），洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水； n(5)终止显色：把最初使用的固定液加入染色盒中，缓慢摇动5min，倒掉终止 液，然后用双蒸水洗胶三遍，洗的过程中缓慢摇动，每次1min； n(6)拍照：将胶置于凝胶成相系统上，白光下用数码相机进行拍照，保存照片 用于带型分析。 1）电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳 缓冲液1TBE，取出凝胶，剥到染色盒 中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中 漂洗1一2次,1-2min/次； 3)染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色20min， 然后双蒸水迅速漂洗2次，每次漂洗时间不超过 20s，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水； 5)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察 显色情况，出现比较清晰的条带时就停止显色 ，然后双蒸水迅速漂洗2次（通常是这样操作。 使用自来水冲洗，便可省掉下一步。Why?）， 洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水 五、注意事项 n（1）掌握好PCR反应中的引物终浓度。引物过多会产生错误引导或 产生引物二聚体, 过低则降低产量； n（2）模板量过多则可能增加非特异性产物，DNA中的杂质也会影响 PCR的效率。 n（3）银染检测过程中，电泳完成、染色完成一定要用双蒸水清洗！ ！ 六、实验安排 本实验1.5天内可做完。上午做PCR反应，下午 做电泳检测，晚上聚丙烯酰胺电泳，次日上午染色 。 七、作业 n1）设计一个50ul的PCR反应体系；