贵州黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范”项目验收报告.doc

1 附件 1：贵州省科技计划科技报告格式模板 科技报告编号：429790500-黔科合 NY 字20113064 号/01 公开范围延迟时限 科科 技技 报报 告告 报告名称：“贵州黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范”项 目验收报告 支持渠道：_2011 年度贵州省农业攻关计划_ 报告类别：_验收报告_ 编制单位：_毕节市畜牧兽医科学研究所_ 编制时间：_2016-07-11_ 2 科科技技报报告告基基本本信信息息表表 1. 报告名称（填写项目名称+报告类别，20 字以内） “贵州黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范”项目验收报告 2. 作者及作者单位（对报告编写做出直接贡献的研究人员及其所在单位） 宋德荣 毕节市畜牧兽医科学研究所 彭 华 毕节市畜牧兽医科学研究所 周大荣 毕节市畜牧兽医科学研究所 江兴美 毕节市畜牧兽医科学研究所 王嘉福 贵州大学 3. 公开范围（分为公开和延期公开，延期公开需明确 延期时间）公开 4. 编制时间（YYYY-MM-DD） 2016-07-11 5. 报告编号（单位机构代码+项目编号+/顺序号）429790500-黔科合 NY 字20113064 号 6. 备注（需要注明的一些特殊事项，如延期公开报告的查询权限、免责声明、报告与其它工作或 成果的联系等） 本项目是以前期课题工作为基础开展研究，形成的报告仅反映本项目的执行情况，包括实施成 效、取得的成果、创新及经济效益等。 7. 摘要（1000 字以内） 项目是贵州省科技厅立项的农业攻关计划，其编号为“黔科合 NY 字20113064 号”。执行 时间为 2011 年 6 月-2014 年 6 月。项目选择在赫章县的古达、威奢两个乡镇及毕节地区科创畜 牧开发有限责任公司实施，开展贵州黑马羊扩群繁育、生长及繁殖性状相关基因的多态性检测、 杂交试验及高效养殖配套技术研究与示范等。项目采取切实可行的开放式选育路线，进行黑马 羊的繁育与选育，就是把核心群农户中生产的、经培育的青年后备公羊推广到商品生产群中去， 而选育点商品生产群农户中的优秀公羊又可引进到核心群农户中来，保证了选育群体优良基因 的双向流动。同时，商品生产群农户中培育出的优良后代又向周边乡镇农户辐射，开展应用推广。 项目实施三年，示范点建立黑马羊繁育示范户 305 户，建成黑马羊繁育种群 4643 只，三年累计 向社会提供优质种羊 5102 只、商品羊 13320 只，推广人工种草 150 亩，开展天然草地改良 400 亩，指导养殖户新修和改造圈舍 1530。开展技术培训、咨询指导 532 人次。通过选育，核心群 周岁公、母羊体重比地方标准指标提高 13.69%、19.59%，成年公、母羊体重比地方标准指标提 高 12.42%、16.91%；商品群周岁公、母羊体重比地方标准指标提高 39.63%、42.85%，成年公、母 羊体重比地方标准指标提高 24.74%、22.36%。产羔率达 151.42%，比贵州黑山羊地方标准平均 值 122%提高 24.11%。周岁公羊屠宰率达 48.50%，比贵州黑山羊地方标准 45%高出 7.78%，比 合同指标高 0.5 个百分点。项目发表论文 28 篇，其中 SCI 期刊 1 篇、中文核心期刊 10 篇；参编 专著 2 部；参编技术手册 1 本；获国家实用新型专利授权 1 件；培养博士 1 名、在读博士 1 名、农 推硕士 1 名，中级晋升副高 2 名，初级晋升中级 5 名，外派到贵州省遗传育种与繁殖重点实验室 进行分子生物学三个月的短期培训 1 名；并在无角间性、扩群繁育、育种值估计等研究方法上实 现了创新。项目实施三年，养殖户累计实现总产值 1702.29 万元，总经济效益 1233.36 万元，新增 3 总产值 537.01 万元，新增纯收入 394.04 万元，人均增收 3229.84 万元，投入产出比为 1:3.63，投 入新增纯收入比 1:0.84。综上所述，全面完成合同规定的目标任务及技术指标。 8.关键词（3-8 个）：黑马羊，扩群繁育，选育提高，生长及繁殖性状多态性检测，养殖技术研究示 范 项目名称贵州黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范 依托部门 贵州省科技 厅 计划名称 2011 年度贵州 省农业攻关计 划 项目编号 黔科合 NY 字20113064 号 领域或专题生物育种 第一承担单位毕节市畜牧兽医科学研究所 参加单位 贵州大学动物科学学院；毕节市科创畜牧开发有限责 任公司；贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司。 总经费 66.90国拨经费30.00 9. 项目信息 项目负责人宋德荣起止年月 2011.06- 2014.06 姓名彭华 电 话-Mail mksph126.c om 10. 联系人 单位 毕节市畜牧兽医科学研究所 4 目目录录 1 1 引言引言8 2 2 主体部分主体部分9 2.1 主要研究内容主要研究内容 .9 2.1.1 贵州黑马羊扩群繁育研究，建立黑马羊纯繁体系，开展扩繁应用研究及选育。9 2.1.2 建立 BLUP 动物模型及种公羊个体育种值的估测，优选种羊。9 2.1.3 贵州黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性研究。9 2.1.4 贵州黑马羊导入同色毛被高产外血提高其生产性能的杂交试验研究。9 2.1.5 高寒山区高效养殖配套技术研究与示范。9 2.2 主要考核指标主要考核指标 .9 2.2.1 建成核心群、扩繁群 100 户，规模 1500 只，生产群 200 户、规模 3000 只。9 2.2.2 核心群周岁、成年公母体重比贵州黑山羊地方标准二级种羊提高 10%，生产群周岁、 成年公母羊体重及产羔率比标准提高 20%，周岁屠宰率达 48%。.9 2.2.3 申请专利 1 项，培训 500 人次。9 2.2.4 省级以上期刊发表论文 5 篇，其中核心期刊 3 篇。10 2.2.5 培养研究生 1 名。10 2.2.6 三年累计提供种羊 5000 只，推广商品羊 10000 只；推广种草及草地改良 500 亩；指导圈 改 1000 平方米；养殖户累计实现经济效益 500 万元。.10 2.3 技术路线与实施方法技术路线与实施方法 .10 2.3.1 技术路线10 2.3.2 实施方法10 2.4 考核指标完成情况考核指标完成情况 .11 2.4.1 实施地点11 2.4.2 示范规模12 2.4.3 生产性能12 2.4.4 自主知识产权13 5 2.4.5 人才培养13 2.4.6 技术培训13 2.4.7 经济指标14 2.4.8 资金使用情况14 2.5 研究内容完成情况研究内容完成情况 .14 2.5.1 贵州黑马羊扩群繁育研究取得进展14 2.5.2 建立了 BLUP 动物模型并应用于公羊个体育种值的估测21 2.5.3 开展了黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性检测22 2.5.4 完成了黑马羊导入努比亚羊、简阳大耳羊的杂交试验34 2.5.5 开展了黑马羊高效养殖配套技术的熟化与集成示范35 2.6 项目实施取得的成效项目实施取得的成效 .43 2.6.1 建立了有一定规模的黑马羊扩繁群体43 2.6.2 品种群结构及整齐度得到优化43 2.6.3 黑马羊生产性能显著提高43 2.6.4 黑马羊导入努比亚羊、简阳大耳羊血液可取得较好杂交效果44 2.6.5 高效养殖配套技术集成示范取得显著效果44 2.6.6 项目取得显著经济、社会及生态效益.44 3 结论部分结论部分45 3.1 摸索出了黑马羊的生长发育、扩群繁育规律.45 3.2 初步掌握了黑山羊、黑马羊、无角间性羊的基因型存在形式.46 3.3 初步得出颌下髯、颈部肉垂等外观性状在群体中所占比例.46 3.4 初步得出了主要影响生长和繁殖性状的基因.46 3.5 培育黑马羊具有较好的经济价值并丰富了生物的多样性.46 3.6 关于无角与合下髯、颈部肉垂等外观特征的遗传机理研究.47 3.7 熟化了一套高寒山区高效养殖配套技术.47 6 插插图图清清单单 图图 1 黑马羊黑马羊 0-60 月龄生长曲线月龄生长曲线18 图图 2 黑马羊各时间段日增重走势黑马羊各时间段日增重走势19 图图 3 黑马羊基因组黑马羊基因组 DNA 电泳结果电泳结果 .23 图图 4 GDF9 基因基因 PCR 扩增结果扩增结果 23 图图 5 BMP15 基因基因 PCR 扩增结果扩增结果23 图图6 ESR基基因因PCR扩扩增增结结果果24 图图7 ADAMTS1基基因因PCR扩扩增增结结果果24 图图8 GHSR基基因因PCR扩扩增增结结果果.24 图图 9 CIS 基因基因 PCR 扩增结果扩增结果25 图图 10 STAT5A 基因基因 PCR 扩增结果扩增结果 .25 图图 11 测序胶图测序胶图26 图图 12 测序胶图测序胶图26 图图 13 测序胶图测序胶图26 图图 14 测序胶图测序胶图27 图图 15 测序胶图测序胶图27 图图 16 测序胶图测序胶图27 图图 17 测序胶图测序胶图28 图图 18 测序胶图测序胶图28 7 附附表表清清单单 表表 1 项目示范规模项目示范规模12 表表 2 项目种草、圈改示范规模项目种草、圈改示范规模12 表表 3 种羊初步选择标准种羊初步选择标准14 表表 4 选育后体重与地方标准对照选育后体重与地方标准对照16 表表 5 不同杂交方式后代基因型表现形式不同杂交方式后代基因型表现形式20 表表 6 前前 20 名种公羊育种值排名名种公羊育种值排名22 表表 7 变异位点的位置和突变的碱基类型变异位点的位置和突变的碱基类型28 表表 8 贵州黑马羊基因型频率和等位基因频率贵州黑马羊基因型频率和等位基因频率31 表表 9 贵州黑马羊体温、呼吸、脉搏变化对照贵州黑马羊体温、呼吸、脉搏变化对照39 表表 10 舍饲、放牧条件下角膜舍饲、放牧条件下角膜炎炎、口疮、腐蹄病、内科病对照、口疮、腐蹄病、内科病对照40 8 “贵贵州州黑黑马马羊羊繁繁育育及及高高效效养养殖殖技技术术研研究究与与示示范范” 项项目目验验收收报报告告 1 1 引引言言 贵州黑马羊是从贵州黑山羊中分化出来的一个新的品系，分布 于赫章、威宁、纳雍等县，现存栏 3 万只左右1。经长期的黑马羊基 地建设，其中形成了以赫章县古达乡为中心，威奢、兴发、达依等周 边乡镇为辐射区域的黑马羊核心产区。上世纪 90 年代初以来，毕 节市牧科所在上述区域一直从事黑马羊的基地建设、选育提高、无 角间性性状的研究，前期取得了一些研究成果，初步掌握了无角性 状、间性性状的遗传机理，掌握了其生长速度、繁殖性能水平，并优 越于有角羊。其生产性能及马头、合下髯、颈部肉垂、黑色毛被等独 特的外观特征，为品种的形成奠定了坚实基础，遗传特性稳定。但 从整体水平来看，黑马羊在生产性能、扩群繁育、角性状的分化、合 下髯和颈部肉垂遗传机理、无角纯合个体测交、养殖配套技术等方 面还存在问题，这是项目的研究目的。本项目紧紧围绕这些问题， 开展了黑马羊的扩群繁育、BLUP 动物模型估测种公羊个体育种值、 生长及繁殖性状相关基因的多态性检测、导入同色毛被高产外血的 杂交试验及养殖配套技术的研究与示范等工作。项目的研究，初步 掌握了黑山羊、黑马羊、无角间性羊的基因型存在形式；初步得出 颌下髯、颈部肉垂等遗传特征在群体中所占的比例；摸索出了黑马 9 羊的生长发育、扩群繁育规律；把 BLUP 模型估测种公畜个体育种 值的方法应用到黑马羊的选育上，并形成了一套贵州黑马羊高效生 产养殖配套技术。本项目的研究内容除本课题外，在国内未见相关 报道。 2 2 主主体体部部分分 2.1 主主要要研研究究内内容容 2.1.1 贵州黑马羊扩群繁育研究，建立黑马羊纯繁体系，开展扩 繁应用研究及选育。 2.1.2 建立 BLUP 动物模型及种公羊个体育种值的估测，优选种 羊。 2.1.3 贵州黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性研究。 2.1.4 贵州黑马羊导入同色毛被高产外血提高其生产性能的杂交 试验研究。 2.1.5 高寒山区高效养殖配套技术研究与示范。 2.2 主主要要考考核核指指标标 2.2.1 建成核心群、扩繁群 100 户，规模 1500 只，生产群 200 户、 规模 3000 只。 2.2.2 核心群周岁、成年公母体重比贵州黑山羊地方标准二级 种羊提高 10%，生产群周岁、成年公母羊体重及产羔率比标准提 高 20%，周岁屠宰率达 48%。 2.2.3 申请专利 1 项，培训 500 人次。 10 2.2.4 省级以上期刊发表论文 5 篇，其中核心期刊 3 篇。 2.2.5 培养研究生 1 名。 2.2.6 三年累计提供种羊 5000 只，推广商品羊 10000 只；推广种 草及草地改良 500 亩；指导圈改 1000 平方米；养殖户累计实现经济效 益 500 万元。 2.3 技技术术路路线线与与实实施施方方法法 2.3.1 技术路线 采取切实可行的开放式选育路线。为加大选择差，把核心群农 户中生产的、经培育的青年后备公羊推广到基础群中去，而选育点 基础群农户中的优秀公羊又可引进到核心群农户中来，保证了选育 群体优良基因的双向流动。同时，基础群农户中培育出的优良后代 又向周边乡镇农户辐射，开展应用推广。 2.3.2 实施方法 1、把好核心群的组建关。对各个点的无角羊进行抽样测定，制 定适宜的核心群种羊初步选择标准，符合标准的进入核心群，低于 标准的进入基础群。 2、把好种羊的日常鉴定关。根据黑马羊的生长发育水平和繁 殖性能制订不相关性状的综合选择指数，作好种畜的鉴定工作。 3、把好核心种畜的调换关。为避免近亲交配，不定期交换种公 羊。为强化选种选配，血缘较近不配，非优质种公羊不配，等级低公 羊与等级高母羊不配，幼龄公母羊不陪，老龄公母羊不配。 11 4、把好“两期一培育”补饲育羔技术关。 “两期一培育”系指加强 母羊妊娠后期 2 个月和哺乳前期 2 个月补饲管理和羔羊培育。主要 解决传统养殖条件下，饲养管理粗放，饲料结构单一，营养不全，维 生素、微量元素缺乏等引起的羔羊代谢性疾病。同时提高羔羊初生 重、母羊泌乳量及体质，以解决羔羊死亡率高、母羊产后恢复慢和 发情晚的问题。 5、把好“三定”保健技术关。 “三定”指定期防疫驱虫，定期消毒 圈舍，定期强化健胃补饲，降低发病率和死亡率。根据毕节地区近 年来发生的疫病和寄生虫感染情况，研究制定出毕节高寒山区黑山 羊传染病防疫技术操作规程和预防性驱虫技术操作规程，为山羊健 康养殖提供保证。 6、开展技术培训和咨询、指导，以提高农户的饲养管理水平和 疾病防治能力，为农村培养了一支永久型的技术队伍。 7、不定期召开课题日常工作会，检查督促上次安排的工作任 务，分析解决课题实施过程中出现的各种问题，深入讨论需攻关的 一些技术问题，安排部署当前工作。 8、整合贵州黑山羊选育成果转化与高效养殖技术示范 （2012GB2F200408）项目资金配套，弥补项目资金的不足。 2.4 考考核核指指标标完完成成情情况况 2.4.1 实施地点 项目示范点选择在赫章县的古达、威奢 2 个乡镇及毕节市科创 12 畜牧开发有限责任公司。 2.4.2 示范规模 1、项目实施三年，初步建立贵州黑马羊纯繁体系，三个示范点 建立黑马羊繁育示范户 305 户、示范规模 4643 只，其中核心群（含扩 繁群）102 户、示范规模 1596 只，商品生产群 203 户、示范规模 3047 只。累计推广种羊 5102 只、商品羊 13320 只。 表表 1 项项目目示示范范规规模模 核心群（含扩繁群）商品生产群合计 示范点 示范户 （户） 示范规模 （只） 推广规模 （只） 示范户 （户） 示范规模 （只） 推广规模 （只） 示范户 （户） 示范规模 （只） 推广规模 （只） 古达8513423926149223310259234357514185 威奢131861018507372645639233663 科创4681584774168145574 合计10215965102203304713320305464318422 2、推广人工种草 150 亩，开展天然草地改良 400 亩，指导养殖 户改造圈舍 1530（表 2）。 表表 2 项项目目种种草草、 、圈圈改改示示范范规规模模 示范点人工种草（亩）草地改良（亩）圈舍改造（） 古达50-1200 威奢50400330 科创50- 合计1504001530 2.4.3 生产性能 项目实施三年，示范点核心群（含扩繁群）周岁公、母羊体重比地 方标准指标提高 13.69%、19.59%，成年公、母羊体重比地方标准指标 13 提高 12.42%、16.91%；商品生产群周岁公、母羊体重比地方标准指标 提高 39.63%、42.85%，成年公、母羊体重比地方标准指标提高 24.74%、22.36%。产羔率达 151.42%，比贵州黑山羊地方标准平均值 122%（108%-136%）提高 24.11%。周岁公羊屠宰率达 48.50%，比贵州 黑山羊地方标准 45%提高 7.78%，比合同指标高 0.5 个百分点。 2.4.4 自主知识产权 1、申请国家专利 2 件，其中发明专利 1 件、实用新型专利 1 件。 一种绵羊、山羊品种的提纯复壮方法， 2012 年 6 月 4 日申请国家发 明专利 1 件，申请号 201210179674.3，处于实审阶段。一种适用于羊 防疫驱虫及个体鉴定的工作台，2016 年 6 月 8 日获国家实用新型专 利授权。 2、省级以上期刊发表论文 28 篇，其中 SCI 期刊 1 篇、中文核心 期刊 10 篇、优秀期刊 17 篇；参编专著 2 部；参编技术手册 1 本。 2.4.5 人才培养 协助培养博士 1 名（2011.09-2014.06）、在读博士 1 名（2012.09- 2016.12）、农推硕士 1 名（2012.04-2016.06），中级晋升副高 2 名 （2014.12、2015.12），初级晋升中级 5 名 （2012.12、2013.11、2014.11、2015.11），贵州省动物遗传育种与繁殖 重点实验室短期培训 1 名（2013.05-08）。支持参加国际国内学术交流 会 4 次，其中国际 1 次、国内 3 次，共计参加人员5 人。 2.4.6 技术培训 14 提高农户的饲养管理水平和疾病防治能力，三年来共开展技术 培训、咨询指导 532 人次。 2.4.7 经济指标 项目实施三年，通过提纯复壮、扩群繁育，建立黑马羊示范群 4643 只，累计推广种羊 5102 只、商品羊 13320 只；推广人工种草 150 亩，开展天然草地改良 400 亩；指导养殖户新修和改造圈舍 1530。 养殖户累计实现经济效益 1233.36 万元，新增纯收入 394.04 万元，人 均新增 3229.84 元（见经济效益分析报告）。 2.4.8 资金使用情况 项目总资金 65.7 万元，其中省科技计划拨款 30 万元、自筹资金 35.7 万元。根据审计报告显示，项目整合配套资金 36.67 万元，专项 资金支出 30.23 万元，合计使用 66.9 万元。 2.5 研研究究内内容容完完成成情情况况 2.5.1 贵州黑马羊扩群繁育研究取得进展 1、生产性能研究 （1）初步选择标准选择 根据实际测定数据和参考贵州黑山羊地方标准制订初步选择标 准，以组建核心群（含扩繁群）和商品生产群。 （表 3）。 表表 3 种种羊羊初初步步选选择择标标准准 年龄性别体重（kg）体长（cm）体高（cm）胸围（cm） 成年公32555265 母29555265 15 周岁公22504760 母18504760 6 月龄公16454255 母14454255 （2）综合选择指数法选择 制订不相关性状综合选择指数，严格选种选配，并做到无角种公 羊的异地调换工作，严格控制近交程度。制定综合选择指数，对核心 群进行选择留种、整群扩繁，是做好种畜的鉴定工作的重要参考指标。 选择的目的不仅是要提高当代畜群的生产水平，更重要的是提高未 来畜群的生产水平，即要求种畜能产生优良的后代。但是由于种畜本 身的表型不能完全表示它产生优良后代的能力，因此，种畜的选择必 须考虑其血统和性状的遗传特点。故，为加快选育的遗传进展，制订 综合选择指数选择留种比较准确，现根据黑山羊的生长发育水平和 繁殖性能制订不相关性状的综合选择指数，生长发育水平以外形评 分性状表示，繁殖性能以产羔率性状表示。 计算必要的数据：畜群均数（Pi）由本地区黑山羊的统计资料 计算；性状遗传力（hi）参考有关育种文献而得；经济重要性（Wi）根据 各种性状在育种工作中的重要性确定。 现将有关数据列出： 产 羔 率：P1=1.40 h21=0.3 W1=0.70 外形评分：P2=70 分 h22=0.3 W2=0.30 制订综合选择指数： 16 Wihi=0.700.3+0.300.3=0.30 WihiPi100 0.700.3100 0.300.3100 = = P1+ P2 PiWihi 1.360.3 700.3 =51.47P1+0.4286 P2 制订标准：根据产羔率为 136%（贵州黑山羊地方标准上限）2、 外形评分为 70 分以上的个体才能达入选条件，则制订的综合选择指 数 I=51.471.36+0.428670=100.00。 因此，凡个体的综合选择指数达 100.00 的则进入核心群，低于 指标 100.00 的淘汰进入商品群。 （3）生产性能变化 生长性能 示范点核心群（含扩繁群）周岁公、母羊体重比地方标准指标提 高 13.69%、19.59%，成年公、母羊体重提高 12.42%、16.91%；商品 群周岁公、母羊体重提高 39.63%、42.85%，成年公、母羊体重提高 24.74%、22.36%（表 4）。 表表 4 选选育育后后体体重重与与地地方方标标准准对对照照 地方标准（二级种羊） 2 扩群选育后 类别年龄性别 体重范围(kg)平均体重(kg)体重(kg)比地方标准提高 -2629.564.3513.69% 核 心 群 周岁 -2226.314.5819.59% 17 -3842.725.5112.42% 成年 -3338.585.7216.91% 16-221926.534.1239.63% 周岁 15-1816.523.575.2042.85% 29-333138.675.7324.74% 商品 生产 群 成年 26-2927.533.655.5422.36% 繁殖性能 通过选种选配，产羔率达 151.42%，比贵州黑山羊地方标准平 均值 122%（108%-136%）2提高 24.11%；宋德荣等报道贵州黑山羊 胎产羔率为 148.81%3，黑马羊产羔率比其高 2.61 个百分点。 肉用性能 选择生长速度快的公、母羊留种，以提高胴体重量。据屠宰测 定，周岁公羊屠宰率达 48.50%，比贵州黑山羊地方标准 45%高出 7.78%，比合同指标高 0.5 个百分点；宋德荣等（2003）报道，周岁贵 州黑山羊屠宰率为 46.36%3，黑马羊屠宰率高出 4.62%；李孟年等 （1994）报道周岁羯羊屠宰率 48.68%4，比同龄贵州黑山羊羯羊高 出 4.74%；成年羯羊屠宰率 51.61%4，比同龄贵州黑山羊羯羊高出 6.28%。黔北麻羊是贵州三大地方山羊品种之一，罗卫星等（2010） 报道，对黔北麻羊屠宰测定，2-3 岁羯羊屠宰率为 45.05%、周岁母 羊屠宰率为 37.68%5，比同龄黑马羊低。说明黑马羊具有较好的产 肉性能。 2、生长发育规律研究 （1）生长发育曲线 18 根据月龄、体重作出的累积生长曲线可见，贵州黑马羊 19 月 龄生长较快，其中 13 月龄最快，36 月龄次之，69 月龄稍缓， 直到 9 月龄成为公、母羊的生长拐点。过了拐点，公羊 948 月龄、 母羊 936 月龄均呈直线生长。黑马羊的这一生长发育规律，对羔 羊 3 月龄断奶成活、912 月繁殖初配、母羊补饲、肉羊育肥有着指 导作用（图 1）。 图图1 贵贵州州黑黑马马羊羊0-60月月龄龄生生长长发发育育规规律律 Figure 1 Guizhou black horse goat 0-60 months of age growth rule 0 10 20 30 40 50 60 初初生生newborn 1月月龄龄in january the age 3月月龄龄in march the age 6月月龄龄in june the age 9月月龄龄in september the age 12月月龄龄in december the age 24月月龄龄24 months of age 36月月龄龄36 months of age 48月月龄龄48 months of age 60月月龄龄60 months of age 体体重重（k kg g）w we ei ig gh ht t( (k kg g) ) 图 1 黑马羊 0-60 月龄生长曲线 （2）各年龄段公母羊日增重 据测定数据统计，公、母羊日增重，03 月龄分别为 129.56g、126.33g，06 月龄分别为 88.12g、84.59g，09 月龄分别 为 72.16g、63.85g，012 月龄分别为 73.64g、61.62g，024 月龄分 别为 46.00g、36.66g，036 月龄分别为 36.75g、30.37g，048 月龄 分别为 33.60g、22.27g，060 月龄母羊为 15.25g。公、母羊日增重速 19 度，03 月龄最快，06 月龄次之，09 月龄与 012 月龄下降稍 缓且相当，024 月龄、036 月龄、048 月龄、060 月龄逐渐下 降，公羊日增重速度比母羊快（图 2）。表明肥羔生产最佳出栏时间为 69 月龄，为加快肉羊周转，提高出栏率，提供了理论依据。 图图1 1 贵贵州州黑黑马马羊羊各各时时间间段段日日增增重重走走势势 F Fi ig gu ur re e 1 1 G Gu ui iz zh ho ou u b bl la ac ck k h ho or rs se e g go oa at t e ea ac ch h t ti im me e p pe er ri io od d A AD DG G t tr re en nd d 0 20 40 60 80 100 120 140 0-30-60-90-120-240-360-480-60 月龄 month 日日增增重重（g g）A AD DG G( (g g) ) 图 2 黑马羊各时间段日增重走势 3、放牧行为及鲜草采食量研究 （1）放牧行为观察 对 10 只成年黑马羊进行放牧行为观察，连续观察 5 天，全天放 牧 8.5 个小时。结果表明，每只羊采食时间占 61.75%，游走时间占 13.17%，卧息时间占 11.83%，彷徨时间占 13.00%，哺乳时间占 0.13%， 饮水时间占 0.12%。 （2）鲜草采食量测定 在秋季放牧条件下，每天随机对 10 只成年黑马羊进行鲜草采食 量测定试验，结果表明，成年黑马羊日采食鲜草量为 4.96kg，占体重 20 14.59%，鲜草折合成风干物质 0.89kg，占其体重的 2.62%。周寿荣等 （1985）测定，成都麻羊日采食鲜草量为 4.94-5.20kg，占体重 12.70%- 15.80%6；杨秀歧等（1987）报道沿河山羊日采食量，春季为 5.64kg， 秋季为 5.35kg，平均为 5.50kg，日采食量占体重 15.70 %-19.11%7。 黑马羊日采食鲜草量与成都麻羊相近，低于沿河山羊，可能与品种、 年龄的分组不同有关。 4、有角、无角黑山羊基因型分析 山羊无角性状是常染色体显性无角基因 P 引起（免疫遗传学分 析）。间性羊的遗传基础为雌性，间性基因与无角基因相连锁，存在同 一条常染色体上，间性基因纯合表现不育。间性基因用一对 I、i 表示， 一旦 ii 纯合，表示山羊间性不育8。依据有角、无角羊正反交试验及 无角羊相互杂交试验分析，山羊的基因型存在多种形式，其中有角山 羊存在 ppII 一种形式，正常无角山羊存在 PPII、PPIi 和 PpII、PpIi 四 种形式、间性羊存在 PPii、Ppii 两种形式（表 5）。 表表 5 不不同同杂杂交交方方式式后后代代基基因因型型表表现现形形式式 项目有角羊基因型无角羊基因型间性羊基因型 有角无角ppIIPpII、PpIi- 无角有角ppIIPpII、PpIi- 无角无角ppIIPPII、PPIi、PpII、PpIiPP(ii)、Pp(ii) 5、颌下髯、颈部肉垂特征遗传分析 据对 166 只 19 个群体的黑马羊观察统计，有颌下髯占群体比例 为 80.72%，其中新田村为 100%，科创公司为 16.67-100%，新田村稍 21 高；有肉垂个体占群体比例为 19.28%，其中新田村为 30.00%- 38.89%，科创公司为 0-33.33%，科创公司稍低。山羊的胡须是显性的 性连锁遗传。山羊的肉垂由一个外显率完全的显性常染色体基因 W 控制，但表型有变异。不同品种的基因频率差别很大。张沅（2001）报 道有肉垂（WW 或 Ww）的母羊的多产性比无肉垂的母羊（ww）大约 高 7%。颌下髯、颈部肉垂随着有目的的选育而上升，当无角亲本有 颌下髯、颈部肉垂时，后代产生颌下髯、颈部肉垂的几率就高9。赫 章县古达乡新田村黑马羊肉垂比例比毕节市科创公司高，是由于新 田村黑马羊选育基地建立的时间较长。关于极少部分有角羊也有肉 垂，是不是有肉垂的无角母羊与有角公羊的杂交后代，还需继续观察。 关于无角与肉垂是否存在连锁关系及遗传机理也有待进一步研究。 无角、颌下髯、颈部肉垂等表型性状作为培育黑马羊品种的典型外貌 特征，育种中具有非常重要的意义。 2.5.2 建立了 BLUP 动物模型并应用于公羊个体育种值的估测 建立公羊单性状 BLUP 模型，估测种公羊个体育种值，优选继代 种公羊。根据赫章县古达、威奢等选育点 52 只黑马种公羊 261 只子 女的周岁体重鉴定记录，应用 BLUP 方法对可能影响黑马羊周岁体 重的出生类型（单羔、双羔）、性别、出生年份和出生地点进行方差分 析，设计出估测周岁重性状的 BLUP 线性模型为 y=Xb+Za+e。式中： y 为各性状观察值向量；b 为固定效应；a 为个体加性遗传效应；e 为残 差效应向量；X、Z 分别为固定效应、个体加性效应的结构矩阵。 22 利用建立的 y=Xb+Za+e 线性模型计算出了 52 只种公羊育种值， 按优劣次序排序，并选择前 20 名公羊作为核心群继代种羊（表 6）。 表表 6 前前 20 名名种种公公羊羊育育种种值值排排名名 羊号育种值排序羊号育种值排序 公羊46.18241公羊271.66411 公羊205.68682公羊281.429512 公羊494.28083公羊31.363713 公羊263.89844公羊481.338514 公羊193.69775公羊501.223115 公羊383.25926公羊321.083316 公羊82.95527公羊50.589817 公羊72.26298公羊360.333318 公羊312.12189公羊350.275619 公羊61.68610公羊420.235220 2.5.3 开展了黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性检测 实验以 GDF9、BMP15、ESR、ADAMTS1、GHSR、CIS、STAT5A 等 7 个基因为候选基因，并进行 PCR 扩增及 PCR 产物纯化后测序。 以便对影响繁殖性状的前 4 个基因、在影响生长性状的后 3 个基因 进行多态性分析，以寻找显著影响繁殖性状和生长性状的主效基因。 1、黑马羊基因组 DNA 的提取检测 用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的 DNA，结果如图，从图 3 可知，大部分 DNA 样品质量都较好，条带单一、明亮，完整性较好、 纯度和浓度都较高。个别 DNA 有轻微降解。提取的基因组 DNA 的 浓度在 30-60ng/l 之间可直接用于 PCR 反应。 23 图10 GDF9基因PCR扩增结果图10 GDF9基因PCR扩增结果 图11 BMP15基因PCR扩增结果图11 BMP15基因PCR扩增结果 图9黑马羊基因组DNA电泳结果图9黑马羊基因组DNA电泳结果 图 3 黑马羊基因组 DNA 电泳结果 2、PCR 产物扩增检测 本实验用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，从图可见， PCR 扩增出的大小在 500bp900 之间的特异条带为目的条带，扩 增产物条带清晰、明亮、整齐、无杂带。并且大小符合所要扩增的目 的片断的大小，扩增结果见图 4-图 10。 图 4 GDF9 基因 PCR 扩增结果 图 5 BMP15 基因 PCR 扩增结果 24 图6 ESR基因PCR扩增结果 图7 ADAMTS1基因PCR扩增结果 图8 GHSR基因PCR扩增结果 图12 ESR基因PCR扩增结果图12 ESR基因PCR扩增结果 图13 ADAMTS1基因PCR扩增结果图13 ADAMTS1基因PCR扩增结果 图14 GHSR基因PCR扩增结果图14 GHSR基因PCR扩增结果 25 图 9 CIS 基因 PCR 扩增结果 图 10 STAT5A 基因 PCR 扩增结果 3、测序结果 试验样品送到北京诺赛基因组有限公司进行直接测序。测序结 果送回后，应用 DNAStar 软件进行编辑，然后用 Clustalx 软件进行 比对，并与 GenBank 上公布的基因参考序列比对，检测出各个基因 的变异位点。 GDF9 基因：贵州黑马羊 GDF9 基因共检测出 1 个突变位点，在 GDF9 基因外显子 2 的 562 碱基处发生了突变(AC)。测序胶图见 图16 STAT5A基因PCR扩增结果图16 STAT5A基因PCR扩增结果 图15 CIS基因PCR扩增结果图15 CIS基因PCR扩增结果 26 图 11： 图 11 测序胶图 BMP15 基因：贵州黑马羊 BMP15 基因共检测出 1 个突变位点, 在 BMP15 基因外显子 2 的 480 位碱基处发生了突变(CG)。测序胶 图见图 12： 图 12 测序胶图 ESR 基因：ESR 基因共检测出 2 个突变位点,在第 541 位点发生 了由 GA 碱基突变 ；第 618 位点发生了由 GT 碱基突变。测序胶 图见图 13： 图 13 测序胶图 ADAMTS1 基因：贵州黑马羊 ADAMTS1 基因共检测出 4 个突 27 变位点, 在第 127 位点发生了由 AG 碱基突变 ；第 243 位点发生 了由 GT 碱基突变，303 位点发生了由 GT 碱基突变 403 位点发 生了由 AG 碱基突变。测序胶图见图 14： 图 14 测序胶图 GHSR 基因：贵州黑马羊 GHSR 基因共检测出 2 个突变位点, 在 第 70 位点发生了由 TA 碱基突变 ；第 229 位点发生了由 GA 碱 基突变。测序胶图见图 15： 图 15 测序胶图 CIS 基因：贵州黑马羊 CIS 基因 BLAST 分析共发现 3 个 SNPs， SNPs 位点分别为：T66C、G175T、 C219A，均为新发现位点。测序胶 图见图 16： 图 16 测序胶图 28 STAT5A 基因：贵州黑马羊 STAT5A 基因 BLAST 分析共发现 5 个 SNPs, SNPs 位点分别为：G256A、T269C、T275C、G289A、G298A 均为新发现位点。测序胶图见图 17、图 18： G256A T269C T275C 图 17 测序胶图 G289A A298G 图 18 测序胶图 4、变异位点和突变的碱基类型，见表 7。 表表 7 变变异异位位点点的的位位置置和和突突变变的的碱碱基基类类型型 品种基因变异位点突变碱基 GDF9562AC BMP15480CG ESR541GA 618GT ADAMTS1127AG 243GT 303GT 403AG 29 GHSR73TG 229GA CIS66TC 175GT 219CA STAT5A256GA 269TC 275TC 289GA 298AG 5、氨基酸序列同源性分析 将本实验中所测得的扩增片段的突变和正常序列分别翻译成 氨基酸序列，然后进行两两比较，发现在贵州黑马羊 GDF9 基因外 显子 2 的 562 位编码的氨基酸改变,导致谷氨酰胺突变为脯氨酸； BMP15 基因外显子 2 的 480 位编码的氨基酸改变,导致谷氨酰胺突 变谷氨酸;ESR 突变没有引起氨基酸的改变。ADAMTS1 基因的第 九外显子有四个变异位点 G+127A，T+243G，T+303G，G403A 其 中 G+127A 为错义突变，导致编码的丝氨酸（Ser）变为苯丙氨酸 （Phe）。T+243G 为错义突变，导致编码的亮氨酸（Leu）变为丝氨酸 （Ser）; T+303G 谷氨酰胺（Gln），G403A(G)结氨酸(Val)为同义突变， GHSR 突变为同义突变，没有引起氨基酸的改变。但是同义突变自 由能发生了改变，可能影响到蛋白质二级结构的稳定性。CIS 基因 第 2 外显子 T+66C 错义突变，导致编码的亮氨酸（Leu）变为脯氨酸 （Pro）； G+175T 错义突变，导致编码的丝氨酸（Ser）变为酪氨酸 （Tyr）；在 STAT5A 基因中第六、七外显子检测出 5 个单碱基突变， 五个突变皆为错义突变，导致编码的氨基酸发生改变；在 256 位点 30 发生了由 GA 碱基突变，突变导致编码的半胱氨酸（Cys） 变为酪 氨酸（Tyr）；在 269 位点发生了由 TC 碱基突变, 突变导致编码的 缬氨酸 （Val）丙氨酸（Ala） 在 275 位点发生了由 TC 碱基突变, 突变导致编码的缬氨酸（Val）丙氨酸（Ala）在 289 位点发生了由 GA 碱基突变, 突变导致编码的精氨酸（Arg）组氨酸（His） 在 298 位点发生了由 AG 碱基突变,碱基突变导致编码的组氨酸（His）精 氨酸（Arg）。 6、群体遗传学分析 等位基因频率（Allele frequency）：通常描述群体特征的指标是 基因频率和基因型频率。基因频率是指一个群体中某一等位基因对 其他等位基因的相对比率。基因型频率是指一个群体中某一性状的 各种基因型之间的比率。他们的计算公式如下（假设在一个基因座 位上有两个等位基因）： BBABAA ABAA nnn nn p 2 2 BBABAA ABBB nnn nn q 2 2 其中：p 为等位基因 A 的频率，q 为等位基因 B 的频率 nAA、nAB、nBB 分别为群体中基因型为 AA、AB、BB 的个体数。 基因型频率（genotype frequency）：基因型频率是指一个群体中 某一性状的各种基因型之间的比率。他们的计算公式如下（假设在 一个基因座位上有两个等位基因）： BBABAA AA nnn n H BBABAA BB nnn n R 31 根据上述公式计算贵州黑马羊基因型频率和等位基因频率，见 表 8。 表表 8 贵贵州州黑黑马马羊羊基基因因型型频频率率和和等等位位基基因因频频率率 基因样本数基因型频率基因频率 GDF930AAACAC 0.43130.56870.84340.1566 BMP1530CCCGCG 0.36550.63450.82170.1783 ESR30GGGAGA 0.22500.77500.88750.1125 GGTGGT 0.52500.47500.48750.5125 ADAMTS130AAAGAG 0.42180.57820.39190.6081 GGGTGT 0.37150.66850.21520.7848 AAAGAG 0.38110.61890.24140.7586 GGGTGT 0.46570.53430.35420.6458 GHSR30TTTGTG 0.65830.34170.49460.5054 GGGAGA 0.53480.46520.44270.5573 CIS30TTTCTC 0.64530.35470.80320.1968 GGGTGT 0.62420.37580.79030.2097 CCCACA 0.58610.41390.77170.2283 STAT5A30GGGAGA 0.49870.50130.43590.5651 TTTCTC 0.46530.53470.45780.5422 TTTCTC 0.51240.48760.44570.5543 GGGAGA 0.49710.50290.43570.5643 AAAGAG 0.56420.43560.46380.5362 32 根据山羊 GDF9 基因序列的第二外显子、BMP15 基因序列的 第二外显子、ESR 基因部分外显子、ADAMTS1 基因的第九外显子、 GHSR 基因的第二外显子、CIS 基因的第二外显子、STAT5A 基因 的第六、七外显子序列设计引物，采用 PCR 产物直接测序法检验在 贵州黑马羊品种中的基因多态性，并与产仔数、生长性能进行相关 分析，结论如下： 对七个基因进行 PCR 扩增，确立了最佳 PCR 反应条件和反 应体系，对 PCR 产物纯化后进行直接测序，测序结果显示贵州黑马 羊品种的二个性转的七个基因中，影响繁殖性状及生长性状的六个 基因均为中度多态。 本实验在贵州黑马羊品种中检测 GDF9 基因在第 2 外显子 的 562 bp 处有 1 个 AC 的单碱基突变,碱基突变导致谷氨酰胺突 变为脯氨酸。贵州黑马羊产羔数在两个基因型之间呈现出 ACAA，差异