广西地方标准《常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范第3部分：疾病防治用药药效检验》（征求意见稿）.doc

ICS65.150B 52DB45广西壮族自治区地方标准DB 45/T XXXXX2016 常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范 第3部分：疾病防治用药药效检验The technical regulations of common freshwater farmed fish disease diagnosis and treatmentpart 3 drug efficacy test for disease control 2016 - XX - XX发布2016 - XX - XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/T XXXXX2016目次前言IV1范围12规范性引用文件13试剂和材料13.1试剂13.1.1无菌生理盐水13.1.2预溶剂13.1.3稀释剂13.2材料23.2.1培养基23.2.2菌株23.2.3病鱼样品23.2.4病幼样品23.2.5养殖池水23.2.6药物24仪器设备与器具24.1仪器设备24.2器具25抗生素药效检验25.1培养基制备25.1.1肉汤培养基25.1.2营养琼脂平板25.2百倍母液制备35.2.1试剂除菌35.2.2储存液制备35.2.3储存液定容35.2.4百倍母液稀释35.3MIC范围筛选35.3.1梯度药液配备35.3.2菌悬液制备35.3.3菌液接种35.3.4孵育35.3.5结果观察45.4MIC测定45.5抑菌圈测定45.5.1菌板制备45.5.2药液配置45.5.3药敏试验45.5.4抑菌圈测量45.6判定46消毒剂药效检验46.1药物称量46.2母液制备46.3检验56.3.1养殖用水消毒56.3.2细菌培养56.4结果观察56.5判定57杀虫驱虫药药效检验57.1外用杀虫药57.1.1药物称量57.1.2母液制备57.1.3母液稀释57.1.4检验57.1.5判定57.2内服驱虫药57.2.1病鱼样品暂养57.2.2药物称量67.2.3母液制备67.2.4药饵制作67.2.5药饵投喂67.2.6判定68水质改良剂药效检验68.1药物称量68.2母液制备68.3母液稀释68.4判定69免疫增强剂药效检验69.1病龟样品暂养69.2药物称量79.3母液制备79.4药饵制作79.5药饵投喂79.6结果观察79.7判定710记录7前言DB45/T 1087常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范分为三个部分第1部分资料记录、病因与病损度诊断及应对措施；第2部分疾病诊断与防治；第3部分疾病防治用药药效检验。本部分为DB45/T 1087的第3部分。本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准起草单位广西壮族自治区水产技术推广总站、广西大学。本标准起草人胡大胜、龙光华、黄钧、韩书煜、黄艳华、梁静真。8常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范 第3部分：疾病防治用药药效检验1 范围本标准规定了常见淡水养殖鱼类疾病防治用药药效检验的试剂与材料、仪器设备与器具、抗生素药效检验、消毒剂药效检验、杀虫驱虫药药效检验、水质改良剂药效检验、免疫增强剂药效检验与记录。本标准适用于广西境内常见淡水养殖鱼类疾病的诊断与防治。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 27623.1-2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 试剂和材料3.1 试剂3.1.1 无菌生理盐水精确称取8.50 g分析纯氯化钠，加入1 L蒸馏水溶解后加热至121高压灭菌15 min。3.1.2 预溶剂0.1 M二甲基甲酰胺溶液，0.1 N氢氧化钠溶液，乙醇。各种药物的预溶剂见表1。表1 各种抗生素的预溶剂药物名称预溶剂药物名称预溶剂磺胺甲噁唑0.1 N氢氧化钠硫酸新霉素蒸馏水氟苯尼考0.1 M二甲基甲酰胺盐酸多西环素蒸馏水甲砜霉素0.1 M二甲基甲酰胺乳酸诺氟沙星蒸馏水磺胺二甲嘧啶热乙醇烟酸诺氟沙星蒸馏水磺胺嘧啶钠蒸馏水3.1.3 稀释剂蒸馏水，质量符合GB/T 6682要求。3.2 材料3.2.1 培养基营养琼脂培养基，肉汤培养基。3.2.2 菌株嗜水气单胞菌标准菌株或确定耐药性消除的革兰氏阴性病原菌。3.2.3 病鱼样品确诊感染寄生虫或水霉的鱼种，数量30尾，用于杀虫驱虫药药效检验。3.2.4 病幼样品精神萎靡不振、两眼暗淡无神、活动迟缓的幼龟，数量30只，用于免疫增强剂药效检验。3.2.5 养殖池水氨氮含量1 mg/L的养殖池水200 L，用于水质改良剂药效检验。3.2.6 药物质控药物：盐酸多西环素，含量98.5%。待检药物：抗生素、消毒剂、杀虫驱虫药、水质改良剂和免疫增强剂。4 仪器设备与器具4.1 仪器设备生化培养箱，无菌操作台，生物显微镜，高压灭菌锅，精确度为0.1 mg的分析天平，麦氏比色管。4.2 器具20 L200 L、100 L1 000 L和1 000 L5 000 L移液器，30 L、50 L和250 L塑料容器，枪头，刻度吸管，洗耳球，药勺，1 L容量瓶，500 mL三角烧杯，玻璃棒，涂棒，培养皿，接种环，酒精灯，牛津杯，气泵。5 抗生素药效检验5.1 培养基制备5.1.1 肉汤培养基用干粉培养基制备成普通肉汤培养基，12l.3高压灭菌20 min后，4保存备用。5.1.2 营养琼脂平板用干粉培养基制备成普通营养琼脂平板，12l.3高压灭菌20 min后，4保存备用。5.2 百倍母液制备5.2.1 试剂除菌预溶剂用0.22 m微孔滤膜过滤除菌，稀释剂高压灭菌除菌。5.2.2 储存液制备5.2.2.1 药物称量用精确度0.1 mg分析天平精确称量含有效成分1 000 mg的药物，置于1 L烧杯中。示例1： 某厂家生产的某品牌含量10%氟苯尼考，称量时，准确称取10 g，置于1 L烧杯中。5.2.2.2 药物预溶按称量药物重量的3倍加预溶剂到烧杯中，充分搅拌溶解。5.2.3 储存液定容向加入容量瓶加入蒸馏水稀释，最后定容1 000 mL，过滤冷藏可储存7 d。5.2.4 百倍母液稀释另取一个500 mL烧杯，加入100 mL蒸馏水，用移液器精确吸出10 mL蒸馏水，再用移液器精确吸取定容储存液10 mL加入烧杯充分混匀。5.3 MIC范围筛选5.3.1 梯度药液配备参照GBT 27623.1执行。取10支试管，第1管加入10 mL普通肉汤培养基，第210管分别加入4 mL普通肉汤培养基。第1管吸出2 mL培养基，加入2 mL百倍母液混匀，吸出2 mL弃掉，吸4 mL加入第2管混匀，再吸4 mL加入第3管混匀，以此类推到第8管；第8管混匀后吸出4 mL弃掉，配置成20 g/mL、10 g/mL、5 g/mL、2.5 g/mL、1.25 g/mL、0.625 g/mL、0.312 g/mL和0.156 g/mL8个梯度药液。第9管和第10管不加药物，第9管作细菌生长对照，第10管作无菌控制对照。注： 配置磺胺类药物的梯度浓度时，第1管吸出5.12 mL培养基，加入5.12 mL储存液混匀，吸出2 mL弃掉，吸4 mL加入第2管混匀，再吸4 mL加入第3管混匀，以此类推到第8管；第8管混匀后吸出4 mL弃掉，配置成512 g/mL、256 g/mL、128 g/mL、64 g/mL、32 g/mL、16 g/mL、8 g/mL和4 g/mL8个梯度药液。5.3.2 菌悬液制备取经配套营养琼脂平板新鲜培养的待检菌株，用0.85%无菌生理盐水洗到已灭菌的试管中，加0.85%无菌生理盐水至菌液浓度为0.5108 CFU/mL。菌液浓度用麦氏比色管校正。5.3.3 菌液接种菌液制备好后，应在15 min加入第19管试管中，第10管不加。菌液接种后的最终浓度为5105 CFU/mL。菌液浓度用麦氏比色管校正。5.3.4 孵育菌液接种后，于28生化培养箱孵育24 h。5.3.5 结果观察取出试管观察：试管中液体澄清为无菌生长、半浑浊为少量菌生长、浑浊为大量菌生长，细菌生长对照管浑浊、无菌控制对照管澄清。记录试管中液体澄清的最小药液浓度和半浑浊的药液浓度。5.4 MIC测定根据最小药液浓度和半浑浊的药液浓度配置梯度药液，按照5.3操作重做试验，读取并记录最小抑菌浓度（MIC）。质控药物的MIC在0.5 g/mL2 g/mL范围内，试验有效。5.5 抑菌圈测定5.5.1 菌板制备取上述菌悬液100 L，注入营养琼脂平板中，用三角涂棒将菌悬液均匀涂抹于营养琼脂平板上。5.5.2 药液配置按照MIC的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20倍浓度分别配置药液。5.5.3 药敏试验无菌条件下，将经酒精灯火焰烧热一端的牛津杯放置在涂抹了菌悬液的营养琼脂平板上，间距3 cm，每个培养基平板放置5个。将配置好的各种浓度药液加入牛津杯杯体中，药液加至满而不溢为止。将营养琼脂平板置37生化培养箱中培养24 h。5.5.4 抑菌圈测量取出营养琼脂平板，测量记录抑菌圈直径，并按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）最新版的药敏试验标准判断各种浓度药液是否敏感。5.6 判定抑菌圈测定敏感的最小药物浓度说明书的用药浓度，判定该抗生素有效。6 消毒剂药效检验6.1 药物称量按药物使用说明书用量的1 000倍，用精确度为0.1 mg的分析天平精确称量药物，置于1 L容量瓶中。示例2： 某厂家生产的某品牌含量8%二氧化氯，说明书治疗用量为每667 m3水体用100 g150 g。取最大用量150 g，用药浓度为0.2249 mg/L。称量时，准确称取224.9 mg二氧化氯，置于1 000 mL容量瓶中。6.2 母液制备向容量瓶加入蒸馏水溶解、稀释，充分搅匀，最后定容1 000 mL。6.3 检验6.3.1 养殖用水消毒取30 L塑料容器加入20 L养殖用水，然后从容器中准确取出20 mL水再加20 mL母液，混匀静置消毒2 h。6.3.2 细菌培养分别取养殖用水和消毒2 h后水体各100 L，在无菌条件下，分别涂布于无菌平板上，28培养24 h。6.4 结果观察培养24 h后，取出平板观察菌落生长情况。6.5 判定涂布养殖用水平板长菌，涂布消毒2 h后水体平板不长菌，判定该消毒剂有效。7 杀虫驱虫药药效检验7.1 外用杀虫药7.1.1 药物称量按药物使用说明书用量的1 000倍，用精确度为0.1 mg的分析天平精确称量药物，置于1 L容量瓶中。示例3： 如1包200 g的杀虫药可用于8亩1 m水深池塘，即每667 m3水体用25 g，用药浓度为0.037 5 mg/L。称量时，准确称取37.5 mg杀虫药，置于1 000 mL容量瓶中。7.1.2 母液制备向加入容量瓶加入蒸馏水溶解、稀释，充分搅匀，最后定容1 000 mL。7.1.3 母液稀释取50L塑料容器4个，分别加入40 L水，然后分别从容器中准确移出40 mL水再加40 mL母液，充分搅匀。再取50L塑料容器1个，加入40 L水，作为对照。7.1.4 检验向4个容器分别放6尾8尾确诊感染寄生虫的鱼种入稀释母液的容器，30 min后用生物显微镜逐一检查鱼体表或鳃上寄生虫的脱落或死亡情况。7.1.5 判定2 h内，检验组鱼体表或鳃上寄生虫大部分脱落或死亡，对照组鱼体表或鳃上寄生虫没有脱落，判定该杀虫药有效。7.2 内服驱虫药7.2.1 病鱼样品暂养取250 L塑料容器4个，3个为检验组，1个为对照组；分别加入养殖用水150 L，各放养确诊感染体内寄生虫的鱼种7尾8尾，不间断充气增氧，投喂饲料1次/d，吸污1次/d。鱼种放养前称量总重。7.2.2 药物称量根据暂养鱼种总重和药物使用说明书，计算出鱼种用药总量，按鱼种用药总量的1 000倍精确度称量药物，置于1 L容量瓶中。7.2.3 母液制备向容量瓶加入蒸馏水溶解、稀释，充分搅匀，最后定容1 000 mL。7.2.4 药饵制作根据鱼种总重，按投率2.5%计算出饲料日投喂量。准确吸取1 mL母液，用蒸馏水稀释5倍10倍，均匀拌入饲料中，静置15 min。7.2.5 药饵投喂按说明书给检验组的鱼投喂药饵1个疗程，1次/d；对照组投喂饲料1次/d。7.2.6 判定投喂药饵1个疗程后次日，逐一解剖鱼，检查体内寄生虫，检验组鱼无寄生虫的，对照组鱼有寄生虫的，判定该驱虫药有效。8 水质改良剂药效检验8.1 药物称量根据药物使用说明书计算出10 L水的用药量，按10 L水用药量的1 000倍，精确称量药物，置于30 L塑料容器中。8.2 母液制备向塑料容器加入蒸馏水，充分搅匀，最后定容10 L。8.3 母液稀释取250 L塑料容器加入200 L养殖池水，用快速水质监测仪检测水体的氨氮，确定氨氮含量1 mg/L；然后从容器中准确取出2 L水再加2 L母液，充分搅匀，静置1 h后再检测水体的氨氮。8.4 判定用药前水质的氨氮含量1 mg/L，用药1 h后水质的氨氮0.3 mg/L，判定该水质改良剂有效。9 免疫增强剂药效检验9.1 病龟样品暂养取50 L塑料容器4个，3个为检验组，1个为对照组；分别加入养殖池水20 L，放养精神萎靡不振、两眼暗淡无神、活动迟缓的幼龟7只8只，投喂饲料1次/d，换水1次/d。幼龟放养前称量总重。9.2 药物称量根据暂养幼龟总重和药物使用说明书计算出幼龟用药总量，按幼龟用药总量的1 000倍精确称量药物，置于1 000 mL容量瓶中。9.3 母液制备向容量瓶加入蒸馏水溶解、稀释，充分搅匀，最后定容1 000 mL。9.4 药饵