《电泳步骤V》word版.docx

安装玻璃板查漏制分离胶画线注分离胶注水制浓缩胶倒水注胶制样沸水加热注样浓缩阶段电泳分离阶段电泳固定染色脱色1.安装玻璃板：注意平整，短板朝内安装2.查漏：用蒸馏水沿内壁注满，静置5-10min3.制12%分离胶：参照配方，注意一定要迅速，使用5ml, 200l的移液器。加完用胶头滴管轻轻搅拌再滴加。留意温度，必要时可以在冰水中配置4.画线：从长板上沿至下3cm处画线（建议先画线再配胶，不能太低或是高，否则配胶比较麻烦）5.注分离胶：沿内壁迅速注入，注意不能产生气泡（不慎产生气泡可以使用加样器戳破或是吸出），加至画线处停止6.注水：加入蒸馏水至壁沿，慢慢加入，后静置1H（这个时间有待确定，与AP,TEMED,以及室温有关,直至水和胶出现分层线）7.制5%浓缩胶：参照配方，注意一定要迅速，使用5ml,1000l，200l的移液器（留意温度，必要时可以在冰水中配置）8.倒水注胶：将水倒出，注意一定要小心。加入浓缩胶。静置30min（时间有待确定，与AP,TEMED,以及室温有关，一定用胶头滴管加，用移液器容易导致凝胶形成出现问题。甚至可以在冷水中操作。具体指示是可以看到梳子可胶出现界限，需要仔细观察 黄行健）9.制样：将蛋白按照目标浓度所需比例加入样品缓冲液10.沸水加热：沸水中加热约4min(使pro降解为亚基)，注意取泡沫让样品管浮起（避免高温炸开，导致样品污染）11.注样：取出梳子（取出时，如果发现“干拔”比较难可以湿拔 ），将整体放入套装塑料盒中，加入电极缓冲液（加入前可以检查PH是否为8.3），液面标准为浸没内板，架子外与其同高（主要是为了防止电泳过程中由于连通器原理导致内液面低于内板 刘思宇）。加样使用加样器，每次取20l，小心加入，加样后每次用蒸馏水润洗3次。12.浓缩阶段电泳：80v/15ma，设置好后按启/停键开始。注意用冰水水降温（设置时可以根据需要保证某一因素不变,适当调大另一因素，保证恒定 刘思宇）13.分离阶段电泳：100v/30ma ，（设置时可以根据需要保证某一因素不变,适当调大另一因素，保证恒定 刘思宇）结束时蓝色条带距下边缘1cm（这个长度也可以灵活确定，因为蛋白质和溴酚蓝的分子量相比很大，甚至可以让溴酚蓝跑离底部 黄行健）14.固定：取出，用水清洗后（注意不要弄烂）放入固定液中，静置1H.（此时可以停留存放较长时间），固定液可以回收使用15.染色：移至染色液中，静置1H（严格控制时间）16.脱色:放入脱色液，第一次可以脱色时间较短，而后每次约30min.直至条带清晰，增加脱色液更换频率可以适当加快脱色分离胶（有套装、有配方，10ML）参考配方加入水：3.3ml30%丙烯酰胺:4ml1.5MTRIS-HCl: 2.5ml10%SDS :100lAP ：100lTeMED（有毒）：5l浓缩胶（有套装、有配方，6ml）（实际使用证明存在不足以加满的情况）参考配方加入水：4ml30%丙烯酰胺:1ml1.0MTRIS-HCl: 1ml10%SDS :80lAP ：60lTeMED（有毒）：8l样品缓冲液(8ml,4保存)使蛋白沉降水：4ml0.5MPH=6.8Tris-Hcl缓冲液:1.0ml（配置时按照所需体积秤取，用HCl调节PH值，既要保证PH，又要保证体积）甘油:0.8ml(比较粘稠，取用时注意体积)用于加大样品密度，使其沉降巯基乙醇;0.4ml（非还原性电泳不加，用水替代）用于使二硫键打开10%SDS:1.6ml（搅拌时注意不要过快，否则容易产生气泡）0.1%溴酚蓝：0.2ml（较难配置0.1%的溴酚蓝水溶液，具体可以参照/link?url=KW5L_JjB3w7LFei7HVBFoXn2ynWQkqFEntM4FB6q95RkIYsnaJ4NUurMBqt9LLUQX0me1D1bMVgNEyUXc8iQUq#2配置）电极缓冲液（1000ml）Tris:3.03gGly:14.14gSDS:1.0g溶解后加入1000ml量筒中，定容至1000ml固定液（200ml）异丙醇：50ml乙酸：20m