梅花鹿胎盘免疫调节因子及其体外活性研究硕士论.doc

分类号：单位代码：10140密 级：公开学 号：403071289硕 士 学 位 论 文梅花鹿胎盘免疫调节因子及其体外活性研究论文题目：Bioactivity Assay of Cervine Placental Immune Regulator Factor In Vitro英文题目：论文作者：边 媛 媛指导教师：胡风庆 教授 专 业：食 品 科 学完成时间：二O一O年五月申请辽宁大学硕士学位论文梅花鹿胎盘免疫调节因子及其体外活性研究Bioactivity Assay of Cervine Placental Immune Regulator Factor In Vitro作 者：边 媛 媛指导教师：胡风庆 教授 专 业：食 品 科 学答辩时间：二O一O年五月二一年五月中国辽宁辽宁大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的。论文中取得的研究成果除加以标注的内容外，不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中进行了标注，并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权辽宁大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。学校须按照授权对学位论文进行管理，不得超越授权对学位论文进行任意处理。保密（ ），在 年后解密适用本授权书。（保密：请在括号内划“”）授权人签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日摘 要摘 要现代研究证明，鹿胎盘含有多种蛋白质、激素、酶类、抗体、磷脂、生长因子、细胞因子及能刺激机体免疫系统的小分子活性物质等，具有抗肿瘤、增强抵抗力和提高机体免疫力等作用，在临床可替代人胎盘，具有巨大应用潜力。本研究以梅花鹿胎盘为原料，通过透析、超滤等技术制备具有生物活性的小分子活性物质鹿胎免疫调节因子（cervine placental immune regulator factor, CPIRF）。通过正交试验，对超声功率、固液比、超声时间、丙酮量等因素进行优化，确定最优化的条件。利用鼠脾淋巴细胞增殖试验、Ea玫瑰花环试验评价其免疫活性，利用MTT法评价其抑瘤活性。研究结果如下：（1）CPIRF制备条件优化：以超声功率、固液比、超声时间、丙酮量为四因素设计正交试验，结果表明：超声功率影响最大，丙酮量和超声时间其次，固液比影响最小。以鹿胎盘提取液多肽含量为指标，确定最优化制备条件为：超声功率400 w、固液比1:1、超声时间120 s、丙酮量1:3（提取液:丙酮）。之后利用透析（或超滤）方法制备得到微黄色透明液体的CPIRF。（2）CPIRF成分分析：利用Folin-酚法、苯酚-硫酸法、钒钼酸铵显色法分别测定CPIRF中的多肽、多糖和核酸含量。结果表明：CPIRF含有3.70.04 mg/ml多肽，3.30.07 g/ml核酸，0.540.002 mg/ml多糖。（3）免疫活性评价：利用鼠脾淋巴细胞增殖试验、Ea玫瑰花环试验评价CPIRF免疫活性。在4 g/ml-0.4 ng/ml，具有鼠脾淋巴细胞增殖活性。当40 ng/ml时，增殖率可达95.33%。Ea玫瑰花环试验具有浓度依赖性，4 g/ml时，Ea玫瑰花环成环率最高，达47%。结果表明，CPIRF具有良好的免疫调节和免疫增强作用。（4）体外抑瘤活性评价：以MTT法评价CPIRF对宫颈癌Hela细胞株和大肠癌CX-1细胞株的体外抑瘤活性。CPIRF可显著抑制Hela细胞株和CX-1细胞株的生长，最佳抑瘤浓度为4 ng/ml，Hela细胞株和CX-1细胞株的抑瘤率分别为72.4%和50.3%，表明CPIRF具有较强的体外抑瘤活性。综上所述，本研究通过制备条件优化，获得具有抗肿瘤活性和免疫活性的CPIRF。该制备条件简单，所得到的CPIRF很好的保持了原有生物学活性，有利于开发高附加值功能食品和药品。这为解决当前鹿产品生产中存在的加工粗糙、产品初级、种类单一等问题，提供了科学依据，该研究对于鹿产业链的形成、发展、壮大，促进鹿产业的发展具有重要意义。关键词：梅花鹿胎盘，免疫调节因子，正交试验，制备条件，生物学活性IIAbstractABSTRACTRecent researches showed that cervine placenta contained many compositions including proteins, hormones, enzymes, antibodies, phospholipids, growth factors, cytokines and small molecules which could stimulate immune system. Cervine placenta possessing the functions including anti-tumor, enhancing resistance and immunity could be used to substitute human placenta in clinic and had greatly applicable potentiality. Cervine placenta used as raw material, in this study, bioactive small molecules, cervine placental immune regulator factor (CPIRF), were preparated through dialysis or ultrafiltration. The conditions were optimized through orthogonal experiment. The major factors, including the ultrasonic power, solid-liquid ratio, extraction time and the amount of acetone, were confirmed. Immune activity of CPIRF was evaluated through mouse spleen lymphocyte proliferation and Ea-rosette test. Anti-tumor activity was evaluated through MTT method. The results were as follows: (1) The optimum conditions of CPIRF preparation: The orthogonal experiment was studied so as to confirm the factors including ultrasonic power, solid-liquid ratio, extraction time and the amount of acetone. Influence of ultrasonic power was the greatest, extraction time and amount of acetone were next, and was solid-liquid ratio less important according to results of orthogonal experiment. The optimized conditions were confirmed according to polypeptide content. The conditions included ultrasonic power 400 w, solid to liquid ratio 1:1, extraction time 120 s, amount of acetone 1:3 (extracting liquid/ acetone). After that, CPIRF further prepared through dialysis/ ultrafiltration method was slightly yellow and transparent liquid. (2) Analysis of CPIRF composition: The folin-phenol method, phenol-sulfuric acid and ammonium vanadium coloration method were respectively used to determine peptides, polysaccharides and nucleic acid. Results showed that CPIRF contained 3.70.04 mg/ ml peptide, 3.30.07 g/ ml nucleic acid and 0.540.002 mg/ ml polysaccharide. (3) Assay of immune activity: Immune activity of CPIRF was evaluated through mouse spleen lymphocyte proliferation and Ea-rosette test. Mouse spleen lymphocyte was proliferated between 0.4 ngml and 4 gml. The growing rate was up to 95.33% when CPIRF was 40 ngml. Ea rosette test was concentration-dependent, 47% of Ea rosettes rate was the highest when CPIRF was 4 g/ml. Results showed that CPIRF had good functions of immune regulation and enhancing immune activity. (4) Evaluation of anti-tumor activity in vitro: Antitumor activity of CPIRF on cervical cancer Hela cells and colorectal cancer CX-1 cells in vitro was evaluated through MTT method. CPIRF significantly inhibited the growth of Hela cells and CX-1 cells when CPIRF was 4 ng/ ml, growth inhibition of CPIRF on Hela and CX-1 were respectively 72.4% and 50.3%, indicating that CPIRF had strong antitumor activity in vitro. In summary, CPIRF, possessing anti-tumor activity and immune activity, was prepared through the optimized conditions, which was simple and high efficient. CPIRF maintained the original bioactivity, which will help to research and develop high value-added functional food or medicine. It will help to solve the problems of crudely processing, primary and single products, which have great significance and will provide scientific data. It plays an important role in formation, development and expansion of deer industry. Key Words: cervine placenta, immune regulator factor, orthogonal experiment, prepared conditions, bioactivityVI目 录目 录引 言10.1 概述10.2 人胎盘10.3 动物胎盘40.4 鹿胎盘50.5 课题研究意义6第1章 CPIRF制备条件优化71.1 实验目的71.2 实验方案71.3 试验材料、试剂与仪器设备71.4 基本实验方法91.5 分析101.6 结果101.7 小结14第2章 CPIRF主要成分分析152.1 实验目的152.2 实验方案152.3 试验材料、试剂与仪器设备152.4 基本实验方法162.5 分析192.6 结果192.7 小结23第3章 CPIRF体外生物学活性分析243.1 实验目的243.2 实验方案243.3 试验材料、试剂与仪器设备243.4 基本实验方法263.5 分析303.6 结果303.7 小结34第4章 结论354.1 CPIRF制备条件优化354.2 CPIRF主要成分分析354.3 CPIRF体外生物学活性分析35致 谢36参考文献37附 录40攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况45图表目录图 表 目 录图目录图1- 1 正交试验直观分析12图1- 2 正交试验四因素效应曲线图12图1- 3 正交试验四因素分析图13图1- 4 CPIRF紫外特征峰检测13图2- 1 牛血清白蛋白标准曲线19图2- 2 葡萄糖标准曲线21图2- 3 总核酸磷标准曲线22图2- 4 无机磷核酸磷标准曲线22图3- 1 Ea 玫瑰花环对照图（左：阳性；右：阴性）30图3- 2 透析法CPIRF鼠脾淋巴细胞增殖率31图3- 3 超滤法CPIRF鼠脾淋巴细胞增殖率32图3- 4 超滤法与透析法鼠脾淋巴细胞增殖率比较32图3- 5 超滤法与透析法抑瘤率（Hela）比较图33图3- 6 超滤法与透析法抑瘤率（CX-1）比较图33表目录表1- 1 试验材料8表1- 2 试验所用试剂一览表8表1- 3 主要仪器设备8表1- 4 正交设计水平因素表10表1- 5 正交水平分布表10表1- 6 正交试验多肽含量（n=3，xs）11表1- 7 正交试验结果11表2- 1 牛血清白蛋白标准曲线制作17表2- 2 葡萄糖标准曲线制作17表2- 3 牛血清白蛋白分光光度值19表2- 4 鹿胎提取液多肽含量（n=3，xs）20表2- 5 透析法与超滤法CPIRF多肽含量（n=3，xs）20表2- 6 葡萄糖分光光度值20表2- 7 鹿胎提取液多糖含量（n=3，xs）21表2- 8 透析法与超滤法CPIRF多糖含量（n=3，xs）21表2- 9 鹿胎提取液核酸含量（n=3，xs）22表3- 1 细胞生物学常用试剂一览表25表3- 2 人淋巴细胞Ea玫瑰花环结环率31VII引 言引 言0.1 概述动物生化药物是生物药物中的一个重要组成部分，指以动物组织、器官为原料，提取某一种或数种有特定疗效的生物活性物质，可用于预防、治疗和诊断疾病。生化药物是生物体中的基本成分，主要含氨基酸、肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂类、核酸及其降解物。这一类生命基础物质制得的药物具有针对性强，毒副作用低，易为人体所吸收等特点，日渐受到各国医药界的关注。已在临床应用的生化药物有蛇毒抗栓酶、蛇毒凝血酶、水蛭素、蚓激酶、胸腺肽、转移因子、胎盘肽等，临床效果非常明显。从动物源筛选新的抗肿瘤、抗心脑血管药物成为当前研究热点，备受广泛关注。人胎盘早在唐朝就应用于传统中医，可作为滋补、养颜、强壮之药。现代生物学及医学证明，胎盘内含有多种免疫球蛋白、活性肽、激素、多糖等物质。其中，胎盘免疫调节因子（placental factor, PF），即胎盘肽，是从健康孕妇足月分娩的胎盘中分离提取的小分子多肽及核酸为主的混合物质。PF能提高机体的免疫功能，具有良好的免疫调节和免疫增强作用，能抑制肿瘤的生长和抗突变，促进淋巴细胞上绵阳红细胞受体恢复，促进T细胞增殖、分化和成熟并增强其活性。人胎盘已经应用于临床治疗，在肿瘤、消化系统疾病、泌尿系统疾病等多种慢性病、疑难病的治疗中都取得了较好的疗效。然而人胎盘来源短缺且由于伦理、法律等的限制，因此，现多以动物胎盘（牛胎、猪胎、羊胎、鹿胎）替代。初步研究表明，动物胎盘中同样含有免疫球蛋白、活性肽、激素等多种活性物质。羊胎盘免疫调节因子具有促进淋巴细胞增殖等免疫学活性。目前关于鹿胎盘免疫调剂因子的研究很少，本文主要针对鹿胎盘免疫调节因子的免疫学活性和抗肿瘤活性进行研究。0.2 人胎盘在胎生脊椎动物胚胎发育过程所形成的许多结构中，有些并不构成胚胎本体，而只是对胎体起保护和物质交换作用，分娩时即被丢弃，这些结构称作胎儿的附属结构，即通常所说的胎膜（fatal membranes）和胎盘1。胎盘作为妊娠期母体与胎儿进行物质交换的纽带，具有重要的生理功能2，如肠道的消化、吸收功能；肝的代谢分泌功能；骨髓造血功能；免疫功能等。人胎盘被称为紫河车最早见于唐代本草拾遗，包含两个方面意思，一是指胎盘颜色紫黑，连接胎儿和母体，古人认为它是连接先后天的枢纽；另一个方面是胎盘具有大补阴阳气血的功效，古人认为它能够起到返老还童，起死回生的作用3。现代中药学将炮制后的人胎盘（human placenta）称为紫河车，其味甘咸，性温，入肺、肝、肾三经，具有补气、养血、益精之功效。0.2.1 人胎盘成分胎盘可分泌多种激素、酶类，含有多种蛋白质、抗体、磷脂、生长因子、细胞因子及能刺激抗体免疫系统的小分子活性物质4。胎盘中的激素类主要有促性腺激素（HCG）、促肾上腺激素释放激素（GnRH）、促肾上腺皮质激素释放激素（GRH）、催乳素、多种黄体激素、红细胞生成素等。胎盘内的多肽类激素最简单的可由几个氨基酸残基组成，复杂的可由多个多肽链组成5。胎盘中含有溶菌酶、激肽酶、催产素酶等多种应用价值的酶。胎盘中包含胎盘免疫调节因子（HPIF）、胎盘免疫调节肽（PIP）、干扰素、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等多种细胞活性因子。其中胎盘免疫调节因子的研究首起我国，是从健康产妇的胎盘中提取的活性成分。目前研究表明它的活性成分主要是小分子多肽，有类似于转移因子的功能，但它有不同于转移因子，具有一些转移因子不具有的生物活性。李莹等研究表明，人胎盘中含有16 种氨基酸，且含量比较稳定，游离氨基酸含量很少，表明胎盘提取液中氨基酸主要以多肽形式存在6。正常分娩胎盘中含多种重要化学元素和微量元素微生物B12、乙酰胆碱等，含有钙、铁、镁、锌、硒等。0.2.2 人胎盘应用0.2.2.1 生物学功能胎盘在免疫学上有增强抵抗力和免疫力的作用，HPIF对小鼠外周血白细胞有明显升高作用。胎盘提取液可以改善鼠脑功能7，具有活性成分含量高，功效活性因子活性强等优点8。研究表明，HPIF对由AHP引起的小鼠脾重指数下降有明显的保护作用，并使其基本恢复正常；且可使处于抑制状态小鼠的游泳能力恢复正常，并能明显延长正常小鼠的游泳时间，提高小鼠耐力。曹艳花等用东莨菪碱和亚硝酸钠构建小鼠记忆障碍模型，观察紫河车的疗效作用，并与猪、牛、羊胎盘比较9。结果表明，紫河车能够改善小鼠记忆，且猪、牛、羊胎盘同紫河车比较无显著性差异，表明在改善记忆方面可以初步考虑用动物胎盘作紫河车的代用品。紫河车提取物中有促进肝细胞生长物质，为治疗肝坏死寻找出有效物质10。0.2.2.2 临床应用Chinmoy Sarkar等研究表明，人胎盘肽或蛋白可以增强酪氨酸酶基因表达，作为黑色素合成的诱导物11，进而治疗白癜风。无论在动物实验或临床实验上都已证实，胎盘对抗衰老组织有明显的复活作用，在临床上对受创的组织及溃疡的治疗也有明显的效果。庄建宣用紫河车治疗顽固性溃疡，临床资料表明，紫河车治疗顽固性溃疡效果显著12。蒋文凤等对35例卵巢早衰继发性闭经患者采用人工周期疗法配合口服紫河车胶囊治疗，发现紫河车可能通过自身调节作用或协同调节作用参与了卵巢早衰继发性闭经患者的卵泡复苏过程，其优势作用可能改善卵巢早衰继发性闭经患者治疗的依从性13。应用“紫河车”胶囊治疗先兆流产78例，收到良好效果14。临床观察显示，紫河车干预治疗肝硬化代偿期患者，能显著促进肝功能恢复，在降低转氨酶、纠正低蛋白血症、消退黄疸、提高凝血酶原活动度、缓解症状方面有显著疗效，有利于降低病死率，且在治疗过程中，未见低热、过敏、皮疹等其他不良反应，副作用少，有较好的临床应用价值15。肖何等研究结果表明，服用复方紫河车会使体质量增加，尤其是瘦体质量增加明显，因而使体成分构成更趋合理、体型更健美，同时也会提高身体机能与运动水平16。袁梦石等研究表明，紫河车蜜丸治疗老年期痴呆患者有效，并能降低患者脑脊液淀粉样蛋白含量17。除了上述临床应用外，人胎盘还应用于恶性肿瘤的治疗。赵丽娟等研究表明，在化疗中辅以胎盘提取物，不仅可以增强机体抵抗毒性反应的能力，且能够促进组织的修复18。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells, CIK）是一类非MHC和非T细胞受体限制性免疫活性细胞，其主要表现型为CD3+，CD56+，在培养过程中，多种细胞因子的刺激，均可激活CIK细胞发挥细胞毒作用。CIK细胞具有增殖快、杀瘤活性高及杀瘤谱广等特点。蒙怡等研究表明，CIK细胞的增殖与胎盘免疫调节因子的浓度具有依赖关系，加胎盘免疫因子的各组CIK细胞杀伤率均高于不加胎盘免疫调节因子的对照组19。肿瘤血管生长因子（TAF）是由肿瘤细胞或宿主分泌的活性物质，促进血管形成，对实体瘤的发生、发展及远期转移起着至关重要的作用。肖伟等研究结果表明，人胎盘肿瘤抑制因子具有阻断血管生成的作用，可能与其抑制内皮细胞增殖或促进其凋亡有关20。0.2.3 人胎盘免疫调节因子胎盘免疫调节因子（placenta factor，PF），亦称胎盘肽或胎盘调节因子为无色或微黄色透明液体，pH 6.8，具有可透析性和超滤性，蛋白质反应阴性21。胎盘免疫调节因子的制备方法大体有两种：一是匀浆-透析法；二是超滤法。透析法和超滤法都属于生化制药工艺中的膜分离技术，膜分离的原理主要是利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等差别对各种膜技术表现出来不同的可透性而达到分离目的22。姜训等研究结果表明，胎盘免疫调节因子可使处于免疫抑制状态的实验小鼠体重、脾重指数、中性白细胞数、T及B淋巴细胞转化刺激指数等所想指标获得不同程度的恢复，其中脾重指数及中性白细胞数恢复至正常水平，对体重、T及B淋巴细胞转化刺激指数也有明显恢复作用23。张学荣等研究表明，胎盘免疫调节因子无急性毒性作用及过敏反应，同时能够升高大鼠白细胞水平，且临床结果表明胎盘免疫调节因子对鼻咽癌、结核及慢性乙肝患者的免疫功能有提高作用，有效率分别是87%、81.9%、74%24。进一步研究表明，胎盘免疫调节因子能引起细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构的变化及表型发生变化，这些变化可能引起细胞因子诱导的杀伤细胞活性的上调25。随着现代生物医学对人胎盘和脐带血需求量剧增，利用紫河车的伦理问题更加尖锐，精华与糟粕共存的紫河车文化面临严峻挑战26。同时，世界医学基本规则禁止任何人体的器官、组织等入药。因此以动物胎盘（牛胎、猪胎、羊胎、鹿胎）替代人胎盘，成为目前研究的热点。0.3 动物胎盘现代生物学及医学研究证明，动物和人类胎盘的结构虽然不同27，但胎盘中均含有多种免疫球蛋白、活性肽、激素等生物活性物质及氨基酸、矿物质等成分28，是一种较为理想的免疫调节剂和营养美容保健品29。0.3.1 牛、猪、羊胎盘李鲁龙等对牛胎盘营养成分分析结果表明，牛胎盘粉中含有的必须氨基酸含量是奶粉的3倍，牛胎盘具有较高的生物效应，是一种无毒安全、无副作用的营养品，还是一种高蛋白、高营养的保健品30。生庆海等研究表明，牛胎盘提取物能够促进成纤维细胞的增殖活性31，成纤维细胞在皮肤衰老过程中起着重要的作用。房新平等研究表明，从牛胎盘提取液中分离出具有免疫调节活性的多肽32，能够促进鼠脾淋巴细胞增殖33。周国华等利用超滤法从羊和猪胎盘中提取出了胎盘肽，研究表明，胎盘肽能够增强兔外周血T淋巴细胞转化34。吴开平等通过匀浆、冻融、超滤等步骤从羊胎盘中制备羊胎盘提取液，进一步凝胶过滤得到羊胎盘免疫调节活性因子（SPIF-I），体外生物学活性试验证明SPIF-I能显著影响小鼠脾淋巴细胞增殖分裂35。高利臣等研究表明，不同剂量GPIF对提高小鼠血清溶菌酶含量，提升小鼠胸腺和脾指数均有影响，其中低剂量组对小鼠血清溶菌酶含量，提高小鼠胸腺和脾指数影响最显著36。0.3.2 动物胎盘应用早在1998年，国内外就相继出现了以动物胎盘水解液和胎盘浸提液两种新型化妆品添加剂，因其独特的功效，已引起人们的关注，其中羊胎素被称为“美容珍品”。由于羊胎盘营养液含有丰富的氨基酸、多肽，以及多种促进、改善组织新陈代谢的酶类，故它能改善皮肤组织的中间代谢，促进皮肤的营养供给和废物排泄37。宁鹏等研究表明，牦牛胎盘可以通过增强某些组织中T-SOD的活性，降低MAD的含量，从而起到抗氧化的作用38。以羊胎盘营养液作为添加剂的化妆品已经在护肤方面获得了满意的效果，能增加皮肤营养、加速细胞分裂、促进细胞代谢、加强血液循环、增进皮肤的柔润，以防止皮肤粗糙或产生小皱纹、黑色素、雀斑等39。0.3.2 动物胎盘免疫调节因子近年来，由于人胎盘来源短缺及法律、道德方面的限制，人们对动物胎盘的研究越来越多，期望通过动物胎盘替代人胎盘。以羊胎盘为原料制备羊胎盘免疫调节因子，研究结果表明，羊胎盘免疫调节因子（SPIF-）能显著促进小鼠脾淋巴细胞分离增殖，具有明显的剂量-效应依赖关系，在低浓度时促进淋巴细胞成熟，当剂量过高反而具有抑制作用30。方廖琼等研究表明，腹腔注射羊胎盘免疫调节因子，对免疫小鼠分泌抗体能力具有显著改善，并具有剂量效应；直接作用于脾淋巴细胞，可显著促进LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，显著提高脾B淋巴细胞产生抗体的能力40。通过E花环活性试验证明，羊胎盘免疫调节因子（GPIF）对增强T细胞活性具有剂量效应41。0.4 鹿胎盘鹿胎系指母鹿腹中的带胎衣、胎水的胎鹿, 或体表无毛、空腹、体内各器官已经发育完整，但是由于机械等原因造成流产的胎鹿或产后因缺乳、母鹿拒哺、恶癖等原因死亡的幼鹿。鹿胎在中医学上有“益肾壮阳，补虚生精”，用于肾虚精亏、体弱无力、精血不足、妇女月经不调、崩漏带下、久不受孕等症，保健治疗效果明显。现代研究表明, 鹿胎盘含有蛋白质（免疫球蛋白、尿激酶、溶菌酶）、多肽（如鹿胎免疫调节因子等多种因子）、促性腺激素、催乳素、多糖、多种矿物元素、氨基酸和维生素等。0.4.1 鹿胎盘成分杨桂芹等对鹿胎制剂号、鹿胎制号、鹿胎纯粉、鹿胎衣纯粉4种鹿胎及胎盘制剂和人胎盘粉的微量元素和氨基酸含量进行了检测和分析，结果表明，鹿胎制剂Fe、Cu、Zn含量和鹿胎制剂号及鹿胎制剂号Mn含量均高于羊胎盘活细胞素42；从鹿胎制剂中检测出18种常见氨基酸，其中8种人体必需氨基酸，并且鹿胎盘的氨基酸成分及必需氨基酸含量与人胎盘相似。刘朋等从梅花鹿胎衣中测定营养成分蛋白质含量77%，脂肪含量7.8%，糖含量3.4%，氨基酸分析表明含有15中氨基酸，7种人体必需氨基酸43。0.4.2 鹿胎盘应用梅花鹿胎盘具有提高人体代谢运动能力，改善机体某些生活指标及可能延长动物寿命等作用。梅花鹿胎盘提取液对D2半乳糖诱导衰老所致胰岛素分泌量的减少有改善作用44。鹿胎盘脂质可显著抑制小鼠脑和肝脏中单氨氧化酶-B (MAO-B) 的活性，提高脑和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD) 的活性；降低小鼠心肌组织脂褐素的含量；明显提高小鼠皮肤和尾腱中羟脯氨酸(HYP)的含量45。鹿胎盘脂质对老年小鼠上述生化指标的影响较青年小鼠更明显，提示鹿胎盘脂质对老年小鼠具有抗衰老作用。通过试验观察鹿胎提取物对雌性大鼠子宫平滑肌得调节作用，旨在探讨鹿胎提取物药理成分的调节机制46。研究表明，鹿胎及胎盘制剂对老年雄性大鼠免疫器官发育有一定的促进作用，虽没有达到显著水平，但可显著提高血清球蛋白质量，说明胎盘制剂对老年雄性大鼠的体液免疫功能具有一定的促进作用47。鹿胎盘多肽具有清除OH、O2-和H2O2的能力，随着多肽浓度的增大，抗氧化能力进一步增强，鹿胎盘多肽对油脂有一定的抗氧化作用48。孙德珍等研究表明，鹿胎口服液可明显增强小鼠脑、肝和肾SOD活性，降低MDA含量，对小鼠肝CAT和GSHpx活性具有明显的增强作用49。0.5 课题研究意义目前，国内外对于鹿胎盘的现代生物学、药学等领域的研究还处于初级阶段，远远不及对于羊胎、牛胎、猪胎等的研究深入。尽管我国应用鹿胎的历史很悠久，但应用非常原始，鹿胎产品加工粗糙、产品初级、种类单一，没有形成产品的多元化态势，且在根据经验生产鹿胎产品时，鹿胎特有的活性成分被严重破坏，造成极大的浪费。针对这些问题，本研究以梅花鹿胎盘作为原料，采用低温均质匀浆、高速离心、透析、超滤等生物工程技术，得到具有生物活性的鹿胎免疫调节因子。本研究有利于开发高附加值功能食品和药品。这为解决当前鹿产品生产中存在的加工粗糙、产品初级、种类单一等问题，提供了科学依据。47第1章 CPIRF制备条件优化第1章 CPIRF制备条件优化1.1 实验目的以梅花鹿胎盘作为原料，采用低温均质匀浆、冻融、高速离心得到鹿胎提取液。CPIRF的制备方法大体有两种：一是匀浆-透析法；二是超滤法。透析法和超滤法都属于生化制药工艺中的膜分离技术，膜分离的原理主要是利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等差别对各种膜技术表现出来不同的可透性而达到分离目的。通过正交试验确定CPIRF最佳提取条件。1.2 实验方案本章选取在鹿胎提取过程中，影响较显著的4个因素设计L9（34）正交试验。以超声功率、固液比、超声时间、丙酮量为四个因素，选取三个水平做正交试验。鹿胎免疫调节因子以多肽为主，因此，鹿胎提取液的多肽含量作为正交试验结果的评价标准。试验得到的梅花鹿胎盘提取液通过超滤和透析两种方法，分别获得截留分子量为10 kDa和8 kDa CPIRF。超滤法是一种膜分离过程原理，超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质,而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。通过膜表面的微孔筛选可截留分子量为10 kDa的物质。透析法是指溶质从半透膜的一侧透过膜至另一侧的过程，任何天然的（如腹膜）或人造的半透膜，只要该膜含有使一定大小的溶质通过的孔径，那么这些溶质就可以通过弥散和对流从膜的一侧移动到膜的另一侧。其基本原理是弥散和对流。透析袋截留分子量为8 kDa。研究表明，胎盘免疫调节因子具有可透析性和可超滤性。本实验室具有超滤设备和透析袋，具有试验可行性。1.3 试验材料、试剂与仪器设备1.3.1 试验材料表1- 1 试验材料材料来源新鲜梅花鹿胎盘铁岭天宏药业有限公司昆明种小鼠沈阳医学院人宫颈癌Hela细胞株中国医科大学人大肠癌CX-1细胞株中国医科大学1.3.2 试验所用试剂表1- 2 试验所用试剂一览表药品名称生产厂家氯化钠天津市博迪化工有限公司，分析纯无水乙醇天津市百世化工有限公司，分析纯氯化钾广东汕头市西陇化工厂，分析纯氢氧化钠沈阳医药公司化玻璃试剂分装厂，分析纯磷酸二氢钾沈阳试剂一厂，分析纯磷酸氢二钾沈阳试剂一厂，分析纯酒石酸钾钠沈阳试剂一厂，分析纯硫酸铜国药集团化学试剂有限公司，分析纯无水碳酸钙上海虹光化工厂，分析纯丙酮天津富宇精细化工有限公司5-氟尿嘧啶生工生物工程（上海）有限公司，USPD-葡萄糖BODI葡萄糖天津市博迪化工有限公司，分析纯卡那霉素BBI原装1.3.3 试验仪器设备表1- 3 主要仪器设备仪器名称生产公司赛多利斯电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司胶体磨50AB沈阳航天新兴超微粉碎机械有限公司恒温水浴锅上海雅荣生化设备仪器有限公司RE-52CS-2旋转蒸发器上海雅荣生化设备仪器有限公司SHZ-D（III）循环水式真空泵巩义市予华仪器有限公司高压灭菌锅上海宜川仪表厂D100B数显定时蠕动泵上海青浦沪西仪器厂Specerumlob721N可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司Siemens电冰箱博西华家用电器有限公司Sartorius普及型PH计北京赛多利斯仪器系统有限公司超声波仪Cole Parmer Instrument公司漩涡混和器IKADL-6M大容量冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司SW-CJ-2FD洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司高速冷冻离心机美国科峻仪器公司BB15CO2培养箱Heraeus公司超滤器Milipore, taiwanMultiskan MK3酶标仪Thermo LabsystemsLXJ-64-01型离心机北京医疗仪器修理厂OLYMPUS CKX41倒置显微镜北京索鸿电子有限公司1.4 基本实验方法1.4.1 具体试验方法1）取冷冻的新鲜鹿胎盘，融化，去除羊水及其他杂质，清水洗净，除去表面膜组织。将处理好的胎盘切碎，匀浆4-5次，然后冻融3-4次。2）取冻融液，按照正交试验优化提取条件，进行超声破碎后，离心12000 r/min，10 min、4oC，收取上清，残渣回收。3）超滤：对超滤板用0.2% NaOH和0.9% NaCl进行前处理，然后上样品，回收超滤后提取液。超滤后需要清洗模板和仪器，做好仪器日常保养。4）透析：在4oC环境下透析，每6 h更换一次透析外液，收集外液低温旋转蒸发后，测定多肽含量。1.4.2 鹿胎盘提取液多肽含量测定 按照图2-1中的牛血清白蛋白标准曲线，计算出鹿胎盘提取液多肽含量。多肽含量结果见表1-6。1.4.3 正交设计优化提取条件表1- 4 正交设计水平因素表序号A超声功率（w）B固液比（W:V）C超声时间（s）D丙酮（V:V）12001:1601:223001:2901:334001:31201:4表1- 5 正交水平分布表序号ABCD1111121222313334212352231623127313283213933211.4.4 鹿胎免疫调节因子紫外特征峰检测 以双蒸水为空白对照，于200 nm-500 nm范围进行紫外图谱扫描，测定鹿胎免疫调节因子最大吸收峰值。1.5 分析应用SPSS17.0软件分析数据标准差，若P0.05，表明结果不存在显著性差异；若P0.05，表明结果存在显著性差异；P丙酮 超声时间固液比。正交试验四因素中，超声功率是主要因素。表1- 6 正交试验多肽含量（n=3，xs）序号平均OD值鹿胎盘提取液多肽含量(mg/ml)10.11419.071.0120.10526.253.0730.08226.392.1040.13222.411.3650.09022.151.3760.07222.870.9670.17630.351.0180.11127.883.2590.08126.022.63表1- 7 正交试验结果序号超声功率（w）固液比（W:V）超声时间（s）丙酮（V:V）提取液多肽含量（mg/ml）12001:1601:219.0722001:2901:326.2532001:31201:426.3943001:1901:422.4153001:21201:222.1563001:3601:322.8774001:11201:330.3584001:2601:427.8894001:3901:226.021.6.2 软件分析正交试验用正交设计助手v3.1(共享版)软件分析正交试验结果。直观分析结果见图1-1，四因素效应曲线图见图1-2。提取液多肽含量图1- 1 正交试验直观分析图1- 2 正交试验四因素效应曲线图图1- 3 正交试验四因素分析图 以四因素多肽含量的均值 (R1, R2, R3) 为纵坐标，四因素为横坐标做图，结果见图1-3。结果表明，超声功率为400 w时，多肽含量最高（均值R3）；固液比1:2时多肽含量最高；随着超声提取时间的增长，多肽含量增加，提取时间为120 s时，多肽含量最高；丙酮含量表明，提取液:丙酮比值为1:3时，效果最好。根据单因素分析最佳组合为超声功率400 w、固液比1:2、提取时间120 s、提取液:丙酮比值为1:3。正交试验最佳条件为超声功率400 w、固液比1:1、超声时间120 s、丙酮量1:3（提取液:丙酮）。实验结果与理论组合相比，四因素中固液比不同。由于四因素中固液比影响最小，且固液比三组数据间无显著性差异，因此固液比选择1:1。正交试验确定的最佳提取条件为超声功率400 w、固液比1:1、超声时间120 s、丙酮量1:3。1.6.3 紫外特征峰检测图1- 4 CPIRF紫外特征峰检测 所制备的鹿胎免疫调节因子紫外吸收峰集中在200-300之间，其最大吸收峰216.4 nm（图1-4）。1.7 小结研究表明，胎盘免疫调节因子或胎盘因子、胎盘免疫调节肽或胎盘肽，是通过透析或超滤从胎盘中提取的具有免疫功能的活性成分。人胎盘紫外吸收峰260 nm50或254-258 nm51或250-260 nm52。周国华制备的牛、羊和猪胎盘肽的紫外最高吸收峰分别为210.5 nm、225.4 nm和209.6 nm53。胎盘不同，紫外吸收峰不同，从整体范围上看均为200-260 nm。本章用超声功率、固液比、超声时间、丙酮量为四因素设计正交试验。其中超声功率影响最大，丙酮量和超声时间其次，固液比影响最小。以鹿胎盘提取液多肽含量为指标，确定最优化制备条件为：超声功率400w、固液比1:1、超声时间120 s、丙酮量1:3（提取液:丙酮）。之后利用透析（或超滤）方法制备得到微黄色透明液体的CPIRF。紫外扫描表明，CPIRF紫外最高吸收峰为216.4 nm，与报道的动物胎盘紫外吸收峰比较接近。通过本章研究，明确CPIRF的制备条件，并成功获得了CPIRF。第2章 CPIRF主要成分