解淀粉芽孢杆菌JY-1产细菌素发酵条件研究——毕业论文

湖 南 农 业 大 学全日制普通本科生毕业论文解淀粉芽孢杆菌JY-1产细菌素发酵条件研究OPTIMIZATION OF FERMENTATION CONDITIONS FOR PRODUCTION OF BACTERIOCIN BY BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS JY-1学生姓名：学号：年级专业及班级： 食质 指导老师及职称： 学院：食品科学技术学院湖南长沙提交日期： 年 月14目 录1 前言42材料与方法72.1试验材料72.1.1 菌种72.1.2器具72.1.3培养基72.1.4仪器与设备72.2试验方法82.2.1 菌种的活化82.2.2 抑菌方法82.2.3 外源碳源对细菌素产量的影响82.2.4外源氮源对细菌素产量的影响82.2.5培养温度对细菌素产量的影响92.2.6 转速对细菌素产量的影响92.2.7发酵工艺的正交化设计92.2.8数据分析93 结果和分析103.1外源碳源对细菌素产量的影响103.2外源氮源对细菌素产量的影响103.3培养基培养温度对细菌素产量的影响103.4转速对细菌素产量的影响113.5正交实验结果113.6方差分析确定最佳实验结果124 结论15参考文献16致谢19解淀粉芽孢杆菌JY-1产细菌素发酵条件研究摘要：本研究以单增李斯特细菌54002作为指示菌。采用杯碟法作为抑菌试验方法，对解淀粉芽孢杆菌JY-1所产细菌素的发酵条件进行了优化。由正交试验设计得出产细菌素最佳条件为：0.5%含量的牛肉膏，1%含量的可溶性淀粉，在33，转速250r/min下培养22 h。在该发酵条件下，检测出来的细菌素的抑菌圈大小为11.1mm。 关键词:细菌素；发酵条件优化；正交设计Optimization of Fermentation Conditions for Production of Bacteriocin by Bacillus amyloliquefaciens JY-1Abstract:By using Listeria monocytogenes54002 as the indicator bacteria, the bacterial inhibition zone diameter was considered as an indicator, and the fermentation conditions ofbacteriocin produced by B. amyloliquefaciensJY-1 were optimized. The experiment was designed by orthogonal design method, and the best experimental group was 4 groups: 0.5% beef extract, 1% soluble starch, 33 , 250r/min. Under this condition, the inhibition zone size was 11.1mm. Key words: bacteriocin;optimization of fermentation condition;orthogonal design.1.前言细菌素是一种细菌在代谢过程中通过核糖体的作用合成的一种具有抑制亲缘性菌种活性作用的多肽或前体多肽类物质，对相对近缘性菌种呈现较窄的抑菌谱1该物质能抑制靶细胞中肽聚糖的生物合成，抑制与核糖体结合的蛋白质合成，或直接降解靶细胞DNA，实现其抑菌作用2。部分研究表明，分子基团的相互作用使细菌素和细胞的相互作用更容易进行，从而提高细菌素的抑菌效果3该机制成功地阐明了Nisin和美沙西汀的作用机理4。现代细菌素是可以用于肉类工业、奶制品加工业、酿酒与粮食加工等领域等的抑制菌种的生物制品5。可用于防治肉类等食品中有害菌群的生长，也可用于其他各类食品加工工业的生物菌种防治6。现代细菌素的运用还不是非常广泛硝酸盐被广泛应用于肉制品中，以防止梭菌的存在，使食物容易变质，但对人体健康非常有害，甚至危及生命。而细菌素则拥有高效，安全等特点，急需我们去运用7。最新的细菌素在食品中的应用是乳链菌肽，在美国，已经被法律列为可使用的食品添加剂8。而解淀粉芽孢杆菌是现代实验和科研检测用的较为成熟的一种实验菌种，故在生产发酵细菌素的研究中，可通过各项因素（碳源、氮源、生长因子、温度、水分、ph等）的各项改变产生的细菌素产量的不同，运用正交设计法来研究最为高产的生长条件，来起到提高细菌素产量的目的。抗菌肽是昆虫体内产生的一种抗菌碱性多肽9。该肽的分子量k可以大致约为30008000，由3070个氨基酸残基组成。这些活性肽大多具有较强的碱性、热稳定性和广谱抗菌性能。世界上第一个被发现的抗菌肽的是1980年由瑞典科学家G.BoMand等已注入大肠杆菌和大肠杆菌诱导产生抗菌肽PuPui蛹，称为抗菌肽。细菌中有4种:Bacitracin、S（短杆菌肽S）、多粘菌素E（多粘菌素E）和乳酸杆菌（NISIN）。它是一种耐酸物质，即使在低pH环境下，如胃，它可以抑制革兰氏阳性细菌，如梭形芽孢杆菌和李斯特菌。抗菌肽的产率和活性受温度、培养基组成等环境条件的影响很大。因此，发酵条件的研究是非常重要的 10 。正交试验设计（正交试验设计）是一种研究多因素、多层次的试验设计方法。基于正交性，从综合测试中选取一些有代表性的点。这些代表点具有“均匀分散和均匀比”的特点。日本著名统计学家Taguchi Xuanichi列出了通过正交实验选择的水平组合，称为正交阵列。例如，需要三个因素和三个水平的实验。根据综合实验的要求，应进行3327组合，各组合的重复尚未考虑。根据L9（34）正交表，需要9个实验，并根据L18（35）正交表进行18个实验，这明显地减少了工作量。因此，正交试验设计在许多领域得到了广泛的应用。L是正交表中的代码，n是测试次数，t是水平，C是列的数目，即可以安排的因素的数量。例如，L9（34）表明需要9个实验，最多可以观察到4个因素。每个因素是3水平。正交表中每个列的水平数也不相等。我们称之为混合正交表，如L8（42）。在该表的5列中，1列为4列，4列为2级11。芽孢杆菌（Bacillus spp.）生长迅速、营养要求简单、抗逆性强（芽孢拥有非常强的抗逆性，可耐高温，高压，高渗透压等），可以生产多肽抗生素，并且可以产生具有细菌作用的酶。利用芽孢杆菌及其代谢产物是防治真菌病害最安全、有效、最有前途的天然生物制剂。解淀粉芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌属中枯草芽孢杆菌种中的解淀粉枯草芽孢杆菌亚种，也是我们现代实验室中常用于研究的菌种，属于格兰氏阳性杆菌。它作为一个用于研究的菌种，具有易培养，生产量大，实验效果明显的特点。在实验室初期，对真菌的种类进行分离鉴定，筛选出对霉菌生长和孢子萌发有较强抑制作用的孢子菌株。与传统的化学防腐剂相比，它们所分泌的抗菌物质在抑制霉菌生长方面更有效。2.材料与方法2.1 材料2.1.1 菌种 解淀粉芽孢杆菌JY-1及指示菌单增李斯特菌54002，本实验室保存。2.1.2器具 黄浆水（购自湖南农业大学滨湖农贸市场），培养皿，烧杯，接种针，酒精灯，试管，牛津杯，1.5mL离心管，移液枪，塑料瓶（均由湖南农业大学食品科技学院实验室提供）2.1.3 培养基可溶性淀粉、牛肉膏、琼脂（NA）培养基：购自北京陆桥技术有限责任公司。营养肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司2.1.4 仪器与设备表1 仪器与设备Table 1 Instruments and equipment仪器型号生产厂家单人单面净化工作台SW-CJ-1FD型苏州净化设备有限公司电子天平YP-B5902型上海光正医疗仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器LMQJ型山东新华医疗器械股份有限公司生化培养箱GZ-400-S型韶关市广智科技设备有限公司恒温培养振荡器ZHWY-C2102上海智城分析仪器制造有限公司电热鼓风干燥箱DHG-9246A型上海精宏实验设备有限公司冰箱BCD-215KALM型青岛海尔股份有限公司电热恒温水浴锅DK-98-A型天津市泰斯特仪器有限公司高速离心机Avanti J-26XP型美国贝克曼库尔特公司2.2方法2.2.1菌种的活化将解淀粉芽孢杆菌JY-1（B.amyloliquefaciens JY-1）菌种接入无菌营养肉汤培养基中，37恒温培养24h。2.2.2 抑菌试验方法取活化后的单增李斯特菌菌液0.1mL与100mL融化后的并保持在50后左右的琼脂培养基进行混合，然后倒平板，待培养基凝固后放置无菌牛津杯，在牛津杯中加入0.2 mL JY-1的发酵上清液，然后在4冰箱中扩散4 h以上。取出平板后于37培养12 h，之后观察抑菌圈大小，测量抑菌圈大小，并做记录。2.2.3外源碳源对产细菌素的影响以黄浆水代替培养基中的水，分别加入终浓度为2%的碳源（碳源种类：葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖），以不加碳源的黄浆水培养基作为对照。以3%接种量接种活化后的芽孢杆菌JY-1，在150 rpm转速下，37培养22 h。将培养后的菌液6000 r/min离心3 min，取上清液进行抑菌试验，测定抑菌圈直径。2.2.4外源氮源对产细菌素的影响以黄浆水代替培养基中的水，分别加入终浓度为0.5%的氮源（氮源种类：牛肉膏、蛋白胨、氯化铵、酵母膏），以不加氮源的黄降水培养基作为对照。以3%接种量接种活化后的芽孢杆菌JY-1，在150 r/min转速下，37培养22 h。将培养后的菌液6000 r/min离心3 min，取上清进行抑菌试验，测定抑菌圈直径大小。2.2.5 培养温度对产细菌素的影响将灭菌后的黄浆水按照以3%接种量接种活化后的芽孢杆菌JY-1，然后在不同的温度（28、33、38）下150 rpm培养22h（恒温培养振荡器中），取培养液进行离心（6000r/min下3min）。取菌液的上清液进行抑菌试验，测定抑菌圈大小。2.2.6 转速对产细菌素的影响将灭菌后的黄浆水按照3%接种量接种活化后的芽孢杆菌JY-1，然后在37，不同的转速r/min（170、210、250）下培养22 h，取将培养液进行离心（6000r/min下3min）。取菌液的上清液进行抑菌试验，测定抑菌圈大小。2.2.7 正交试验优化发酵工艺的正交优化设计采用4个关键因子：牛肉膏（x1，3水平）、可溶性淀粉（x2，3水平）、温度（x3，3水平）、转速（x4，3水平）进行混合正交设计，见表2。表2 设计因素及水平表Table 2 Factors and levels in Box-Behnken central composite designA牛肉膏%B可溶性淀粉%C温度（）D转速r/min10.112817020.523321030.93382502.2.8数据分析 采用SPSS 17进行数据分析，并将处理好的结果进行整理并分析。3.结果和分析3.1 外源碳源对产细菌素的影响 在黄浆水中加入2%不同种类的碳源，培养JY-1后，其发酵液的抑菌圈大小见图1。图1 外源添加不同碳源抑菌圈直径大小Fig.1 The diameter of different carbon source inhibition zone was added. 从图1中可以看出，添加一定浓度的碳源，均能促进细菌素的产生。其中添加可溶性淀粉培养时，JY-1的细菌素产量最高，故选用可溶性淀粉作为最佳碳源。3.2 外源氮源对产细菌素的影响 在黄浆水中加入2%不同种类的氮源，培养JY-1后，其发酵液的抑菌圈大小见图2。图2 外源添加不同碳源抑菌圈直径大小Fig.2 The diameter of different carbon source inhibition zone was added.从图2中可以看出，添加不同种类的氮源，均能促进细菌素的产生。其中添加牛肉膏进行解淀粉芽孢杆菌的培养，细菌素的产量最高，故选用牛肉膏作为最佳氮源。3.3培养温度对产细菌素的影响 将JY-1接种于黄浆水中，于不同温度下培养，抑菌圈大小见图3。图3 不同温度下抑菌圈直径大小Fig. 3 The diameter of the antibacterial ring at different temperatures.从图3中可以看出，温度对细菌素产量有较显著的影响，在33下细菌素产量最高。3.4培养转速对产细菌素的影响 将JY-1接种于黄浆水中，在不同转速下进行培养，其培养液的抑菌圈直径大小见图4。图4 不同转速抑菌圈直径大小Fig. 4 the diameter of the antibacterial ring at different speed.从图4中可以看出，温度对细菌素产量有较显著的影响，在210r/min下产量最高。3.5 正交试验结果本试验以提高细菌素产量为目标，以确定最适宜的反应条件为目的。影响本反应产量的因素有氮源含量、碳源含量、转速和温度等。将本试验范围分别定为：牛肉膏（x1，3水平）、可溶性淀粉（x2，3水平）、温度（x3，3水平）、转速（x4，3水平）进行正交设计。各因子的取值范围分别为：0.1%x10.9%、1%x23%、28x338、170 r/minx4250 r/min再从每一试验范围选取3个水平，即可设计成4因子3水平实验方案，见表1。取反应进行到22h时的样品分析，其实验结果见表2。表3 L9 ( 34 )正交实验结果表Tab. 3 The Orthogonal Test Results with L9 ( 34 )编号ABCDX 31234mm111118.99.18.726.7212229.19.39.527.9313339.09.29.127.34212311.11111.333.45223110.310.110.230.6623129.29.61028.8731329.59.19.327.9832139.99.29.528.69332110.110.510.230.8K127.00029.49927.99929.301T=262.0K230.60029.30130.30027.828K329.49928.29928.80030.000k19.0009.8339.3339.767k210.2009.76710.1009.267k39.8339.4339.60010.000R1.2000.4000.7670.733最佳组2123由k值可知最佳方案为A2B1C2D3。3.6方差分析确定最佳反应条件而后对实验结果进行方差分析。正交表中每一列方差值Sj已在表2中列出,根据Sj的大小，各因子对细菌素产量影响因素排序是牛肉膏含量影响最大，可溶性淀粉含量影响最低，转速和培养温度这2个因子对细菌素产量的影响不差上下。根据F检验判断各因子影响的显著性，计算结果见表3。表4抑菌圈大小方差分析结果Tab. 4Variance Analysis of Inhibition zone size源III 型平方和自由度df均方FSig.校正模型11.950a81.49427.4350.000截距2542.37012542.37046696.5990.000A牛肉膏6.60123.30060.6190.000B可溶性淀粉0.39620.1983.6350.047C温度3.70821.85434.0520.000D转速1.32520.66312.1700.000误差0.980180.054总计2555.30027校正的总计12.93026a.R方 = .924（调整R方 = .891）由表3可知FA、FB、FC、FD都远远大于F( 2，18)，故A、B、C、D等因子均为高度显著的。这主要是因为解淀粉芽孢杆菌的生长繁殖及产细菌素需要合适浓度及调配均匀的氮源，碳源。一定的温度保证了反应体系的能量和微生物自身催化剂的活性并可提供反应的场所；而转速的快慢表示气-液二相接触程度,强化传质可以加快反应的宏观速度。4.结论通过该实验我们运用了正交设计优化的办法优化出了最好的细菌素发酵优化条件，即0.5%的牛肉膏含量，1%的可溶性淀粉含量，33的发酵温度以及250r/min的转速。在这个发酵条件下，由细菌产的细菌素含量最大，抑菌圈大小达到11.1mm。参考文献1徐顾榕等. 响应面法优化蜡样芽孢杆菌产类细菌素培养基J食品工业科技,2016, 19（3）:212-2172 安俊莹，刘颖，叶莉珍等响应面法优化Bacillus amyloliquefaciens产类细菌素发酵培养基J食品工业科技,2014, 1(8):191-1953岳喜庆,朱光泽,闵钟熳.响应面法优化鼠李糖乳杆菌HC9产细菌素发酵条件的研究J.中国乳品工业,2008, 36(12):4-74Virginia S O，Aida A P，Maria E. 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