毕业论文——香水百合黄酮三种萃取液的抑菌活性研究

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文（设 计）题 目： 香水百合黄酮三种萃取液的抑菌活性研究 学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 学 号： 专 业： 食品质量与安全 班 级： 食安 指导教师： 职 称： 年 月目 录摘要1ABSTRACT2引言31 试验仪器与材料41.1 供试菌种41.2 主要试剂41.3 主要仪器42 试验方法42.1 培养基的制作42.2 菌种活化52.3 菌落计数852.4 抑菌活性试验952.4.1 菌悬液的制备52.4.2 牛津杯法52.4.3 最低抑菌浓度53 结果与分析63.1 抑菌活性63.1.1 抑菌圈63.1.2 最低抑菌浓度94 结论12参考文献13致谢14摘要主要研究香水百合中总黄酮化合物经萃取后得到的三种萃取液的体外抑菌活性。先采用乙醇提取法对香水百合的总黄酮进行提取，再依次以乙醚、乙酸乙酯和正丁醇对百合黄酮进行萃取，并以大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为供试菌，采用牛津杯法和最低抑菌浓度（MIC）法测定三种萃取液的体外抑菌活性。试验结果表明：百合花中黄酮对四种菌均有抑菌作用，但三种萃取液对每种菌的抑制作用均不相同。黄酮提取液以乙醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取得到的萃取液的浓度分别为101.8mg/ml、128.6mg/ml和687mg/ml，其中乙醚萃取液对大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为1.35cm、0.90cm、1.05cm、1.25cm，乙酸乙酯萃取液对四种菌抑菌圈直径依次为0.90cm、0.90cm、1.00cm、1.15cm，正丁醇萃取液分别为1.25cm、1.20cm、1.50cm、1.35cm。由此可以看出，乙醚萃取液对大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌抑制作用较强，而乙酸乙酯萃取液对四种菌抑制作用均不太明显，正丁醇萃取液对四种菌抑制作用都较为明显，其中枯草芽孢杆菌最为突出。对乙醚萃取液，四种菌的MIC值均为12.725 mg/ml，对乙酸乙酯萃取液，金黄色葡萄球菌的MIC值为8.0375 mg/ml，其余三种菌均为16.075 mg/ml，对正丁醇萃取液，大肠埃希菌和沙门氏菌的MIC值为42.9375/ml mg，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为85.875 mg/ml。关键词：百合花；黄酮萃取液；最低抑菌浓度；抑菌活性16AbstractThe antibacterial activities in three kinds of extracts which are obtained from total flavonoids of lily were studied. The ethanol extract of total flavonoids was extracted successively with ether, ethyl acetate and n-butanol, then taking Escherichia coli, Salmonella, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus strains as the tested materials, the bacteriostatic activity of three kinds of extracts was measured by the Oxford cup and minimum inhibitory concentration (MIC) measurement. The test results showed that the flavonoids extracts of lily had inhibitory effects on each of the tested materials, but the effects of the three kinds of extracts were different. The concentration of extraction liquids which were extracted with ether, ethyl acetate and n-butanol successively were 101.8mg/ml, 128.6mg/ml and 687mg/ml, the bacteriostatic rings of ether extract of Escherichia coli, Salmonella, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus are 1.35cm, 0.90cm, 1.05cm, 1.25cm in diameter, the diameters of ethyl acetate extract were 0.90cm, 0.90cm, 1.00cm, 1.15cm, n-butanol extract were 1.25cm, 1.20cm, 1.50cm, 1.35cm. It can be known that the ether extract inhibited Escherichia coli and Bacillus subtilis well, the phenomenon on ethyl acetate extract were not too obvious, but inhibitory effects of n-butanol extract in four kinds of bacteria are very obvious, the Bacillus subtilis is the most. The minimum inhibitory concentration (MIC) for the ether extract of four kinds of bacteria was 12.725 mg/ml, for the ethyl acetate extract liquid, the MIC of Staphylococcus aureus was 8.0375 mg/ml, the other three strains were 16.075 mg/ml, and for the n-butanol extract, Escherichia coli and Salmonella were 42.9375 ml/mg, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus were 85.875 mg/ml.Key words: Greenish lily flower; total flavonoids extract; minimum inhibitory concentration; antibacterial activity引言香水百合是一种百合科百合属的多年生鳞茎类球根草本植物,花色繁多艳丽,还有令人愉悦的芳香,不仅具有很好的观赏价值1 ，还具有祛咳生津、补脾益气、清心安神的药用价值，同时还是一种广泛应用的切花材料2，但目前对于香水百合的研究多集中于其挥发性成分3,对其中含有的黄酮类化合物及其抑菌活性的研究还较为单薄。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，目前已知的黄酮类化合物单体就有八千多种，黄酮化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物5。许多研究已表明其具有多种生物活性，在抗菌、抗病毒、抗过敏、抗氧化、抗癌、免疫调节等方面均具有显著效果，且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义6。该类化合物还具有较强的抗氧化性，能清除机体代谢过程产生的多种自由基，而肿瘤、癌症、心脑血管疾病、呼吸系统病变、衰老等疾病都与细胞内自由基的产生和积累有密切关系。黄酮化合物还具有抗癌杀菌等功效，在抗菌防病等方面起着重要的作用，是一类极具开发前景的化合物4。黄酮类化合物作为一种天然抗氧化剂，已成为人类膳食中的一种不可或缺的抗氧化营养因子7 。本试验对百合花的总黄酮化合物经乙醚、乙酸乙酯、正丁醇三种试剂萃取后对大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等四种供试菌的抑菌活性进行了初步研究，为进一步探讨该植物的研究价值奠定了基础。1 试验仪器与材料1.1 供试菌种大肠埃希菌（Escherichia coli）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）沙门氏菌（Salmonella）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1.2 主要试剂琼脂 北京奥博星生物技术有限公司牛肉膏 北京奥博星生物技术有限公司蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司氯化钠 天津市永大化学试剂有限公司氢氧化钠 天津市恒兴化学试剂制造有限公司无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂1.3 主要仪器HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司药品冷藏箱 合肥美的荣事达冰箱有限公司漩涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司UV-9100紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司恒温培养箱2 试验方法2.1 培养基的制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（又称营养琼脂培养基）：分别称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g，溶解于100ml蒸馏水中，用1mol/L的NAOH溶液将pH值调至7.2-7.4，再加入1.5-2.0g琼脂粉，充分溶解后分装在三角瓶或试管中，用高压蒸汽灭菌锅在0.1MPa下灭菌20min后备用。牛肉膏蛋白胨液体培养基（又称营养肉汤）：除不加入琼脂粉外，其余步骤与固体培养基相同。2.2 菌种活化 分别将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌以无菌操作，用接种环接种在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，采用Z字划线，于37恒温培养18h后，放入4冰箱中保存备用。为防止枯草芽孢杆菌长出芽孢，其培养时间为16h。若菌种不纯，可先进行平板划线分离，得到单菌落后再以无菌操作分别接种至斜面。2.3 菌落计数8 在装有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，接种一环活化后的供试菌株，37下摇床培养16-18h，制得初始菌悬液。菌悬液的梯度稀释：将初始菌悬液以梯度稀释法分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 、10-6、10-7 等系列稀释菌液，具体操作为：取0.5ml初始菌悬液加入装有4.5ml无菌生理盐水的试管中，用漩涡混合器混匀，制成10-1稀释菌液，再取0.5ml的10-1稀释菌液于另一管装有4.5ml无菌生理盐水的试管中，混匀后制成10-2稀释菌液，按照上述操作顺序，依次制成一系列的梯度稀释菌液。涂布平板培养：将营养琼脂进行灭菌后，冷至50左右，再倒入无菌平板中，冷却凝固后便制成营养琼脂平板。分别取100l的10-4、10-5、10-6、10-7等梯度的稀释菌液，用移液枪接于相应稀释度标签的平板上，再用无菌玻璃涂布棒（用酒精棉球擦拭并灼烧灭菌）将菌液均匀涂开，平放于实验台上，等菌液稍干后，将平板倒置于37恒温培养箱内培养1618h。每个稀释度做一组平行实验，以无菌水做空白对照。菌落计数：选择平均菌落数在30300之间的稀释度，以菌落个数乘以稀释倍数即为菌落数，以cfu/ml为单位。2.4 抑菌活性试验92.4.1 菌悬液的制备在装有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，接种一环活化后的供试菌株，37下摇床培养16-18h，制得初始菌悬液。再将初始菌悬液采用二倍稀释法，分别稀释为原液的二分之一，四分之一以及八分之一，以无菌水为空白，用紫外分光光度计在600nm波长处分别测得吸光值，与菌落计数结果相对应，分别得出四个供试菌株在600nm处吸光值与菌落个数的线性关系，再根据吸光值，将初始菌悬液用无菌生理盐水稀释至107 108cfu/ml，从而制成用于进行抑菌实验的供试菌悬液。2.4.2 牛津杯法将灭好菌的营养琼脂培养基冷却至50左右，倒入无菌平板内，凝固后制成营养琼脂平板。用移液枪取100l浓度为106107cfu/ml的四种供试菌菌悬液，分别加在对应平板上，用无菌涂布棒涂匀，待菌液干后即为含菌平板，再用无菌镊子在平板上等距离放置3个牛津杯，用移液枪分别加入以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取的的黄酮提取液200l，每种菌做一个平行样，以无菌水为空白对照，正立于37恒温箱中培养1618h。培养完成后，以直尺测量抑菌圈直径，并求出每种药液对菌株平行试验中抑菌圈的平均值，记录结果。2.4.3 最低抑菌浓度最低抑菌浓度（MIC）法11：制备抗菌药物贮备液，黄酮提取液以乙醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取得到的萃取液的浓度分别为101.8mg/ml、128.6mg/ml和687mg/ml，常温下保存。取待测菌培养斜面，用接种环接种一环到50ml营养肉汤中，37摇床过夜培养，在600nm处测量其紫外吸光度，用无菌营养肉汤调整菌液浓度至1108cfu/ml左右，再以营养肉汤1:100稀释，得到浓度约为1106cfu/ml的菌液。参照CLSI2009 10，采用微量肉汤稀释法 12进行，取无菌96孔板（75%乙醇浸泡后紫外灭菌干燥），在第一孔加入100l的营养肉汤，和100l的抗菌药物原液，混匀后从中取出100l与第二孔的100l营养肉汤混匀，再加入第三孔，以此类推，进行二倍稀释。乙醚萃取液终浓度分别为50.9 mg/ml、25.45 mg/ml、12.725 mg/ml、6.3625 mg/ml，乙酸乙酯萃取液为64.3 mg/ml、32.15 mg/ml 、16.075 mg/ml、 8.0375 mg/ml，以及正丁醇萃取液为343.5 mg/ml、171.75 mg/ml、 85.875 mg/ml、42.9375/ml mg。此时每孔中含100l液体，再向每孔均加入100l的菌液，使最终细菌接菌量为5105cfu/ml左右。37恒温箱过夜培养，无细菌生长的最低药物浓度即为MIC值。每种药液对每种菌平行做三排重复，并在G行和H行分别做仅含菌液的阳性对照和仅含药液的阴性对照。3 结果与分析3.1 抑菌活性3.1.1 抑菌圈抑菌圈法又叫扩散法，是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价的一种方法，是抑菌试验的经典方法，被广泛使用。目前抑菌圈研究法中使用最多的主要有K-B法（滤纸片法）、牛津杯法和打孔法三种。牛津杯法又称杯碟法，将已灭菌的牛津杯置于试验平板中，往杯中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。抑菌圈越大，说明抑制效果越明显。经试验表明，百合花中的黄酮的三种萃取液对四种供试菌的抑制作用均不太相同。抑菌圈实验所用的乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液的浓度分别为101.8mg/ml、128.6mg/ml和687mg/ml，其中乙醚萃取液对大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为1.35cm、0.90cm、1.05cm、1.25cm，乙酸乙酯萃取液对四种菌抑菌圈直径依次为0.90cm、0.90cm、1.00cm、1.15cm，正丁醇萃取液分别为1.25cm、1.20cm、1.50cm、1.35cm。实验所用牛津杯规格为内直径6mm，外直径8mm，由此可以看出，乙醚萃取液对大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌抑制作用较强，对其余两个菌抑制作用不太明显，乙酸乙酯萃取液对四种菌抑制作用均不太明显，但正丁醇萃取液对四种菌抑制作用都较为明显，其中枯草芽孢杆菌最为突出。图1.正丁醇萃取液抑大肠埃希菌抑菌圈图2.乙醚萃取液抑大肠埃希菌抑菌圈 图3.乙酸乙酯萃取液抑大肠埃希菌抑菌圈图4.三种萃取液抑沙门氏菌抑菌圈图5.三种萃取液抑枯草芽孢杆菌抑菌圈图6.三种萃取液抑金黄色葡萄球菌抑菌圈3.1.2 最低抑菌浓度最低抑菌浓度是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标，,指在体外培养细菌18至24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度。可分为常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法以及琼脂稀释法，其中微量肉汤稀释法所用试剂量少，结果准确，但较为繁琐。实验结果以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。由表1、表2、表3可知，四种菌对乙醚萃取液的MIC值均为12.725 mg/ml；对乙酸乙酯萃取液，金黄色葡萄球菌的MIC值为8.0375 mg/ml，其余三种菌均为16.075 mg/ml；对正丁醇萃取液，大肠埃希菌和沙门氏菌的MIC值为42.9375/ml mg，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为85.875 mg/ml。这说明乙醚萃取液的抑菌效果相对较好，不需要过高的浓度，乙酸乙酯萃取液浓度适中，正丁醇萃取液的最低抑菌浓度则最高。图7 图8图9表1.乙醚萃取液对供试菌的MIC试验号总黄酮浓度大肠埃希菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌150.9-225.45-312.725-46.3625+50+注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。表2.乙酸乙酯萃取液对供试菌的MIC试验号总黄酮浓度大肠埃希菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌164.3-232.15-316.075-48.0375+-+50+注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。表3.正丁醇萃取液对供试菌的MIC试验号总黄酮浓度大肠埃希菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌1345.5-2171.75-385.875-442.9375-+521.4688+60+注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。4 结论本抑菌活性试验采用了牛津杯法和最低抑菌浓度（MIC）法中的微量肉汤稀释法，经体外抑菌研究表明，黄酮化合物经乙醚、己酸乙酯和正丁醇萃取后，对大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌效果，且乙醚萃取液的抑菌作用较为明显，其最低抑菌浓度对四个供试菌为平均最低，正丁醇萃取液抑菌圈效果最明显，但所需药物浓度偏高，乙酸乙酯萃取液对四种菌的抑菌圈均不太明显，联合最低抑菌浓度可猜测是由于浓度不够高或者菌液浓度过高导致。总之，百合中黄酮化合物的抑菌活性较好，可视为一种良好的中草药天然抑菌剂。可进一步探讨其抑菌机理，为该植物资源的合理利用提供理论基础。参考文献1朱峤，潘远智，赵莉. 氮、磷、钾、钙对香水百合生长及叶片养分含量的影响. 草业学报, 2012, 21(5): 274-284.2阮少宁,杨华,梁一池,刘荣忠. 香水百合组织培养的试验研究J. 福建林学院学报,2001,02:142-145.3张辉秀，胡增辉，冷平生，等. 不同品种百合花挥发性成分定性与定量分析.中国农业科学, 2013, 46(4): 790-799.4Sandra S, Helmut S, Ortwin B. 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