博士论文——生长素调控气孔发育的功能和作用分子机理研究

博士学位论文博 士 学 位 论 文生长素调控气孔发育的功能和作用分子机理研究 博 士 生：指导教师：专 业：植物学所在院系： 农业与生物学院上海交通大学 年 月生长素调控气孔发育的功能和作用分子机理研究摘 要由于植物不能移动，它需要根据不断变化的环境调整生理活动，以完成必要的生长发育过程。气孔存在于植物表皮，是二氧化碳和水分进出植物体的主要通道，是植物体与环境交流的桥梁，参与维持环境中二氧化碳与水分的平衡。因此，气孔的发育情况与植物体的生长发育息息相关，特别是光合作用。经过多年的研究，许多关键的调控气孔发育的信号因子渐渐被发现，包括胞外信号肽EPF家族，细胞膜蛋白与激酶TMM和ER家族，胞质激酶MAPK/MKK/MAKKK家族及细胞核内的bHLH和MYB型转录因子等。其中，EPF家族成员STOMAGEN是迄今为止被发现的唯一参与正调控气孔发育却不表达于表皮细胞的因子，即STOMAGEN基因表达于叶肉细胞，其编码产物stomagen肽被分泌至表皮层发挥正调控气孔发育的功能。植物体内及体外环境的一些因素已被发现参与调控气孔发育过程，包括二氧化碳、光及植物激素中的油菜素内酯（BR）。生长素（Auxin）是最早被发现的植物激素，它主要通过结合核受体TIR1/AFB家族及生长素调节子AUX/IAA家族形成的共受体，促进生长素响应因子ARF家族对生长素响应基因的转录调节而参与调控植物生长发育的方方面面。但目前对于生长素是否参与气孔发育的调控仍不得而知。本研究首次发现生长素参与负调控气孔发育，并揭示了这一过程是由核受体介导的生长素信号转导途径介导，最终通过生长素响应因子ARF5/MP（MONOPTEROS）直接负调控气孔发育的上游正调控因子编码基因STOMAGEN的表达，从而负调控气孔发育。通过气孔表型分析，我们发现过量表达iaaL（编码产物使内源游离活性生长素含量降低）的转基因植株，以及生长素合成途径关键酶的突变体taa1 tar1 tar2、生长素核受体突变体tir1 afb1 afb2 afb3、生长素信号抑制因子编码基因IAA12的获得性突变体bdl、生长素信号响应因子ARF5突变体arf5的气孔密度显著增多，呈现气孔簇的表型。ARF5蛋白的组织定位分析显示，该蛋白在叶肉细胞表达，而在表皮细胞无表达。鉴于STOMAGEN在叶肉细胞表达，其产物运输至表皮细胞促进气孔发育，因此本研究分析了ARF5与STOMAGEN表达的关系。结果表明：在taa1 tar1 tar2、tir1 afb1 afb2 afb3和arf5突变体中，STOMAGEN表达显著上调。基因序列分析发现，STOMAGEN启动子-500 bp至-1bp范围内含有6个典型的生长素应答元件AuxRE序列。通过EMSA、ChIP-qPCR等分析，我们发现ARF5直接与这些AuxRE结合。遗传分析表明，STOMAGEN位于ARF5的遗传学上位参与正调控气孔作用。因此，本研究揭示了生长素参与调控植物生长发育的新功能，即气孔发育；及其相关的分子机理，即生长素与其共受体TIR1/AFBsAUX/IAAs结合，促进AUX/IAAs的降解而解除AUX/IAAs对ARF5的转录抑制作用，导致STOMAGEN表达的下调，从而抑制气孔发育。这项研究不仅拓展了对生长素的生理功能的认识，而且揭示了生长素与多肽激素信号交互作用调控细胞分裂与分化的机理，对于其他植物激素与多肽激素信号间的互作机制研究具有借鉴意义。关键词：拟南芥，气孔发育，生长素，ARF5，STOMAGENThe Molecular Mechanism and Function of Auxin Regulating Stomatal DevelopmentAbstractPlants, as sessile organisms, must coordinate various physiological processes to adapt to ever-changing surrounding environments. Stomata, the epidermal pores facilitating gas and water exchange, play important roles in optimizing photosynthetic efficiency and adaptability, as well as global carbon and water circulation. Many factors are involved in regulating stomatal development, including EPF family peptides, TMM/ER family membrane protein/kinases, MAPK cascade kinases, and bHLH/MYB transcriptional factors. STOMAGEN, as a member of EPF family, is expressed in mesophyll instead of epidermis, and its encoding peptide then migrates to the epidermis where it is proposed to promote stomatal development by competitively inhibiting TMM/ER-mediated signaling. The phytohormone brassinosteroids and environment factors, such as light and carbon dioxides, also control stomatal production. Auxin, as the first identified phytohormone, participates in many aspects of plant growth and development, but whether auxin regulates stomatal development is unknown.This study establishes that auxin negatively regulates stomatal development through ARF5/MP (MONOPTEROS) repression of mobile peptide gene STOMAGEN expression in mesophyll cells, which is mediated by direct binding of ARF5 to auxin response elements in the STOMAGEN promoter.We observed significantly increased SMI (stomata plus meristemoids per total epidermal cells) and stomatal clusters in epidermis of iaaL, taa1 tar1 tar2, tir1 afb1 afb2 afb3, bdl, or arf5 mutant / transforming plants. ARF5 protein localizes in mesophyll cells, instead of the epidermis, consisted with STOMAGEN expression. Genetic analysis indicates that ARF5 regulates stomatal development, at least in part, through repressing STOMAGEN expression. From qRT-PCR analysis, histochemical staining, and Dual-LUC assay, we found that ARF5 regulates STOMAGEN expression depending on AuxREs in STOMAGEN promoter. ChIP and EMSA assays indicate that ARF5 directly associates with AuxREs in STOMAGEN promoter. This study advances our knowledge about the roles of auxin and the versatile regulator ARF5 in plant growth and development, while providing a paradigm of cross-talk between phytohormone auxin and peptide signaling in the regulation of stomatal production.Key words: Arabidopsis, stomatal development, Auxin, ARF5, STOMAGEN目录摘 要5目录9缩略词表12第一章 文献综述141 拟南芥气孔发育的研究进展141.1 气孔的产生与进化史141.2 拟南芥气孔发育途径的重要因子181.2.1 EPF家族成员负调控气孔发育181.2.2 LRR型膜受体激酶及蛋白负调控气孔发育221.2.3 MAPK级联激酶负调控气孔发育231.2.4 胞外、胞内蛋白酶在气孔发育调控中的作用241.2.5 转录因子正调控气孔发育251.2.6 “极性因子”在气孔发育调控中发挥的作用291.3气孔发育与环境的互作321.3.1 二氧化碳浓度与气孔发育321.3.2 光与气孔发育331.3.3 油菜素内酯（Brassinosteroids，BR）与气孔发育342 生长素的合成、运输和信号转导途径352.1 生长素的合成途径352.1.1 从头合成362.1.2 代谢产生412.2 生长素的运输途径412.2.1 生长素的输入422.2.2 生长素的输出422.3 生长素的信号转导452.3.1 生长素介导的转录水平调控452.3.2 生长素介导的非转录水平调控50第二章 实验材料与实验方法521 材料521.1 菌株与原始质粒521.2 植物材料521.3 构建531.4 试剂与仪器562 实验方法592.1 PCR反应592.1.1 Taq DNA聚合酶592.1.2 KOD DNA聚合酶592.2 载体构建602.2.1 限制性内切酶法602.2.2 融合法602.2.3 DNA 突变612.3 大肠杆菌转化612.4 质粒的提取632.5 农杆菌转化642.6 拟南芥种植652.7 拟南芥转化652.9 拟南芥基因组DNA的提取662.10 气孔表型分析672.10.1 利用微分干涉显微镜672.10.1 利用激光共聚交显微镜672.11 RNA的提取和定量RT-PCR672.12 组织免疫学染色692.13 染色质免疫共沉淀（ChIP）702.14 蛋白的表达与纯化732.15 Western检测752.16 DNA与蛋白的体外免疫沉淀（DNA-protein pull-down）772.17 电泳迁移率实验（EMSA）782.18 烟草瞬时转化792.19 LUC与Dual-LUC实验80第三章 实验结果与结论811 生长素及其信号通路负调控气孔发育811.1 外源生长素处理抑制气孔发育811.2内源生长素水平的升高抑制气孔发育821.3内源生长素水平的降低促进气孔发育831.4 核受体介导的生长素信号抑制气孔发育851.5 ARF5负调控气孔发育861.6 ARF5调控气孔发育及胚胎根发育成正相关性881.7 IAA12正调控气孔发育892 ARF5抑制气孔发育始于气孔发育早期903 ARF5介导的生长素信号抑制STOMAGEN的表达913.1 ARF5蛋白表达于叶肉细胞913.2干扰生长素的体内合成促进STOMAGEN的表达924 STOMAGEN位于ARF5的遗传学上位参与调控气孔发育995 ARF5直接结合STOMAGEN启动子区域1015.1 ARF5与STOMAGEN启动子区在体内相互作用1015.2 ARF5与STOMAGEN启动子区在体外直接相互作用1025.3 ARF5与STOMAGEN启动子区的直接的相互作用依赖于AuxREs顺式元件1046 ARF5调控STOMAGEN的表达依赖于AuxREs顺式元件1066.1 在烟草瞬时表达系统中，ARF5调控STOMAGEN的表达依赖于STOMAGEN启动子的-500 bp至-1 bp区段1066.2 在烟草瞬时表达系统中，ARF5调控STOMAGEN的表达依赖于STOMAGEN启动子上-500 bp至-1 bp区的AuxREs元件1086.3 在拟南芥中，ARF5调控STOMAGEN的表达依赖于STOMAGEN启动子上-500 bp至-1 bp区的AuxREs元件108第四章 讨论与展望1111 生长素及其核受体介导的信号通路参与负调控气孔发育1112 生长素及ARF5对STOMAGEN表达的负调控可能具有时效性1123 烟草与拟南芥系统中ARF5对STOMAGEN表达调控方向的不一致性1134 ARF5可能主要以非细胞自主性方式参与负调控气孔发育1145 ARF5参与调控气孔发育的其他途径1156 ARF5参与调控垫基细胞发育1167 ARF5可能是生长素调控叶片生长、发育与生理活动的一个效应因子1168 ARF家族的其它成员参与负调控STOMAGEN表达1179 IAA12等AUX/IAAs参与抑制MP对气孔发育的调控11710 核受体介导外的生长素信号通路与气孔发育11811 生长素调控气孔发育的新进展11812 生长素与肽激素间的新交流119第五章 创新点121参考文献122附录137致谢错误！未定义书签。研究成果146缩略词表List of Abbreviation缩写英文全称中文全称IAAIndole Acetic Acid吲哚乙酸BRBrassinosteroids油菜素内酯bpbase pair碱基对kbkilo base pairs千碱基对cDNAcomplementary Desoxyribose Nucleic Acid互补(链)脱氧核糖核酸qRT-PCRQuantitative Reverse Transcription-PCR定量反转录PCRDMSO Dimethyl Sulfoxide二甲基亚砜DNADesoxyribose Nucleic Acid脱氧核糖核酸DPGDays Post Germination萌发后天数EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay电泳迁移率实验ChIPChromatin Immunoprecipitation染色质免疫共沉淀EDTAEthylene Diamine Tetra-acetic Acid乙二胺四乙酸二钠GmGentamycin庆大霉素HygHygromycin潮霉素RifRifampicin利福平KmKanamycin卡那霉素AmpAmpicillin氨苄青霉素KDKilo Dalton千道尔顿MBPMaltose Binding Protein麦芽糖结合蛋白MSMurashige and Skoog mediumMS培养基ODOptical Density光密度PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应PIPropidium Iodide碘化丙啶RNARibonucleic Acid核糖核酸RNAiRNA interferenceRNA干扰rpmrevolutions per minute转每分钟SDSSodium Dodecyl Sulfate十二烷基磺酸钠TrisTri(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷TBETris Boric AcidTris-硼酸TETris EDTATE溶液UTRUntranslated Region非翻译区X-gluc5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷葡萄糖苷酸第一章 文献综述1 拟南芥气孔发育的研究进展1.1 气孔的产生与进化史气孔是一类广泛存在于植物表皮、由至少两个特化的细胞包围形成的孔通道，植物通过这个通道与大气环境交换水气、二氧化碳和氧气，从而部分甚至完全脱离水生环境，在陆地上出现、存活并繁衍生息。植物从海洋向陆地的进化史的发生伴随着气孔的产生与进化。早在4亿多年前，植物开始从海洋中“登陆”。通过对不同地质层中存在的化石研究，地质植物学家发现那些早期“登陆”的植物物种中伴随产生了早期的气孔结构。具有时而关闭时而开放特性的气孔的产生能使植物既适应了相对干燥的环境，又保证了光合作用及蒸腾作用所需的气体交换，同时还能调节植物与环境的热量交换。气孔的出现保证了植物在陆地生存的可能性，拓展了植物的生存空间。随着时间的推移，植物群体的气孔密度呈现增高的趋势，这可能是由于大气中CO2的浓度降低所致1。与气孔开闭这一后期的生理调节相比，气孔的分布这一前期的结构基础显得更为重要。 气孔的分布不是杂乱无章的，并且同样伴随着地球环境的演变而经历了一个漫长的进化过程。 迄今为止，气孔分布进化树的顶点止于高等植物被子植物。以被子植物中十字花科模式植物拟南芥叶片的气孔发育为例（图1.1），早期的叶片表皮原细胞中的一些细胞受到某种信号的刺激，转化为拟分生组织母细胞（MMC，Meristemoid Mother Cell），具有了分裂能力；MMC经过不对称分裂形成两个细胞，大细胞气孔家系基础细胞（SLGC，Stomatal Lineage Ground Cell），SLGC最终会发育成除气孔细胞外的另一类表皮细胞垫基细胞（PC，Pavement Cell），及小细胞拟分生组织细胞（M cell，Meristemoid cell），即开启了气孔发育的进入分裂（Entry Division）2；M细胞具有不对称分裂能力，它能进行一次至三次的类似于MMC的不对称分裂3，这个过程丰富了表皮细胞的数量，称为扩增分裂（Amplifying Division）；在不对称分裂过程中，新产生的M细胞不会与已形成的M细胞相邻，两者之间会至少存在一个SLGC，即“一个细胞原则”，这一现象也叫间隔分裂（Spacing Division）；最后M细胞分化为保卫母细胞（GMC，Guard Mother Cell），它的不对称分裂能力消失；GMC经过一次对称分裂形成两个相似的保卫细胞（GC，Guard Cell）4；最终保卫细胞会经过一系列的形态学上的变化形成气孔（Stoma）结构。图1.1 拟南芥气孔发育过程的细胞分裂与分裂示意图5。Figure 1.1 Diagram of key stages and divisions in Arabidopsis thaliana stomatal development.表皮原细胞（Protodermal cell）接收信号转化为MMC（Meristemoid Mother Cell），MMC通过第一次不对称分裂（Entry division）产生M细胞（Meristemoid），M细胞进行多轮的增殖分裂（Amplifying division），最终分化为GMC（Guard Mother Cell），GMC经过一次对称分裂产生两个保卫细胞（Guard Cell），后者经过形态学和生理学的变化形成气孔结构（Stoma）。M细胞、GMC和气孔相邻细胞均有成为MMC，通过位置分裂（Spacing division）产生M细胞。受信号因子的调控，位置分裂产生的M细胞与原先存在的气孔或前体细胞不相邻。通过对系统发育进化树上各个进化阶段代表植物的分析观察，研究人员发现，气孔的形态与发育模式都经过了较为漫长的进化过程（图1.2）6, 7。图1.2 气孔的进化史6。Figure 1.2 Diversity of Stomata across Land Plant Taxa.包括现存的和已灭绝的（）植物的系统发生树。（A-H）指示各阶段代表植物的气孔发育形态。最早出现在陆地上的苔藓植物门（Bryophytes），由地钱（Liverworts）、苔藓（Mosses）及金鱼藻（Hornworts）构成。地钱没有气孔结构，苔藓（Mosses）中一些在进化上处于独立分枝的植物也没有进化出典型的气孔，例如进化上处于苔藓植物早期的水藓（Sphagnum），它的类似于气孔的结构可能是用于孢子的干燥而没有典型的CO2利用的功能8；但大部分苔藓植物门（Bryophytes）物种已经出现了各种不同形态的气孔结构（图1.3），尽管苔藓植物的气孔发育过程只涉及表皮细胞仅经过一次不对称分裂直接产生GMC，没有出现增殖分裂，并且气孔结构和分布模式还不成熟，例如，葫芦藓（Funaria hygrometrica）的GMC的对称分裂不完全，即两个保卫细胞的细胞核被一个不完整的细胞壁隔开9；拟金发藓（Polytrichastrum formosum）的气孔分布出现了气孔相邻的现象，即没有遵循间隔分裂的原则。图1.3 苔藓植物的气孔形态多样性10。Figure 1.3 Diversity of stomatal morphology in bryophytes.A细叶真藓（Bryum capillare）的幼嫩孢子囊上的气孔集中分布于颈部。B. 木灵藓（Orthotrichum anomalum）的孢子囊壁上的沉降式气孔。C. 泥炭藓（Sphagnum fimbriatum）的无功能气孔。D. 拟金发藓（Polytrichastrum formosum）孢子囊上凸起的气孔。E. 角苔藓（Anthoceros punctatus）孢子囊壁上被疏水物质覆盖的气孔。增殖分裂最早出现于蕨类植物（Ferns），它使表皮细胞经过一次或两次的不对称分裂而不是直接分化为GMC，它的出现有效地丰富了细胞数目、调节气孔密度并产生了特化的气孔辅助细胞。这些具有进化意义的辅助细胞具有厚实的、防水的角质层，它们与气孔保卫细胞紧密相接，使得保卫细胞中出现了木质素这一在苔藓植物中不曾出现的细胞壁聚合物11。不是所有植物都具有气孔结构，有些植物可能因为所处的环境而没有进化出气孔，从某种意义上限制了他们的生长发育。一些寄生植物具有不完整的气孔甚至不具有气孔，可能是由于他们的宿主为他们提供了丰富的固碳源而使得进化出利用气孔间接固定CO2这一功能变得徒劳；水韭属（Isoetes）植物中有些具有异型叶，气孔结构只出现于暴露于空气中的叶片，而一些完全生长于水中的植物则完全没有进化出气孔结构，这可能归因于它们强大的根系在水中固定CO2的能力12。通过观察统计，无气孔的植物个体小并且生存环境有限，而气孔的出现使得更多的植物生长发育得更为高大强壮并且更能适应复杂变化的生存环境13。1.2 拟南芥气孔发育途径的重要因子迄今为止，以模式植物拟南芥为研究对象，研究者们发现许多因子参与调控叶片表皮气孔发育过程。它们不仅分布在表皮，而且存在于叶肉细胞。它们作为信号载体，使表皮细胞间、表皮细胞与叶肉细胞间得以联系与交流，调控气孔发育过程各个环节细胞的分裂与分布，最终使表皮得已形成有序的、丰富的气孔分布形态。这些因子由分泌肽（EPFf）、胞外蛋白酶（SDD1）、膜蛋白（TMM、ERf）、级联蛋白激酶（MAPKf）、胞质蛋白酶（AP2C3）、穿梭蛋白（BASL）、转录因子（bHLHs、MYBs）、细胞周期蛋白（CDKB、CYCA）等组成。下面依次介绍它们各自在气孔发育进程所发挥的作用。1.2.1 EPF家族成员负调控气孔发育EPF（EPIDERMAL PATTERNING FACTOR）和EPFL（EPIDERMAL PATTERNING FACTOR-LIKE）统称 EPF 家族（EPFf），它们编码一类富含半胱氨酸的分泌型肽激素，通常在肽段的碳端（C端）含有6个或8个保守的能形成二硫键的半胱氨酸，这些二硫键的形成决定着肽链的正确折叠及特异的蛋白活性。迄今为止，EPF家族中有三个成员被发现参与调控拟南芥叶片的气孔发育。其中，EPF1与EPF2负调控气孔发育，而EPFL9（STOMAGEN）正调控气孔发育。EPF1参与调控气孔发育的作用首先被发现14。EPF1编码一条104个氨基酸的肽链，通过第20及21位氨基酸的剪切，将氮端的信号肽剪掉，得到成熟的一级肽链。EPF1在发育中的叶片、茎和花芽中都有表达，在叶片表皮的气孔发育家系细胞中的M细胞、GMC细胞与未成熟分化的GC细胞中均有表达。研究者通过转基因方式将花椰菜病毒35S启动子（Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter）驱动表达EPF1（At2g20875）的构建转入拟南芥中，发现相对于野生型，高表达EPF1蛋白的转基因植株株型矮小、不育，并且叶片表皮上几乎没有气孔形成；而T-DNA插入的突变体epf1-1与野生型相比，气孔密度增高并且形成了聚集的气孔簇，不符合“一个细胞”原则，但没有表现出除气孔发育外的异常表型。而后以EPF1的氨基酸序列为参考，通过生物信息学手段，研究人员发现了10个EPF1同源蛋白，分别命名为EPF2或EPFL1-9，它们的一级结构都含有位于N端的分泌信号序列及位于C端的6个保守的半胱氨酸15。通过转基因手段，研究人员发现，EPF2（At1g34245）参与负调控拟南芥叶片气孔发育15, 16。35S:EPF2植株发育不完整，叶片表皮几乎只由垫基细胞组成，气孔密度大幅下降，并且值得注意的是，与35S:EPF1不同，这些垫基细胞中存在一些小细胞，这些小的垫基细胞可能是从气孔发育家系细胞不正常分化而来的。相反，与野生型相比，epf2突变体的叶片气孔密度增高，并且出现了很多小的表皮细胞。利用细胞特异表达基因的差异表达分析，研究人员发现这些出现在epf2突变体上的小的表皮细胞是具有MMC细胞特性但大多不具有M细胞属性的气孔家系细胞。同时，通过分析EPF2基因的表达情况，研究人员发现，与EPF1相比，在气孔发育时间上，EPF2表达更早，它表达在M细胞与GMC细胞中。在启动子互换实验中，EPF1:EPF2可以部分的抑制epf1的气孔簇表型，而EPF2:EPF1则不能抑制epf2的增高的气孔密度的表型，说明EPF2可以部分的替代EPF1的功能，反之则不行。在EPF2而非EPF1过表达植株中，EPF2的表达被极大地抑制，说明EPF2抑制了表皮原细胞获得MMC细胞特性的功能，而EPF1的功能在时空上晚于EPF2；而EPF1的表达则在EPF1及EPF2的过表达植株中均未检测到，验证了EPF1的功能可以被EPF2部分替代的事实15。EPF2与EPF1被认为是从气孔发育家系中的不同细胞（MMC与M细胞）产生并分泌至表皮细胞间隙，抑制与气孔家系细胞的相邻细胞的分裂，从而维持气孔发育家系细胞间至少间隔“一个细胞”的原则。另一方面，2010年，Hara-Nishimura团队17与Sakagami团队18分别独立报道了迄今为止唯一被发现的、以非细胞自主性参与正调控叶片气孔发育的分泌肽EPFL9/STOMAGEN（At4g12970，图1.4）。STOMAGEN过表达植株气孔密度、气孔系数（SI，Stomatal Index，气孔数目占所有表皮细胞的比例）增加，并且出现了气孔簇；而利用RNA干扰技术构建的35S:STOMAGEN-RNAi能成功地干扰野生型拟南芥体内STOMAGEN的表达，从而导致其叶片气孔密度、气孔系数大幅度降低。STOMAGEN表达在幼嫩的子叶、真叶、茎、花及果实中，但与家族成员EPF1和EPF2的表达不同，它并不表达在气孔发生的表皮层，而是表达在与表皮层相接的、光合作用发生的叶肉层。通过质壁分离实验，研究人员发现，STOMAGEN蛋白存在于表皮的细胞间隙。因此，研究者认为STOMAGEN表达在叶肉细胞，分泌至叶片表皮，从而参与正调控表皮细胞的气孔发育的分裂过程。图1.4 STOMAGEN以非细胞自主性方式正调控气孔发育17。Figure 1.4 STOMAGEN non-cell-autonomously and positively regulates stomatal development.A. 干扰或过表达STOMAGEN分别抑制或促进气孔发育。 B. STOMAGEN表达于叶肉细胞。 C. stomagen肽存在于表皮细胞间隙。STOMAGEN基因编码一个含有102的氨基酸的小肽蛋白，质谱分析STOMAGEN过表达产物显示，这个小肽蛋白在体内会被加工成一段只由原肽链的C端45个氨基酸组成（包含6个保守半胱氨酸）的成熟肽链，命名为stomagen（图1.5）。研究人员将只编码N端的信号肽（Signal peptide）与stomagen的核苷酸直接拼接（不包含原蛋白位于中间位置的前体蛋白）并转化植物，得到了叶片气孔密度增高的转基因植株；直接合成stomagen并处理拟南芥幼苗，可以得到具有气孔簇表型的植株，说明这45个氨基酸对诱导气孔发育是足够的。位于原蛋白中间的前体肽链（Propeptide）的作用还未可知，可能它会参与STOMAGEN肽链的选择性加工或是参与STOMAGEN的除调控气孔发育以外的其它未被发现的功能。体外化学合成或是利用烟草悬浮细胞表达得到的stomagen肽，施加到培养基中，能促进拟南芥小苗的气孔发育，并且与肽浓度成正相关。图1.5 STOMAGEN的一级结构与功能区17。Figure 1.5 The primary structure and functional domain of STOMAGEN protein.A. STOMAGEN的一级结构。B. stomagen的蛋白凝胶电泳。C. stomagen促进气孔发育。2 uM stomagen处理（右图）或不处理（左图）Lti6bGFP（指示表皮细胞）转基因植株的气孔发育情况，标尺：50 uM。EPF/EPFL家族中的成员都具有一定程度的序列相似性，但却出现了对同一发育过程的拮抗的调控关系，这是很有趣的。经研究发现，除了蛋白一级结构上的相似性，EPF1/2与STOMAGEN在二级结构上也具有一定的相似性，都是由一段特异的、低保守性的肽链形成一个环状结构并连接两个较为保守的折叠组成（图1.6）。研究发现，这段环状结构对于EPF1/2与STOMAGEN在气孔发育的拮抗调控作用起着决定性的作用。利用环结构互换实验，研究人员将EPF2的骨架与stomagen的环状肽链相拼接得到的产物能促进气孔发育，相反，将stomagen的骨架与EPF2的环状肽链结合的产物则抑制了气孔发育，均与原骨架蛋白的功能相反。同样的，利用定点突变结合核磁共振实验，研究人员发现，保守的6个半胱氨酸形成的3个二硫键对stomagen的骨架的形成是必须的，继而决定了stomagen的功能19。图1.6 EPF1、EPF2与EPFL9/stomagen结构相似19。Figure 1.6 Similar structural models of EPF1, EPF2, and EPFL9/stomagen.Stomagen的结构由实验解析，而EPF1和EPF2的结构是由同源建模而得。深蓝及黄色球杆状结构指示二硫键，浅蓝色长条形指示折叠区，红色长条形指示螺旋区。1.2.2 LRR型膜受体激酶及蛋白负调控气孔发育通过显微观察自EMS（甲基磺酸乙酯，Ethyl Methyl Sulfone）诱变得到的种子萌发出的拟南芥小苗的叶片气孔发育情况，研究者们首先发现了tmm突变体，它的叶片气孔发育异常，形成大量的气孔簇20。通过定位，研究人员找到了它的编码基因TMM（TOO MANY MOUTHS，At1g80080）21，基因产物TMM属于LRR型膜定位蛋白，由亮氨酸富集（LRR，Leucine Rich Repeat）的胞外区与跨膜区构成，其中LRR能介导膜蛋白与胞外区蛋白的结合，而位于非LRR区的成对的半胱氨酸则能介导它与其它膜蛋白或具有胞内激酶结构域的膜受体蛋白的作用。通过观察ER（ERECTA）家族的三个成员ER（At2g26330）、ERL1（At5g62230）、ERL2（At5g07180）的单突变体、双突变体及三突变体的叶片气孔表型，研究人员揭示了三个成员在叶片气孔发育过程中所起的作用22：参与调控两个决定性的步骤，首先，ER、ERL1、ERL2一同参与调控最初的表皮原细胞的分裂，从而产生垫基细胞或是通过不对称分裂产生气孔家系细胞；其次，ERL1与ERL2对维持气孔家系细胞的分裂能力起重要作用，并且阻止M细胞向GMC细胞的分化，其中主要是ERL1发挥作用。ER家族的三个成员能形成同源或异源的蛋白二聚体，并且不依赖于他们的胞内区；TMM不能自身二聚化，但能与ER家族成员形成蛋白二聚体。作为膜蛋白及膜受体，TMM与ER家族被认为能接受胞外的分泌肽信号并传递至细胞内，从而调控气孔发育22-25。经研究发现，ER家族能结合分泌肽EPF1、EPF2，TMM则只能结合EPF225。研究者发现，从大肠杆菌细胞中表达并纯化的MEPF1、MEPF2，具有生物学活性，将它们分别处理拟南芥小苗，能模拟EPF1、EPF2过表达的表型。因ER家族成员存在部分功能上的冗余性，研究人员利用在对应的突变体中，表达缺失胞内激酶结构域的膜蛋白的方法研究拟南芥体内ER家族蛋白与EPFs特异性的配对结合。MEPF1施加到ERL1K；erl1（K，缺失胞内激酶结构域）而非ERECTAK；er中，不能产生与施加到WT（野生型）、epf1一样的表型，即产生了过多的异常的小细胞；而MEPF2施加到ERECTAK；er而非ERL1K；erl1中不能产生与施加到WT、epf2一样的表型，即产生只有成熟的奠基细胞的表型。这些结果说明，在拟南芥中，主要以EPF2-ERECTA、EPF1-ERL1的配对形式为主。结合ER家族与EPF家族的各自基因的缺失、过表达的表型分析，研究人员得出了EPF2-ERECTA主要参与抑制M细胞活性的获得与EPF1-ERL1主要参与抑制M细胞到GMC细胞的分化过程的结论，其中TMM主要起辅助调控作用，而ERL2参与调控气孔发育的作用则相对微弱。1.2.3 MAPK级联激酶负调控气孔发育MAP激酶级联通路的核心区由三类蛋白激酶组成，MAP激酶（MAP KINASE，MPK）、MAP激酶的激酶（MAP KINASE KINASE，MKK）与MAP激酶的激酶的激酶（MAP KINASE KINASE KINASE，MAPKKK）。MAP激酶级联通路位于接收胞外信号的膜受体下游，一旦被激活，会通过一级一级的、顺序的磷酸化反应最终将核心特异的MAP激酶激活，从而介导细胞特异的反应。作为级联通路的上游，有一些MAPKKK已被发现参与调控细胞分裂、对生物与非生物环境的相应及激素信号26。其中研究的比较清楚的番茄中的NPK1，促进细胞板的生长与成熟，从而参与调控细胞分裂。而NPK1自身则受到胞内、胞质信号的双重调控。拟南芥基因组被认为编码20个MEKK1/STE11型MAPKKK，10个MAPKK及20个MAPK。研究者发现，作为MAPKKK家族成员，YDA（At1g63700）参与调控胚胎期细胞分裂与气孔发育27。yda突变体呈现类似于tmm突变体一样的气孔簇的表型。将YDA的N端部分序列缺失能导致YDA的激酶活性组成性增强，导致气孔完全缺失的严重表型，说明YDA参与抑制气孔发育的表型。而后研究者们陆续发现，MKK4/5/7/9（At1g63700/At3g21220/At3g21220/At1g73500），MPK3/6（At3Gg45640/At2g43790）也参与负调控气孔发育28, 29。mpk3、mpk6的单突变没有明显气孔发育异常的表型，而mpk3 mpk6双突变体则呈现气孔簇的表型，并且在YDA组成性激活的转基因N-YDA中MPK3与MPK6的激酶活性均增强；MKK4RNAi、MKK5RNAi的单突变呈现弱的气孔异常的表型，有2-3个气孔成簇出现，但双转基因MKK4-MKK5RNAi则呈现强的气孔异常的表型，类似于yda，表皮几乎均是气孔。MKK7/9被认为参与促进GMC的分化（在FAMA的功能一章详细说明）。1.2.4 胞外、胞内蛋白酶在气孔发育调控中的作用最早被发现的参与调控气孔发育的胞外蛋白酶是SDD1（STOMATAL DENSITY AND DISTRIBUTION1，At1g04110），它是一种类枯草杆菌、丝氨酸蛋白酶30, 31。与野生型相比，突变体sdd1的叶片表皮的气孔密度升高了2-4倍，并形成了气孔簇；而SDD1过表达植株则呈现了与突变体相反的表型，即气孔密度降低并且部分气孔发育不完全。遗传分析发现，在气孔发育中，TMM位于SDD1的遗传学上位，即SDD1的功能依赖于TMM；而EPF1、EPF2的功能则不依赖于SDD1，说明SDD1并不修饰EPF1、EPF2的剪切修饰，它的底物还未被发现。最近的研究显示，EPF2能被CRSP（CO2 RESPONSE SECRETED PROTEASE，At1g20160）蛋白酶剪切修饰，后者与SDD1同属于类枯草杆菌、丝氨酸蛋白酶。这项发现是在研究CO2调控气孔发育的机制中被揭示的32，详细的内容将在后面的气孔发育与环境因子部分讨论。不同于胞外蛋白酶对气孔发育上游信号的分泌肽的成熟加工，胞内蛋白酶定位于表皮细胞内，即气孔发生组织，参与调控胞内气孔发育下游信号强度。研究人员已发现，编码产物隶属于PP2C型磷酸酶家族的AP2C3（ARABIDOPSIS PROTEIN PHOSPHATASE 2C，At2g40180）表达于气孔家系细胞，与MPK3、MPK6存在蛋白质间的相互作用并且能使两者的激酶活性消失，从而促进气孔发育。AP2C3的过表达植株叶片呈现类似于mpk3 mpk6双突变体的严重的气孔簇的表型，但是ap2c3的突变体气孔发育正常，因此内源AP2C3参与气孔发育的调控方式还未可知33。1.2.5 转录因子正调控气孔发育与植物体其它生理发育过程相似，表皮细胞内外的信号传递最终会导致参与调控气孔发育的基因表达谱的变化，从而表现为气孔发育的异常，直接介导这一过程的是转录因子。迄今为止发现的参与拟南芥气孔发育调控的转录因子包括两大类，bHLH型和MYB型转录因子。1.2.5.1 bHLH型转录因子调控气孔发育的bHLH型转录因子包括3个成员，SPCH、MUTE和FAMA，它们分别参与调控M细胞的起始、GMC细胞的形成及GMC细胞的对称分裂。spch突变体没有气孔形成，整个叶片表皮只由垫基细胞构成（图1.7）。过表达SPCH的植株叶片则出现垫基细胞不对称分裂的现象34, 35。利用SPCH（At5g53210）自身启动子驱动表达SPCH-GFP蛋白的分布显示，SPCH蛋白与M细胞相关联，即表皮原细胞中只有那些表达SPCH蛋白的细胞具有M细胞的功能，进行不对称分裂；并且分裂得到的两个细胞中只有那个持续表达SPCH蛋白的细胞延续了M细胞的功能36。这些结果进一步说明SPCH在气孔发育的起始与M细胞特性的获得方面发挥着重要的功能。值得注意的是，在完全突变体spch-3中，也同样检测不到MUTE（At3g06120）和FAMA（At3g24140）的表达，暗示着后两者的表达依赖于SPCH34, 35。mute突变体叶片表皮没有气孔形成（图1.7），这可能是造成它植株矮小、叶绿素积累少、不育表型的原因。野生型叶片的M细胞一般会经历1-3轮的不对称分裂后分化为GMC细胞，而mute突变体的M细胞则经历了3-6轮的不对称分裂，并且没有形成GMC细胞，而是停留在M细胞时期，造成了以M细胞为中心、向内多轮不对称分裂形成的“玫瑰花”形态（图1.7）。而MUTE过表达则造成表皮仅由气孔构成的表型，研究人员观察MUTE自身启动子驱动的MUTE-GFP蛋白发现，MUTE蛋白表达在M细胞。说明MUTE促进GMC细胞的形成并抑制M细胞进行过多的不对称分裂过程34, 35。图1.7 bHLH型蛋白与气孔发育38。Figure 1.7 bHLH proteins and stomatal development.A. bHLH型蛋白参与气孔发育过程的不同节点。B-E. bHLH型转录因子编码基因的突变体的子叶下表皮的气孔表型。F. SPCH、MUTE、FAMA的基因结构示意图。盒子代表外显子，其中灰色代表bHLH编码区，线代表内