生物工程毕业论文范文——小GTPase RhoA单突变体Y42C和G17E的构建 表达与纯化

编号本科生毕业设计（论文）题目： 小GTPase RhoA单突变体Y42C 和G17E的构建、表达与纯化 生物工程 学院 生物工程 专业学 号 学生姓名 校内导师 企业导师 年 月摘要摘要I摘要RhoA是小G蛋白（Small G protein，又称GTPase）Rho家族中重要成员之一，在细胞信号通路传导过程中起到重要作用。细胞中RhoA的异常表达与肿瘤的发生、侵润与转移密切相关，它的突变会导致肿瘤细胞呈现分散性生长，这也是弥散型胃癌的重要标志。目前鲜少有对弥散性胃癌中出现的RhoA G17E和Y42C的体外基因突变和在大肠杆菌中表达并纯化的报道。因此，探索出RhoA G17E和Y42C突变体的构建、异源表达和纯化方案，有利于推动RhoA G17E和Y42C突变体蛋白的商品化，更方便于生物医药行业对于以RhoA为靶点研发新治疗胃癌药物的研究工作。本研究以佰翺得公司现存的含有人源RhoA(1-181)基因的质粒为模板，通过设计引物分别对其17位甘氨酸以及42位酪氨酸进行PCR定点突变，成功突变出RhoA G17E和RhoA Y42C基因。 并构建了pET-28a(+) -His-TEV-RhoA Y42C/RhoA G17E质粒以及pRSET B -His-EK-RhoA Y42C/RhoA G17E质粒。将表达质粒转化Escherichia coli BL21(DE3)-T1R进行小剂量蛋白质发酵，实验结果表明pRSET B载体表达目的蛋白效率更高。大肠杆菌BL21(DE3)-T1R表达的RhoA Y42C蛋白非常易于纯化，通过Ni亲和层析柱、离子交换柱、分子筛成功纯化出满足后续结晶需求的高纯度RhoAY42C蛋白；通过对RhoAY42C蛋白的Thermo Fluor分析发现RhoAY42C蛋白在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液体系中最稳定。实验中我们发现RhoA G17E在E. coli BL21(DE3)-T1R中表达量偏低，而在E. coli Rosetta2(DE3)中表达量较高，我们对E. coli Rosetta2(DE3)表达的目的蛋白进行亲和层析、离子交换、高精度亲和层析、疏水作用层析纯化工艺探索工作，获得了一定纯度的RhoA G17E，但未能达到后续研究工作蛋白纯度要求。关键词：RhoA；定点突变；异源表达；蛋白纯化IIIAbstractABSTRACTRhoA is an important member of Small G proteins (Small G protein, also called GTPase) Rho family, it plays a molecular switch action in cell signaling transduction pathway. The abnormal RhoA expression in cells was closely related to tumor genesis, invasion and metastasis. It will lead to the growth of tumor cells exhibited dispersion, which is also an important indicator of diffuse gastric cancer. Currently, researchers have developed Herceptin for gastric intestinal, but the drug made no significant effect cure for patients with diffuse gastric cancer. It still has a long way to go to develop a drug for diffuse gastric cancer, which makes the RhoA mutants obtained concerned of scholars. There are few of reports of RhoA G17E and Y42C occurring in diffuse gastric cancer to be expressed in E. coli and purified. Therefore, to explore and construct RhoA G17E and Y42C, heterologous expression and purification scheme, it is conducive to promote RhoA G17E and Y42C mutant commercialization, and commercializing and also this project will facilitate the bio-pharmaceutical industry which develop new drugs whose target point is RhoA in treatment of gastric cancer.In this study, plasmid containing human RhoA (1-181) gene in the Biortus Company as a template, primers of site-directed mutagenesis were designed for its 17 and 42 glycine-tyrosine, successfully we get RhoAG17E and RhoAY42C gene. Then we construct pET-28a (+) -His-TEV-RhoA Y42C / RhoA G17E plasmid and pRSET B -His-EK-RhoA Y42C / RhoA G17E plasmids. The expression plasmids were transformed into E. coli BL21 (DE3) -T1R, small scale expression results showed that pRSET B vector have higher protein expressing efficiency. RhoAY42C expressed in E. coli BL21 (DE3) -T1R is easily to purify,and we get high-purity tagged protein by Ni-exchange column affinity chromatography, ion exchange chromatography , molecular sieve,which can be used for crystallization; by Thermo Fluor of RhoA Y42C ,we found that our tagged protein was most stable in 50mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer system .In our expeiments,we also found the expression of RhoA G17E in E. coli BL21 (DE3) -T1R was not so well but better in E. coli Rosetta2 (DE3);we purified the supernatant extracts by Ni-exchange column affinity chromatography, ion exchange chromatography , Ni-exchange HP column,HIC; Finally we get a certain purity of RhoA G17E; Unfortunately, failed to meet the requirements of protein purity for further study.Key words：RhoA; site-directed mutagenesis; Heterologousexpression; protein purification目录目 录第1章 绪论11.1 研究意义和背景11.2 小G蛋白RhoA及其突变体的研究进展11.2.1 RhoA GTPase简介21.2.2 RhoA结构和特点分析21.3 基因体外定点突变改造蛋白31.4 应用基因工程在细菌中表达目的蛋白的可行性41.5 研究内容及创新性41.5.1 研究内容41.5.2 研究创新性4第2章 材料与方法52.1 材料52.1.1 菌株与质粒52.1.2 主要试剂52.1.3主要试剂配制62.1.4主要仪器设备72.1.5 主要耗材82.2 方法82.2.1 引物设计及合成82.2.2 PCR介导的定点突变92.2.3 载体的扩增102.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳及PCR产物回收112.2.5 表达质粒的构建112.2.6 工程菌株的构建122.2.7 Mutant RhoA在大肠杆菌中的表达132.2.8 大肠杆菌表达的Mutant RhoA蛋白的纯化132.2.9 Mutant RhoA蛋白分析方法14第3章 结果与讨论173.1 突变体RhoA Y42C的构建、表达与纯化173.1.1 RhoA Y42C基因的获取173.1.2载体的构建183.1.3 重组质粒构建及鉴定183.1.4 工程菌株的构建及筛选193.1.5 目的蛋白在大肠杆菌中的表达203.1.6 目的蛋白的纯化213.1.7 目标蛋白的分析鉴定243.2 突变体RhoA G17E的构建、表达与纯化263.2.1 表达质粒的构建和鉴定263.2.2工程菌株的构建和筛选273.2.3 RhoA G17E在大肠杆菌BL21(DE3)-T1R中的表达283.2.4 RhoA G17E在大肠杆菌BL21(DE3)-T1R中表达条件的优化293.2.5 RhoA G17E在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中的表达313.2.6 大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达的目的蛋白的纯化32第4章 结论与展望374.1 结论374.2 展望37参考文献39致谢41小GTPase RhoA单突变体Y42C和G17E的构建、表达与纯化第1章 绪论1.1 研究意义和背景RhoA是小G蛋白（Small G protein，又称GTPase）Rho家族中重要成员之一，因其在细胞信号通路传导过程中起到的“分子开关作用”而被广泛关注和研究1。RhoA对下游信号通路的调节调控了胚胎发生、神经发生、造血生成及成骨和肌肉生成等干细胞分化发育过程2，RhoA能够促进应力纤维运动和粘着斑的附着，而RhoA异常表达与肿瘤的发生、侵润与转移密切相关3。研究发现，当肿瘤发生启动时，活性RhoA高度表达并有效地调控高度未分化的细胞进行克隆性扩增，目前，在人类及其它哺乳动物的一些具有高度转移特性或者生长失控的癌细胞系中都发现了RhoA过量表达的现象4。胃癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一，东亚、中欧和东欧以及南非更是胃癌的高发地5。目前，全球每年新发胃癌100余万例，中国占42%，死亡70余万例中国占35%3。胃癌根据其组织形态结构、细胞生物学和病理学特性有很多分型，而其中肠型胃癌（IGC）和弥散型胃癌（DGC）是胃癌中典型的亚型。RhoA蛋白发生基因突变与DGC密切相关6。2014年Nature在线发表的一篇论文指出6，作为癌症基因组图集（The Cancer Genome Atlas，TCGA）计划工作的的一部分，学者们收集了295位原发性胃癌患者的组织和血液标本，进行了详细的分子鉴定。研究者基于对所得的大量数据的分析整理，对胃癌的分类提出了分子分类法，并分成了四类：（1）EBV感染型，其特征包括PICK3CA频发突变、DNA超甲基化和JAK2、CD274（又称PD -L1）和PDCDILG2（又称PD -L2）基因扩增；（2）微卫星不稳定型（MSI），特征为基因突变频率高，包括编码癌基因信号通路的激活性蛋白的基因突变；（3）基因组稳定型（GS），其特征包括：多发生于弥散性胃癌中，有RhoA突变发生，或者出现Rho家族GTP酶活化蛋白基因融合现象；（4）染色体不稳定型（CIN）， 特征为非整倍体和酪氨酸激酶受体的原位扩增。其中GS型约占分子样本中的20%，而 GS型中弥散型胃癌患者占73%。有研究对原发性DGC患者的癌变组织样本进行全基因组测序，发现发现RhoA突变特异性存在于DGC型胃癌中，高发突变为R5Q、R5W、G17E和Y42C7。RhoA在细胞运动方面具有重要作用，它的突变会导致肿瘤细胞呈现分散性生长，这也是弥散型胃癌的重要标志。因RhoA突变与弥散型胃癌密切相关，而弥散型胃癌是具有不良预后的典型代表，且目前全球并没有报道称已研发出针对DGC较有效的药物，肠胃癌靶点药物赫赛汀应用于弥散型胃癌的治疗时并没有取得较好的效果4。因此，把RhoA作为药物靶点研发针对弥散型胃癌的新药成为越来越多学者的共识。因生物医药研究的需要，实现RhoA的突变体蛋白商品化具有很大的潜在可能性。目前罕见商品化生产的RhoA突变体蛋白，本研究将对在弥散型胃癌中的RhoA突变较多的Y42C和G17E进行基因克隆、蛋白异源表达和纯化初步探索工作，旨在提供RhoA Y42C和G17E突变的构建、异源表达和纯化初步探索方法，为实现RhoA Y42C和G17E蛋白的商品化生产提供方法参考和依据，为以RhoA为治疗弥散型胃癌药物靶点研发新药的研究工作奠定基础。1.2 小G蛋白RhoA及其突变体的研究进展1.2.1 RhoA GTPase简介小G蛋白RhoA，即Ras homologfamily A，Ras同源性蛋白，RhoA全长193个氨基酸，分子量22 kD左右，pI 5.4，为小G蛋白Rho亚家族中重要的成员之一。Rho家族蛋白是一类分子量在20-25kD的三磷酸鸟苷结合蛋白，它们都具有GTP酶活性，因此又被称为Rho GTP酶8。与Rho蛋白相关的效应蛋白主要有三类（1）Rho GEFs（鸟苷酸交换因子），这类蛋白能够催化GDP的释放并促使Rho GTP酶结合GTP，活化Rho GTP酶；（2）Rho GAP（GTP酶活化蛋白），其作用为负向调节因子，加速Rho GTP酶的水解，使Rho GTP酶由活性状态变为无活性状态；（3）GDI（GDP解离抑制蛋白），阻止GDP从Rho GTP酶上分离，抑制Rho GTP酶活性；Rho蛋白在这三类调控因子的调控下在活性型/GTP限制型和失活型/GDP限制型构象之间循环9-12。图1-1 Rho GTP酶结合GTP激活和GDP失活循环1.2.2 RhoA结构和特点分析RhoA是结构比较保守的单体小G蛋白，从其氨基酸序列分析，RhoA的GTP酶活性相关氨基酸集中在N端，其中调控RhoA在GDP/GTP结合构象之间改变的switch1和switch2区域也集中在N端。RhoA的C端主要与蛋白在细胞内的正确定位和翻译后修饰有关。 RhoA的基因序列全长RhoA共193个氨基酸，其氨基酸序列如下：RhoA(1-181)mRNA编码序列如下：1 ATGGCTGCCA TCCGGAAGAA ACTGGTGATT GTTGGTGATG GAGCCTGTGG AAAGACATGC61 TTGCTCATAG TCTTCAGCAA GGACCAGTTC CCAGAGGTGT ATGTGCCCAC AGTGTTTGAG121 AACTATGTGG CAGATATCGA GGTGGATGGA AAGCAGGTAG AGTTGGCTTT GTGGGACACA181 GCTGGGCAGG AAGATTATGA TCGCCTGAGG CCCCTCTCCT ACCCAGATAC CGATGTTATA241 CTGATGTGTT TTTCCATCGA CAGCCCTGAT AGTTTAGAAA ACATCCCAGA AAAGTGGACC301 CCAGAAGTCA AGCATTTCTG TCCCAACGTG CCCATCATCC TGGTTGGGAA TAAGAAGGAT361 CTTCGGAATG ATGAGCACAC AAGGCGGGAG CTAGCCAAGA TGAAGCAGGA GCCGGTGAAA421 CCTGAAGAAG GCAGAGATAT GGCAAACAGG ATTGGCGCTT TTGGGTACAT GGAGTGTTCA481 GCAAAGACCA AAGATGGAGT GAGAGAGGTT TTTGAAATGG CTACGAGAGC TGCTCTGCAA541 GCT RhoA的蛋白质结构及高频突变位点分布图1-2 RhoA蛋白突变位点分布4上图为RhoA蛋白和RhoGEF的典型代表LARG蛋白的三维结构图，图中标注为本实验中。Y42C位于RhoA在其效应蛋白Rho GEFs 以及Rho GAPs作用下构象改变控制下游信号传导的功能性区域，而G17E靠近GTP酶活性中心位点4。1.3 基因体外定点突变改造蛋白定点突变（site-directed mutagenesis），是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点的核苷酸序列以到达改变所编码的氨基酸序列为目的。应用该技术，可随意在已知DNA序列中取代、插入或缺失特定的核苷酸片段，较之于传统的化学因素以及自然因素导致突变的方法具有可控性强、操作方便、突变效率高、重复性好等特点。基因体外定点突变技术，广泛应用于生物医药领域对蛋白质的改造，研究蛋白质的结构与功能。常用的定点突变方法有：盒式突变、PCR介导的定点突变、寡核苷酸引物介导的定点突变技术13。本实验采用经典PCR介导的定点突变技术，利用针对不同载体和突变位点而特异性设计的4种扩增引物，进行3次PCR反应。前两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增出两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火可形成具有3凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。再用前两次所得DNA片段以及外侧寡聚核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便可获得突变体DNA14。1.4 应用基因工程在细菌中表达目的蛋白的可行性近年来随着生物医药领域对蛋白质结构和功能的研究进一步深入，体外重组以及异源表达蛋白技术得到更广泛的应用。大肠杆菌是最先被应用于重组蛋白表达的宿主菌，也因其所特有的遗传背景研究详细透彻、培养条件简单、转化表达效率高、生产成本低、繁殖速度快而被用于大批量生产目的蛋白。目前，市场上有针对多种蛋白表达的改良大肠杆菌表达系统15。虽然大肠杆菌表达体系表达目标蛋白产量高，但也具有本身的局限性，如无转移后修饰；无法保证所表达目的蛋白完全正确折叠；含有内毒素；易形成包涵体等。大肠杆菌表达体系并不适用于所有重组蛋白的表达15。无锡佰翺得生物科学有限公司已在大肠杆菌BL21(DE3)-T1R 中成功表达并纯化出目的蛋白RhoA(1-181)。因此，本研究针对野生型RhoA(1-181)做出单个氨基酸改变后的突变体可在大肠杆菌表达系统中进行生产。1.5 研究内容及创新性1.5.1 研究内容（1） 用基因定点突变技术改造佰翺得公司现有的RhoA(1-181)基因，成功构建突变体RhoA Y42C和RhoA G17E突变体；（2） 在现有条件下，尝试构建能够稳定表达RhoA Y42C和RhoA G17E蛋白的表达质粒；（3） 在本实验室现有条件下，筛选构建目的蛋白表达的工程菌株并对其发酵条件进行 初步优化；（4） 探索实验条件允许下相应工程菌株表达的目的蛋白的纯化方案；（5） 对纯化出的蛋白取样进行Thermo Fluor分析，确定其最适缓冲液体系。1.5.2 研究创新性本研究成功构建了RhoA(1-181)两个突变位点的突变体表达质粒pET-28a(+)-His-TEV-RhoA Y42C/pRSET B-His-EK-RhoA Y42C和pET-28a(+)-His-TEV-RhoA G17E/pRSET B-His-EK-RhoA G17E。经实验发现pRSET B载体较之于pET-28a(+)载体更适合于表达RhoA突变体蛋白，这也和佰翺得公司对RhoA(1-181)表达载体选择研究结果一致。因此，本研究选择pRSET B载体构建的质粒进行蛋白表达。实验中，经过初步探索大肠杆菌BL21(DE3)-T1R表达的RhoA Y42C蛋白的纯化方案，成功纯化出可后续结晶平台需要的高纯度RhoA Y42C蛋白。并对RhoA Y42C蛋白进行Thermo Fluor分析发现其最适缓冲液体系为50 mM Tris-HCl(pH 8.0)。实验中，我们也对大肠杆菌BL21(DE3)-T1R和Rosetta2(DE3)表达的RhoA G17E蛋白的纯化分别进行了探索，发现RhoA G17E蛋白在大肠杆菌Rosetta2(DE3)表达量明显高于在大肠杆菌BL21(DE3)-T1R中的表达。5小GTPase RhoA单突变体Y42C和G17E的构建、表达与纯化第2章 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株与质粒（1）菌株：本研究所用菌株如表2-1所示：表2-1 实验所用菌株菌株（Escherichia coli）抗性生产厂家TOP10链霉素天根BL21(DE3)-T1R无抗性SigmaBL21Star(DE3)无抗性InvitrogenBL21(DE3) pLysS无抗性InvitrogenRosetta2(DE3)氯霉素Novagen（2）质粒：pET-28a(+)-His-TEV-RhoA(1-181)：带有N端6His 标签以及TEV酶切位点便于纯化蛋白，含有T7启动 子，带有野生型RhoA(1-181)基因，Kan 抗性编码序列。无锡佰翱得生物科学有限公司保藏。pRSET B-His-EK-RhoA(1-181)：带有N端6His 标签以及EK酶切位点便于纯化蛋白，含有T7启动子，带有野生型RhoA(1-181)基因，Amp抗性编码序列。无锡佰翱得生物科学有限公司保藏。2.1.2 主要试剂表2-2 实验主要试剂及其生产厂家试剂生产厂家酵母提取物Oxid 美国蛋白胨Oxid 美国无水 CaCl2Sigma 美国咪唑Sigma 美国IPTGInalco 美国琼脂BIOSHARP 韩国琼脂糖BIOSHARP 韩国氯霉素BIOSHARP 韩国卡那霉素BIOSHARP 韩国硫酸链霉素BIOSHARP 韩国GoldView赛百胜 中国DNA MarkerFermentas 加拿大氨苄青霉素BIOSHARP 韩国 续表 9试剂生产厂家DpnI Fermentas 加拿大Protein MarkerFermentas 加拿大TEV蛋白酶佰翺得生物科学有限公司（自制）EK 蛋白酶佰翺得生物科学有限公司（自制）小GTPase RhoA单突变体Y42C和G17E的构建、表达与纯化2.1.3主要试剂配制（1） 抗生素母液：氨苄西林（Ampicillin, Amp）：取一只50 mL离心管，准确称取氨苄西林5.00 g溶解于40 mL超纯水，定容至50 mL（浓度为100 mg/mL），0.22 m无菌无机滤膜过滤除菌。封口膜密封后4 oC保存。使用时稀释1000倍（工作浓度 100 mg/L）。卡那霉素：取一只50 mL离心管，准确称取5.00 g硫酸卡那霉素溶解于40 mL 超纯水，定容至50 mL（浓度为100 mg/mL），0.22 m无菌无机滤膜过滤除菌。封口膜密封后4 oC保存。使用时稀释2000倍（工作浓度50 mg/L）。氯霉素：取一只50 mL离心管，准确称取1.70 g氯霉素溶解于40 mL 无水乙醇，定容至50 mL（浓度为34 mg/mL）。封口膜密封后4 oC保存。使用时稀释1000倍（工作浓度34 mg/L）。硫酸链霉素：取一只50 mL离心管，准确称取2.50 g溶解于40 mL超纯水，定容至50 mL（浓度为50 mg/mL），0.22 m无菌无机滤膜过滤除菌。封口膜密封后4 oC保存。使用时稀释1000倍（工作浓度 50 mg/L）。（2） IPTG诱导剂母液：准确称取11.9 g IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl -D-1-Thiogalactopyr-Anoside， IPTG），加入40 mL超纯水溶解后定容至50 mL，0.22 m无菌无机滤膜过滤除菌，储存于50 mL无菌离心管，封口膜密封后 4 oC保存，使用时按照工作浓度稀释。（3） 分子克隆相关试剂配制50 TAE 电泳缓冲液母液（使用时纯水稀释至1 TAE）：Tris-Base 2 M，冰乙酸1 M，EDTA(pH8.0) 0.1 M。oC6 DNA 电泳上样缓冲液：添加1%溴酚蓝1.5 mL，0.5 M的EDTA(pH8.0) 添加0.1 mL，甘油5mL，纯水定容至10 mL。（4） SDS相关试剂配制2SDS上样缓冲液：Tris（pH 6.8）100 mM，10%的 SDS 4%（v/v），溴酚蓝0.2%，甘油20%（v/v），巯基乙醇（-ME）5% (现用现加)。10SDS电泳缓冲液母液（使用时稀释至2SDS）：准确称取Tris-Base 30.3 g，Glycine 144.2 g，SDS 10 g纯水溶解定容至1 L。（5） 培养基表2-3 LB液体培养基成分成分含量蛋白胨10 g/L酵母提取物5 g/LNaCl10 g/LLB固体培养基：在上述成分表下添加1.5%（m/v）琼脂糖。平板： 称取2 g 蛋白胨，1 g 酵母提取物，2 g NaCl，3 g琼脂粉放入200 mL水中。 灭菌：121 oC，20 min。 灭菌取出后待温度降至60-70 oC（手握可忍受30 s）时，加入相应抗生素至其工作浓度，混匀后倒平板。每个平板约需20 mL，正常可倒10个平板。 室温至凝固，密封后标清楚平板类型和时间，4 oC保存。 使用前37 oC正置预热至少30 min。2.1.4主要仪器设备表 2-4 实验主要仪器设备及其生产厂家仪器型号生产厂家国家高速离心机CR22GIIIHITACHI日本制冰机Scotsman AF100Scotsman意大利小型高速离心机MR23iEppendorf德国微型分光光度计NanoDorp ND2000Thermo美国超高速真空离心机Optima L-90KBackman美国蛋白纯化系统AKTA FPLCGE美国液相质谱联用系统6224 TOF LC/MSAgilent美国超纯水系统Milli-Q Advantage A10Millipore 美国高压细胞破碎机M-110P-20SMFIC美国超净工作台SW-CJ-1FDAirTech美国台式高速冷冻离心机Micro CL17RThermo美国电泳仪DYY-6C北京六一中国加大卧式恒温摇床SPH-211C上海 Shiping 中国电热恒温培养箱GSP-9160MBE上海智诚中国漩涡混合器VORTEX-5其林贝尔 中国智能脱色摇床KB-900其林贝尔 中国干浴微量恒温器GL-150B其林贝尔 中国灭菌锅 LDZX-50KB上海申安 中国三孔电热恒温水槽DK-8D上海一恒 中国续表仪器型号生产厂家国家琼脂糖水平电泳槽DYCP-31BN北京六一 中国聚合酶链式反应仪2720ABI 中国双层摇床ZHWY-1102C上海智斌 中国2.1.5 主要耗材表 2-5 实验主要耗材耗材生产厂家离心管（15 mL、50 mL）Corning无菌枪头（20L、200 L、1 mL、5 mL）RainingEP管（200 L、1.5 mL）Axygen无菌透气封口膜北京艾维科 无菌0.22 m滤膜Merck Millipore透气密封膜Parafilm96微孔收集板Porvair Sciences浓缩管（10 kD）Millipore质粒小提试剂盒TianGenDNA凝胶回收试剂盒TianGen2.2 方法2.2.1 引物设计及合成根据无锡佰翱得生物科学有限公司保藏的RhoA(1-181A)野生型基因作为模板，遵循引物设计的原则，利用DNAMAN软件进行引物设计。本实验所用引物如下表。表2-6 本实验中所用引物序号名称引物序列#01Insert_G17E_FFGAGCCTGTGA GAAGACATGC#02Insert_G17E_RRGCATGTCTTC TCACAGGCTC#03Insert_Y42C_FFTGTTTGAGAA CTGTGTGGCA GATAT#04Insert_Y42C_RRATATCTGCCA CACAGTTCTC AAACA#05pET-28a(+) N_His_TEV_FFGCCCTGAAAATACAGGTTTTC#06pET-28a(+) N_His_TEV_RRTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGC#07pET-28a(+) N_His_TEV_RhoA_FFGAAAACCTGTATTTTCAGGG CATGGCTGCCATCCGGAAG17 续表序号名称引物序列#08pET-28a(+) N_His_TEV_RhoA_RRGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAAGCTTGCAGAGCAGCTCTCGTA#09pRSET B_N_His_EK_FFAGG ATCCTTATC GTCATCGTC#10pRSET B_N_His_EK_RRTGATCCGGCT GCTAACAAAG C#11pRSET B_N_His_EK_RhoA_FFGACGATGAC GATAAGGATCCT ATGGCTGCCATCCGGAAG#12pRSET B_N_His_EK_RhoA_RRGCTTTGTTAGCAGCCGGATCAAGCTTGCAGAGCAGCTCTG注：引物序列加下划线为定点突变位点。所有新合成引物，均使用无菌超纯水稀释至20 M后使用。2.2.2 PCR介导的定点突变每个单突变体，以含野生型基因为模板，利用4种扩增引物进行3次PCR反应以得带有粘性末端的目的基因。（1） 反应体系1）第一次PCR反应体系（以下简称a片段）表2-7 定点突变a片段PCR 反应体系试剂用量 (L)PrimerStar HS premix25超纯水22野生型基因模板1Insert RR1Insert_Mutant FF1总体系502）第二次PCR反应体系（以下简称b片段）表2-8 定点突变b片段PCR 反应体系试剂用量 (L)PrimerStar HS premix25超纯水22野生型基因模板1Insert FF1Insert_Mutant RR1总体系503）第三次PCR反应体系（a、b片段融合PCR）表2-9 a、b片段融合PCR 反应体系试剂用量 (L)PrimerStar HS premix25超纯水21a片段回收产物1b片段回收产物1Insert FF1Insert RR1总体系50（2） 反应条件表2-10 PCR反应条件步骤温度/ oC时间/s19812029810355 29个循环104725/Kb、60/Kb542.2.3 载体的扩增选用引物列表中#5和#6引物对pET-28a(+)质粒进行PCR扩增，产物为带有平末端的线性pET-28a(+)载体片段。用#9和#10引物扩增pRSET B质粒获得带有平末端的线性pRSET B载体片段，PCR反应条件同表2-10，反应体系如表2-11。表2-11 载体扩增PCR反应体系试剂用量(L)PrimerStar HS premix25超纯水22模板1Primer FF1Primer RR1总体系502.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳及PCR产物回收（1）1%（m/v）琼脂糖凝胶的制备 根据实验需求选择适当型号的干净模具于水平试验台面上安装好。 取瓶颈带隔热套的500 mL三角瓶，加入于分析天平上准确称取 1.0 g 琼脂糖以及100 mL 1TAE缓冲液。加热，直至琼脂糖完全溶解。 待凝胶溶液温度下降至 60 oC左右，加入10 L GoldView 轻轻旋摇均匀后倒入已架好的模具槽中（检测胶厚度约为梳子齿长度一半，回收胶模具倒满 ）。等待凝胶冷却至完全凝固。（2）凝胶电泳 取凝固后凝胶沿垂直方向轻轻拔掉梳子，取出有机玻璃内槽，置于水平电泳槽中，使有加样孔的一端位于电泳槽负极（黑色）端。添加1TAE至液面没过凝胶1-2 mm左右。 在DNA样品中按体积加入6DNA loading buffer，混匀后用移液枪小心加入凝胶孔，选择适当的DNA Marker加入上样孔。 正确安装电极，打开电泳仪电源，按实验需求设定电压（100 V/200 V），开始电泳。 当溴酚蓝条带泳至凝胶三分之二位置时，结束电泳，关闭仪器电源。取出凝胶，于成像仪上观察并拍照。（3）PCR产物回收对于定点突变PCR中第一次、第二次PCR产物a、b片段以及载体扩增PCR产物要先进行DpnI酶37 oC水浴酶切消化模板再按照 TianGen的DNA 胶回收试剂盒说明书回收产物，回收的产物使用 NanoDrop 2000 测定 DNA 含量，并做好记录标注于对应离心管，保存于-20 oC。2.2.5 表达质粒的构建（1）目的片段和载体的共转化纯化后的载体和片段，按照质量比1:1来添加，且其总体积勿超过感受态细胞体积的1/10 。 取-80 oC下保存的供提质粒的感受态细胞（本实验所用感受态为TOP10感受态细胞）50 L于无菌EP管中，做好标记，置于冰上复融2-3分钟。 在超净工作台内，添加载体和片段至装载感受态细胞的EP管中，轻拨EP管底几次混匀，冰浴30 min。 42 oC热击45 s 过程中避免震动感受态细胞。 冰浴2 min。 在超净工作台内，加入450 L无菌LB培养基至感受态细胞离心管中，37 oC、220 rpm 震荡培养2 h。 离心1-2 min 后，吸取450 L上清丢弃，用移液器轻轻吹打混匀重悬菌体，全部菌液涂布于对应抗性的平板上（平板预先于37 oC生化培养箱内充分预热）。正置培养30 min，直至菌液被培养基完全吸收，倒置培养皿，37 oC恒温培养16-24 h。（2）质粒的提取质粒提取的方法按照本公司使用的 TianGen质粒小提试剂盒说明书进行提取，提取到的质粒应使用 NanoDrop进行质粒检浓度检测并记录，并标记于对应离心管中于-20 oC冰箱中保存以备使用。（3）阳性重组质粒的筛选选择几个共转化后LB平板上长出的单菌落进行菌落PCR，挑取菌落PCR阳性的单菌落做试管小剂量培养，参照上述方法进行质粒提取，利用提取的质粒做质粒PCR检测筛选阳性重组质粒。质粒PCR反应体系：表2-12 质粒PCR反应体系试剂用量 (L)PrimerStar HS premix10超纯水8.5Plasmid0.5Insert FF0.5Insert RR0.5总体系20设置质粒PCR反应条件：表2-13 质粒PCR反应条件步骤温度/ oC时间/s198120298103 29次循环55104725/Kb54对质粒PCR产物进行核酸琼脂糖凝胶电泳检测，挑选在胶图上有单一明亮条带的质粒送测序。2.2.6 工程菌株的构建取测序正确质粒转化选择的宿主菌感受态细胞转化以构建可稳定传代的工程菌株。转化 从-80 oC冰箱中取50 L每支装感受态细胞，立即置冰上解冻2-3分钟。 用移液器小心吸取表达质粒溶液1.5 L,轻轻贴壁加入感受态细胞离心管内,轻轻拨动管底混匀，冰浴30 min。 42 oC水浴中热击60 s 后迅速置于冰水浴中冷却3-5 min，过程中不可剧烈晃动。 向EP管中加入450 L不含抗生素的无菌LB液体培养基，混匀后37 oC振荡培养1 h左右，使已成功转化的感受态细胞恢复生理活性，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 取50-100 L上述震荡培养的菌液涂布于抗性筛选平板上（平板预先于37 oC生化培养箱内充分预热），正置培养30 min，直至菌液被培养基完全吸收，倒置培养皿，37 oC恒温培养16-24 h。2.2.7 Mutant RhoA在大肠杆菌中的表达（1）目的蛋白表达小试以及菌种保藏 于超净工作台中，用无菌枪头挑取适量转化于LB平皿上培养出的工程菌株单菌落于装有5 mL 无菌 LB液体培养基的试管中，连枪头一起加入试管中。加入对应抗生素至工作浓度。 37 oC、220 rpm 震荡培养约3 h，OD600达到0.6-0.8左右时，超净工作台中，取适当量（OD600=5）的菌体，离心弃上清保存作为诱导前样品。取900 L,菌液1.5 mL无菌EP内添加100 L无菌甘油做好标记保藏于-80 oC冰箱内。向试管中剩余菌液添加IPTG至工作浓度。继续37 oC、220 rmp培养。 诱导3 h后，测定菌体 OD600，取适当量（OD600=5）的菌体，离心弃上清，作为诱导后样品。 每个样品添加 38 L上样缓冲液(SDS Loading Buffer)，充分重悬后，98 oC干热加热 10 min，13000g离心力 离心 2 min 即得到处理好的样品。（2）菌种小瓶扩大培养取出-80 oC保藏的菌种，室温复苏，待菌液融化，接种40 L于装有200 mL无菌LB液体培养基的500 mL三角瓶中，添加对应抗生素至工作浓度。透气封口膜封口后于37 oC卧式摇床220 rmp过夜培养。（3）目的蛋白大量诱导表达 接种小瓶培养后的菌液24 mL于装有1.2 L培养基的3 L三角瓶（已灭菌）中 ,添加对应抗生素至工作浓度。透气封口膜封口，37 oC，110 rmp恒温卧式摇床培养。 菌体生长至OD600约为0.6-0.8时取诱导前样品，降温至15 oC添加IPTG至终浓度0.5 mM低温诱导过夜。 次日取诱导后样品，发酵菌液3800 rmp离心收集菌体并冻存于-80 oC冰箱，用于后续蛋白纯化。2.2.8 大肠杆菌表达的Mutant RhoA蛋白的纯化为保证蛋白活性，以下纯化实验均需要在4 oC低温条件下进行。（1）细胞破碎 本实验细胞破碎采用Microfluidic公司的高压均质机进行细胞破碎，操作方法如下。 根据菌体重量选取适当烧杯准确称量收集冻存的菌体质量，按照 1:5 (m/v)添加预冷的 Lysis Buffer（50 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl，5%（v/v）甘油），轻轻加入搅拌转子，置于 4 oC冷藏柜中放置的搅拌器上搅拌重悬至形成均一菌液。 用微孔滤网过滤搅拌均匀的菌悬液，以避免大颗粒物损坏均质机。 补充均质机出口区域的冷却冰，开启均质机电源，调整适当的压力。 纯水洗去管路中的乙醇，再用 Lysis Buffer 冲洗和平衡均质机管路。 将重悬的菌液倒入均质机进样口，出口处冰浴烧杯收集破碎后的液体。 取样做 “TNS”测试。 根据实验需要重复破碎次数以提高菌体破碎率。 洗净承接杯，纯水冲洗管路后乙醇冲洗管路并液封管路后关闭电源。（2） 镍柱亲和层析纯化本实验采用的是His Trap FF亲和层析柱，用500 mM/L 咪唑充分对待用Ni亲和柱进行充分洗杂，去除残留在亲和树脂上的杂蛋白；平衡缓冲液Binding Buffer（50 mM Tris-HCl pH8.0，500 mM NaCl，5%（v/v）甘油）平衡亲和柱约10倍于柱体积；以适当流速将离心收集到的可溶菌体裂解粗提物载入到Ni亲和柱中收集流出液(FlowThrough, FT)；Wash Buffer（50 mM Tris-HCl pH8.0，50 mM NaCl，5%（v/v）甘油）洗涤，收集洗涤流出液(W)；Buffer B(50 mM Tris-HCl pH8.0，50 mM NaCl，500 mM 咪唑，5%（v/v）甘油)梯度洗脱目的蛋白，50 mL离心管收集。（该操作于GE AKTA FPLC 蛋白纯化系统进行，详见GE AKTA FPLC操作手册）。（3） 离子交换本实验采用的是GE离子交换层析柱Mono Q 10/100GL。用高盐洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，1 M NaCl，5%（v/v）甘油）对离子交换柱进行洗杂；再用低盐缓冲液（50 mM Tris-HCl pH8.0，50 mM NaCl，5%（v/v）甘油）平衡至基线走平；将得到的待纯化目的蛋白洗脱液装入上样管载入到离子交换柱上，50 mL EP管收集流出液(FlowThrough, FT)；采用线性洗脱，20 CV高盐洗脱液，0%-20%线性洗脱；96孔板收集洗脱流出液。（4） 疏水相互作用层析 本实验采用的是HiTrap Phenyl HP疏水层析柱。用Buffer B（5%甘油，50 mM Tris-HCl pH8.0）对疏水层析柱洗杂；Buffer A(1 M硫酸铵，50 mM Tris-HCl pH8.0，5%甘油)，平衡柱至UV基线走平；50 mL Loop管上样，50 mL EP管收集流出液(FlowThrough, FT)；上样结束后用20 CV Buffer B，0%-100%线性洗脱，96孔板收集流出液。（5） 凝胶过滤色谱本实验采用的是Hiload 16/60 Superdex 75分子筛。用10 mM HEPES (pH7.5)，50mM KCl，0.5 mM MgCl2，1 mM TCEP的缓冲液充分平衡凝胶过滤色谱柱；将收集的待纯化目的蛋白洗脱液浓缩至1 mL以下，用loop环上样；再用平衡缓冲液洗脱，96孔板收集紫外检测洗脱峰。 2.2.9 Mutant RhoA蛋白分析方法（1）蛋白表达及菌体生长状况分析使用分光光度计检测 OD600 吸光值以获知菌体菌体生长情况，以LB 培养液作为空白对照对仪器进行校准。在超净工作台上，取菌体培养液至 1 cm 干净比色皿中并适当稀释待测样品，使读数在0.30.7范围结果更可靠，清洗比色皿，记录读数和稀释倍数。对蛋白表达小试所得诱导前后样进行SDS电泳，分析目的蛋白有无表达。（2）SDS电泳1) 制胶表2-1412%分离胶成分/2块成分使用量 (mL)纯水3.330%丙烯酰胺溶液4.01.5 M Tris（pH 8.8）2.510% SDS0.110% AP0.1TEMED0.004表2-15 5%浓缩胶成分/2块成分使用量 (mL)纯水2.730%丙烯酰胺溶液0.671.0M Tris（pH 6.8）0.510% SDS0.0410% AP0.04TEMED0.004按上述成分表根据SDS制胶说明书制胶。2) 电泳 取凝固的 SDS胶置于电泳支架上，短玻璃一面向内，卡紧后置于电泳槽内，向支架中间添加电泳缓冲液，内侧没过上样孔，外侧没过电极。拔掉梳子，用针头拨正上样孔。 用移液器吸取样品和Protein Marker 点在上样孔中，未点样品的泳道添加 Loading Buffer以使两侧电泳条带有较好同步。 加盖，设定电泳时间 35 min，连接线路以恒定 200 V 电压开始电泳。 待电泳结束，关闭电泳仪电源，取出电泳架。 3) SDS胶染色脱色 轻轻剥开玻璃板，取出蛋白胶置于脱色平皿中，加去离子水 200 mL 微波炉高