谷胱甘肽S转移酶mu5对肿瘤坏死因子α诱导人支气管上皮细胞氧化损伤的调节作用研究

谷胱甘肽S转移酶mu5对肿瘤坏死因子诱导人支气管上皮细胞氧化损伤的调节作用研究【摘要】 目的 建立肿瘤坏死因子（TNF-）诱导支气管上皮（16HBE）细胞炎症模型，探讨谷胱甘肽S转移酶mu5（GSTM5）在炎症诱导的氧化应激损伤中的作用。方法 以TNF-（10 ng/mL）刺激16HBE细胞，运用真核细胞表达载体技术，增强GSTM5基因表达，比色法检测细胞内丙二醛（MDA）及总抗氧化能力（T-AOC）；MTT法检测细胞存活率；RT-PCR法检测NADPH氧化酶（NOX）家族NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、双重氧化酶1（DUOX1）、DUOX2相关基因转录水平；蛋白质印迹法检测NOX1和NOX2蛋白表达水平。结果 TNF-刺激16HBE细胞后，细胞内MDA水平增高，T-AOC能力减低，细胞存活率明显降低。预转染GSTM5质粒可有效降低TNF-诱导的细胞内MDA的增高（P0.05），显著增强T-AOC能力（P0.05），同时增加16HBE细胞存活率（P0.05）。GSTM5质粒组NOX1、NOX2基因转录强度以及蛋白表达水平与TNF-组及阴性对照组相比显著降低（P均0.05）。结论 增强GSTM5表达对炎症诱发的肺上皮细胞的氧化应激损伤有保护性调节作用，其机制与下调NOX1、NOX2基因表达密切相关。【关键词】 谷胱甘肽S转移酶mu 5；真核细胞表达载体；氧化应激；炎症急性肺损伤（ALI）的本质是肺内过度失控的炎症反应1-2。过度炎症反应引发氧化应激状态3，诱导细胞内源性活性氧（ROS）的生成量剧增，超过机体抗氧化系统的清除能力时，使机体处于氧化应激状态，直接导致肺结构细胞损伤4-5，并且与炎症损伤协同加重病情6。因此，下调炎症激活的过度氧化应激可能有助于减轻肺结构细胞的损伤。谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase，GST）是一组具有多种功能的催化氧化还原反应的酶，与其他抗氧化酶在细胞内共同起到清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤的作用7。谷胱甘肽S转移酶mu 5（GSTM5）是GST家族的成员，关于GSTM5在ALI时炎症诱发的氧化应激过程中的作用研究不多。本研究以代表性的炎症因子肿瘤坏死因子（TNF-）刺激人支气管上皮细胞，在细胞上模拟ALI时的炎症过程，并观察其氧化应激程度的变化；同时，利用真核细胞表达载体技术增强表达人支气管上皮16HBE细胞的GSTM5基因，探讨该基因在TNF-诱导的人支气管上皮细胞氧化损伤中的作用及可能的机制，为ALI综合治疗提供实验依据。材料与方法一、材料16HBE细胞由广州军区总医院医学实验科细胞库提供；北美胎牛血清购于广州博仁生物科技有限公司；RPMI-1640培养基、胰酶购于Hyclone公司；重组人TNF-购自美国Pepro Tech公司；GSTM5-GV230-GFP质粒由上海吉凯基因技术有限公司构建；转染试剂Lipofectamine2000TM购自Invitrogen公司；总抗氧化能力（T-AOC）活性检测试剂盒及脂质氧化丙二醛（MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA法蛋白浓度测定试剂盒、MTT试剂盒购自江苏碧云天公司；逆转录试剂购自TaKaRa公司；PCR试剂购自北京康为世纪公司；引物由上海英潍捷基公司合成；NADPH氧化酶（NOX）家族NOX1和NOX2抗体购自美国abcam公司；-actin抗体购自武汉博士德公司。二、方法1细胞培养：16HBE细胞在含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 、5% CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养，23 d传代1次，取处于对数生长期的细胞用于实验。2模型构建及实验分组：将细胞以2105个/mL接种于6孔板，待贴壁细胞融合度达到70%更换为含GSTM5-GV230-GFP质粒脂质体（1 g/mL）的无血清、无抗生素培养基培养6 h后，更换为完全培养基，待细胞状态恢复良好后更换为含TNF-（10 ng/mL）的无血清、无抗生素培养基继续培养，24 h后收取培养细胞标本备检。实验分为4组：空白对照组（不加干预因素），TNF-组（仅用TNF-刺激），GSTM5质粒组（预转染GSTM5-GV230-GFP质粒且用TNF-刺激），阴性对照组（预转染空质粒且用TNF-刺激）。3分光光度法检测细胞脂质氧化程度（MDA含量）：采用玻璃匀浆器匀浆裂解细胞，BCA法定量蛋白浓度，按试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于532 nm测定各样本吸光度，测得各样本的MDA含量后，除以样本的总蛋白含量，即“nmol/mg pro”来表示MDA水平。4分光光度法检测细胞T-AOC：采用玻璃匀浆器匀浆裂解细胞，BCA法定量蛋白浓度，按试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于520 nm测定各样本吸光度，测得各个样本T-AOC后，再除以样本的总蛋白含量，即“U/mg pro”来表示T-AOC水平。5MTT比色法检测细胞存活率：将细胞以1104个/mL接种于96孔板，按上述分组进行转染和TNF-干预后继续培养24 h，终止培养前4 h每孔加入10 L MTT溶液（5 mg/mL），终止培养时加入100 L Formazan溶解液，待紫色结晶完全溶解，酶标仪测定各孔吸光度（A）值（570 nm）。细胞存活率=实验组/对照组100%。6RT-PCR法检测NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、双重氧化酶1（DUOX1）、DUOX2 mRNA的表达水平：Trizol法裂解各组细胞并提取细胞总RNA，分光光度计检测RNA浓度及纯度，逆转录反应体系（20 L）：5酶混合物4 L，RNA 1 g，RNAase Freed H2O补足至总体系20 L。逆转录条件：37 ，15 min；85 ，5 s。PCR反应体系（25 L）：2含染料酶混合物12.5 L，NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2及-actin上下游引物各0.5 L（共1.0 L），逆转录产物模板2 L，超纯水9.5 L。PCR反应条件：94 5 min，94 30 s、* 30 s、72 30 s（循环35轮），末次72 延伸10 min。取5 L产物进行1.0%琼脂糖电泳，应用凝胶成像系统拍照。采用Gel-Pro analyzer 32软件分析电泳条带灰度值，计算目的基因与-actin的比值以表示目的基因mRNA的相对表达量。相关引物序列见表1。表1 引物序列及退火温度引物名称引物序列产物大小（bp）退火温度（）NOX15-CTGGGTGGTTAACCACTGGTTT-3553525-ACCAATGCCGTGAATCCCTAAG-3NOX25-CTGGGGTTGAACGTCTTCCTCTT-3508625-ATATGAGGCACAGCGTGATGACA-3NOX35- GAGAGACTGTCTTGGGTTGG-3683555- ACTCCTCCTCTTCATACCAGTAG-3NOX45-CAGGAGGGCTGCTGAAGTATCAA-3303575- TGACTGGCTTATTGCTCCGGATA-3NOX55-CAATGAGAAAGAGTCAAAGGTCGT-3156605- CGATGCCTGCCCCGAT -3DUOX15- GCAGGACATCAACCCTGCACTCTC-3672655- CTGCCATCTACCACACGGATCTGC-3DUOX25- CCGGCAATCATCTATGGAG-35- CCGGCAATCATCTATGGAG-354655-actin5-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3457515-GTCTTTACGGATGTCAACG-37蛋白质印迹法（Western blot）检测NOX1、NOX2蛋白的表达水平：分别提取各组细胞总蛋白，BCA法蛋白定量后，每份样品取50 g蛋白与5SDS上样缓冲液充分混匀，经95 5 min变性后进行10% SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉37 封闭1 h，以TBST洗膜3 次，10 min/次，分别取一抗（抗体稀释浓度：NOX1抗体1100，NOX2抗体11 000，胞浆蛋白内参-actin抗体1400）4 孵育过夜，以TBST洗膜3次，10 min/次，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗（12 000）37 孵育1 h，以TBST洗膜3次，10 min/次，ECL发光，MINICHEMI化学发光仪曝光。采用Gel-Pro analyzer 32软件进行图像灰度分析，分别计算NOX1、NOX2蛋白与-actin的灰度比值，以表示NOX1、NOX2蛋白的相对表达量。三、统计学处理应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以s表示。数据均进行方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐时多重比较采用LSD检验法，方差不齐时多重比较采用Dunnetts T3检验法，P0.05为差异有统计学意义结 果一、细胞脂质氧化程度TNF-组16HBE细胞MDA水平较空白对照组显著上调（1.970.26）nmol/mg pro比（0.940.17）nmol/mg pro，P0.05）。GSTM5质粒组MDA水平较TNF- 组和阴性对照组显著下调（1.530.17）nmol/mg pro比（1.970.26）nmol/mg pro和（2.080.07）nmol/mg pro，P0.05，仍高于空白对照组（1.530.17）nmol/mg pro比（0.940.17）nmol/mg pro，P0.05）。结果见图1。二、细胞内总抗氧化能力TNF-组T-AOC较空白对照组降低（1.300.14）U/mg pro比（1.920.29）U/mg pro，P0.05）。GSTM5质粒组T-AOC较TNF-组和阴性对照组显著上调（3.780.42）U/mg pro比（1.300.14）U/mg pro和（1.280.21）U/mg pro，P0.05。结果见图1。与TNF-组及阴性对照组比较，*P0.05图1 GSTM5高表达对16HBE细胞MDA和T-AOC水平的影响（n=3，s）三、细胞存活率测定TNF-组细胞存活率较空白对照组显著下调（56.31%4.33%比99.20%3.79%，P0.05）。GSTM5质粒组细胞存活率较TNF-组、阴性对照组显著升高（69.15%9.23%比56.31%4.33%和56.1%5.22%，P0.05），较空白对照组仍有明显降低（69.15%9.23%比99.20%3.79%，P0.05）。结果见图2与TNF-组和阴性对照组比较，*P0.05图2 GSTM5高表达对16HBE细胞存活率的影响（n=5，s）四、氧化相关基因转录水平的变化RT-PCR的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后进行灰度分析，TNF-组NOX1、NOX2 mRNA表达水平较空白对照组明显增高（P0.05）。GSTM5质粒组较TNF-组和阴性对照组显著降低（P0.01），NOX2 mRNA表达水平仍高于空白对照组（P0.05）。TNF-组16HBE细胞NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表达水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（P0.05），GSTM5质粒组16HBE细胞NOX3，NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表达水平与TNF-组、阴性对照组、空白对照组比较，差异无统计学意义（P0.05）。结果见表2、图3和图4。表2 各组细胞NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表达水平（n=3，s）组别NOX1NOX2NOX3NOX4NOX5DUOX1DUOX2空白对照组0.570.020.540.060.470.020.400.160.570.190.380.120.360.12TNF-组0.750.020.970.040.540.010.470.210.660.270.490.170.430.12GSTM5质粒组0.610.08*0.680.06*0.510.050.420.180.660.240.480.180.430.12阴性对照组0.780.050.950.020.530.030.500.250.690.290.510.160.440.13注：与TNF-组和阴性对照组比较，*P0.01 与TNF-组和阴性对照组比较，*P0.05 图4 GSTM5高表达对NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA转录水平的影响五、NOX1、NOX2蛋白水平的变化Western blot结果经灰度值分析后显示：TNF-组16HBE细胞NOX1、NOX 2蛋白表达较空白对照组明显上调（0.990.05比0.60 0.08，1.03 0.13比0.66 0.12，皆P 0. 05）。GSTM5质粒组16HBE细胞NOX 1、NOX2蛋白表达水平较TNF-组和阴性对照组降低（0.71 0.10比0.990.05、1.00 0.10，0.720.11比1.03 0.13、1.040.20，皆P 0. 05）。结果见图5。与TNF-组和阴性对照组比较，*P0.05图5 GSTM5高表达对NOX1和NOX2蛋白水平的影响讨 论炎症反应往往伴随氧化应激，并且富含脂质的肺脏是过度氧化应激首先打击的靶器官8。有研究表明，在ARDS患者的支气管肺泡灌洗液中检出肺内皮细胞、肺泡细胞、气道上皮细胞及肺泡巨噬细胞等产生的大量ROS，这些ROS可以通过改变基因和蛋白表达而影响ALI的发生和发展9。因此，针对ALI患者的肺组织保护，需要适当减少ROS的产生，减轻ROS对结构细胞的损伤。GST具有谷胱甘肽过氧化物酶活性，亦被称为非硒谷胱甘肽过氧化物酶（non-SeGPx），通过在分子之间转巯基而发挥抗氧化活性，并因此具有修复遭到氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能，保护细胞免受氧化损伤7。GSTM5是GST家族的一个亚型。本研究小组前期对炎症诱发的氧化应激调控的研究发现，GSTM5与NOX1启动子间可能存在着相互作用10，这引起了我们对GSTM5的关注。GSTM5的抗氧化作用是其影响病理生理过程的机制之一，但关于GSTM5在ALI时炎症诱发的氧化应激过程中作用的研究不多。因此，本研究采用TNF-刺激人支气管上皮16HBE细胞，在体外模拟ALI时肺结构细胞的炎症损伤过程；同时应用真核细胞表达载体技术，观察GSTM5对炎症诱发的肺结构细胞氧化应激损伤的调节作用。氧化应激时体内高活性分子如ROS产生过多，造成肺结构细胞氧化损伤，加重急性肺损伤11。MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终代谢产物，其浓度可反映自由基对组织细胞的损伤程度5，12-13。T-AOC是一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平，其水平反映了体系总抗氧化能力。本研究结果显示，单纯以TNF-刺激16HBE细胞，MDA浓度较空白对照组明显升高（P0.05），T-AOC能力降低（P0.05），且细胞存活率下降（P0.05）。这说明TNF-在其诱导的细胞炎症过程中诱发了氧化应激反应和细胞的氧化损伤。GSTM5质粒转染组的MDA浓度较TNF-组降低（P0.05），T-AOC能力显著增高（P0.05），细胞存活率回升（P0.05）。这提示增强GSTM5表达可有效下调炎症反应诱发的氧化应激，减轻肺结构细胞的损伤，起到保护性的调控作用。产生氧化损伤的关键是氧化酶的活化，有研究显示NOX酶家族在ALI发生发展中发挥了重要作用14-15。本研究通过RT-PCR和Western blot检测，发现TNF-组NOX酶家族成员中的NOX1、NOX2基因的转录强度及蛋白表达水平较空白对照组有不同程度的增高（P0.05），表明其参与了炎症诱导的氧化损伤；而预转染GSTM5质粒可有效下调上述基因的转录强度及蛋白表达水平（P0.05）。以上结果提示GSTM5减轻氧化应激对肺结构细胞的损伤作用可能与下调NOX1、NOX2基因表达密切相关。综上所述，继发于炎症反应的氧化应激是肺结构细胞破坏的重要因素。GSTM5具有抗氧化能力，对炎症诱发的支气管上皮细胞的氧化应激损伤有保护作用，其机制可能与下调NOX1、NOX2基因表达，从而减少氧自由基的生成密切相关。本研究为ALI的综合治疗提供有益的启示。参考文献1 Prabhakaran P，Usatyuk PV，Gorshkova IA，et al. 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