豆芽中植物生长调节剂的测定（BJS 201703）

22 附件 3 豆芽中植物生长调节剂的测定 01703 1 范围 本 方法 规定了豆芽中 11种植物生长调节剂的高效液相色谱 本 方法 适用于 豆芽 中 64霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸 、2,44戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑和噻苯隆 的检测。 2 原理 试样经 含 1%甲酸 的 乙腈溶液匀浆提取，脱水，离心后，上清液经分散固相萃取净化， 用 高效液相色谱 标法定量。 3 试剂和材料 除另有规定 外 ，本方法所用试剂均为分析纯 ， 水为 6682 规定的一级水。 剂 醇：色谱纯。 腈：色谱纯。 酸：色谱纯。 酸铵：色谱纯。 水硫酸镁。 水乙酸钠。 八烷基键合硅胶吸附剂（ 粒径范围为 40 m 60 m。 剂配制 1%甲酸的乙腈溶液：量取 10 酸，加乙腈稀释至 1000 匀。 酸的 5 乙酸铵溶液：称取 g 乙酸铵，用水溶解并稀释至 1000 入 1 酸，混匀。 准品 64霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2,44戊烯腺 嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆标准品，纯度均 90%。 标准品的中文名称、英文名称、 录号、分子式、相对分子质量详见附录 A 中的表 23 准溶液的配制 物生长调节剂标准储备液（ 1 mg/精密称取 64霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2,44戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆标准品（ 10 别置于 10 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度 各 为 1 mg/准贮备液， 保存。 合标准中间液 A（ 10 g/分别精密量取 11 种植物生长调节剂标准储备液 （ 1 mg/ （ 1 于同一 100 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度 均 为 10 g/。 合标准中间液 B（ 1 g/精密量取混合标准中间液 A（ 10 g/ 1 于 10 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度 均 为 1 g/。 白基质提取液：称取空白试样各 10.0 g（精确至 g），分别置于 50 塞离心管中，自 “加入 20 1%甲酸的乙腈溶液 ”起与样品同法处理（ 作为空白基质提取液。 质混合标准工作溶液：分别精密量取混合标准中间液 B（ 1 g/ 0 L、 10 L、20 0 L，及混合标准中间液 A（ 10 g/ 10 L、 15 0 L，用空白基质提取液（ 容至 1.0 为基质混合标准工作溶液 度依次为 0 ng/0 ng/20 ng/40 ng/100 ng/150 ng/ 200 ng/依需要配制适当浓度的基质混合标准工作溶液。临用新制。 4 仪器和设备 效液相色谱 有电喷雾离子源 （ ） 。 旋混合器。 心机：转速 10000 r/ 子天平：感量分别为 g。 吹浓缩仪。 速匀浆机。 塞离心管： 50 15 心管 ： 内含 300 水 硫酸镁 和 100 18。 孔滤膜： 孔径为 m 有机相型 微孔滤膜 。 5 试样制备与保存 将豆芽切碎后用组织粉碎机充分粉碎混匀，均分成两份，作为试样和留样，分别装入洁净容器中，密封并标记 ， 于 保存。 24 6 测定步骤 取 准确称取 10.0 g（ 精确至 g） 试样置于 50 塞离心管 （ 中，加入 20 1%甲酸 的 乙腈溶液 （ 高速匀浆 2 入 4 g 无水 硫酸镁 （ 和 1 g 无水 乙酸钠 （ 立即 涡 旋 混合 1 10000 r/心 5 化 精密量 取上 层乙腈溶液 4 于 心管（含 300 水 硫酸镁 和 100 18）（ ，涡 旋 混合 2 以 14000 r/心 5 移取全部上清液于 15 心管 （ 中 ， 于 45 水浴中 氮吹至近干，用甲醇定容至 1 旋 混匀 1 以 14000 r/心 5 清液经 m 有机相滤膜（ 滤后， 取 续滤液供高效液相色谱 谱测定 相色谱 相色谱条件 a) 色谱柱： ， 100 3.0 粒径 m， 或性能相当者 。 b) 流动相 ： A 为 含 酸的 5 乙酸铵溶液（ ， B 为 甲醇。梯度洗脱程序见表 1。 c) 流速： 300 L/ d) 柱温： 35 。 e) 进样量： 5 L。 表 1 梯度洗脱程序 时间 (流动相 A(%) 流动相 B(%) 5 5 5 5 0 10 0 80 0 80 5 5 5 5 谱条件 a) 离子源：电喷雾 离子源（ ） 。 25 b) 检测方式： 多反应监测 （ 。 c) 扫描方式： 64霉素、 2,44戊烯腺嘌呤、氯吡脲、噻苯隆 采用负离子模式扫描 ； 吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑 采用正离子模式扫描 。 d) 雾化气（ 气帘气（ 辅助气（ 碰撞气（ 为高纯氮气或其他合适气体 ， 使用前应调节 相应参数 使质谱灵敏度达到检测要求， 参考条件 详见附录 B。 e) 电喷雾电压（ 碰撞电压（ 去簇电压（ 碰撞室入口电压（ 碰撞室出口电压（ 等参数使用前 应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子 对 等信息详见附录 B 中的表 准工作曲线制作 将基质混合标准工作溶液（ 仪器参考条件（ 行测定。以基质混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。 性 测定 在相同 试验 条件下 测定试样和 基质混合 标准工作溶液，记录试样和标准 工作 溶液中植物生长调节剂的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子的相对 离子 丰度。 若 试 样中检出与 基质混合 标准 溶液 （ 中植物生长调节剂 保留时间一致的色谱峰 ， 且 其 定性离子 与浓度相当的标准溶液 中 相应的 定性离子 的 相对丰度 相比， 偏差不超过表 2规定的范围， 则 可以确定试样中检出 相应 植物生长调节剂。 表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 （ %） 50 20 50 10 20 10 允许的相对偏差 （ %） 20 25 30 50 量测定 若 试样 检出与 基质混合 标准 工作 溶液一致的植物生长调节剂， 根据标准 工作 曲线 按外标法以峰面积 计算 得到 其 含量 。 空白样品加标试样 参考 色谱图见附录 C 中 的图 白试验 除不加试样外，均按 试样同法 操作。 26 7 结果 计算 结果按式（ 1） 计算 ： . (1) 式中： X 试样中各待测 组分 的含量，单位为微克每千克（ g/； c 从标准 工作 曲线中读出的供试品溶液中各待测 组分 的浓度， 单位为纳克每毫升 （ ng/； V 试样溶液 最终定容体积，单位为毫升（ ； f 试样 制备过程中的稀释倍数，本方法中为 5； m 称样量 ，单位为克（ g）。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 8 检测方法的灵敏度、准确度、精密度 敏度 本方法中 64霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2,44戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、 噻苯隆检出限 均 为 5 g/量限均为 10 g/ 确度 本方法在 10 100 g/加浓度范围内，回收率为 60% 120%。 密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20%。 27 A A 附录 A 11 种植物生长调节剂的化合物相关信息 表 11 种化合物 的 中文名称、英文名称、 录号、分子式、相对分子质量 序号 中文名称 英文名称 分子式 相对 分子 质 量 1 赤霉素 719 6621412 吲哚乙酸 710 噻苯隆 17079 2,42,448 44228 氯吡脲 815712 多效唑 673815 吲哚丁酸 333120 440581 异戊烯腺嘌呤 36510 28 B B 附录 B 参考 质谱条件 1）负离子模式扫描质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源 （ ） ； b) 检测方式：多反应监测 （ ； c) 电喷雾电压 （ ： （ ； d) 气帘气 （ ： 20 L/ e) 雾化器 （ ： 45 L/ f) 辅助气压力 （ ： 35 L/ g) 离子源温度 （ ： 500 。 表 离子模式下 8 种植物生长调节剂定性、定量离子 对 和质谱分析参数 序号 分析物 离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 口电压 V 出口电压 V 1 6 31 6 80 9 76 9 赤霉素 33 12 78 8 70 10 2,4 16 26 34 6 21 12 4 22 9 39 6 噻苯隆 16 15 51 15 46 13 氯吡脲 11 14 40 3 异戊烯腺嘌 呤 23 10 58 10 70 10 4 16 22 46 8 定量离子对。 29 2）正离子模式扫描质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ ）； b) 检测方式：多反应监测（ c) 电喷雾电压（ 5500 V（ ； d) 气帘气（ 20 L/ e) 雾化器（ 45 L/ f) 辅助气压力（ 35 L/ g) 离子源温度（ 500 。 表 离子模式下 3 种植物生长调节剂定性、定量离子对和质谱分析参数 序号 分析物 离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 口电压 V 出口电压 V 1 多效唑 38 52 12 13 52 52 12 8 2 吲哚乙酸 60 20 10 8 8 46 10 8 3 吲哚丁酸 53 15 9 15 8 30 7 10 6 30 7 15 *定量离子对。 注 ：附录 B 所列参考质谱条件仅供参考，当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。 30 C C 附录 C