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尼古丁对小鼠骨髓细胞微核影响的实验研究 【摘要】目的：探讨香烟成分尼古丁对骨髓细胞微核产生的影响。方法：建立小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验模型，将小鼠随机分为尼古丁（低、中、高剂量）实验组、顺铂对照组、乙醇对照组、生理盐水对照组，每组10只，采用腹腔注射给药，油镜下检测骨髓中嗜多红染细胞（PCE）微核情况及绘制量效关系曲线。结果：尼古丁低剂量组和乙醇对照组的微核发生率分别为（1.900.88）%和（0.700.22）%，两组间有显著差异（P95%，临用前用生理盐水溶解。 1.2 方法 1.2.1 香烟尼古丁溶液制备:取香烟3支，剥出烟丝并全部投入索式提取器的套筒中，在75 ml 95%的乙醇中连续加热虹吸2.5 h，虹吸6次后停止。分别记录第一次及最后一次的虹吸时间。虹吸结束后把装置改为蒸馏装置，记录蒸馏的时间，馏头77 ，蒸出大部分乙醇，再用25%乙醇75 ml溶解残留物。 1.2.2 动物分组及处理:按照成人重度吸烟者吸烟20支/天计算，小鼠每天吸0.01支，再根据染毒所配制溶液的浓度3支/75 ml，0.25 ml稀释液即含0. 01支香烟。将小鼠随机分为6组，每组10只。尼古丁低剂量组：小鼠腹腔注射尼古丁溶液（稀释3倍的原溶液）0.25 ml；尼古丁中剂量组：小鼠腹腔注射尼古丁溶液（稀释2倍的原溶液）0.25 ml；尼古丁高剂量组：小鼠腹腔注射尼古丁溶液（稀释1倍的原溶液）0.25 ml；顺铂对照组：小鼠腹腔注射顺铂（0.25 mg/kg）；乙醇对照组：小鼠腹腔注射等量的25%乙醇；生理盐水对照组：小鼠注射等量生理盐水。采用两次染毒法：处死前30 h以及处死前6 h分别染毒1次。最后一次染毒后6 h，将小鼠以颈椎脱臼法处死，取骨髓，制备骨髓切片，常规染色。每只动物油镜下观察1000个嗜多染红细胞（PCE），记录含有微核的PCE细胞数，并计算骨髓嗜多染红细胞微核率（MNPCE），以百分率表示。 1.2.3 观测指标:电子显微镜油镜下观测骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核形成情况。PCE呈灰蓝色、成熟红细胞呈橘黄色。观察嗜色性与核质一致的圆形或椭圆形的微小核，其独立于主核，为主核1/201/3大小。 1.2.4 统计分析:应用SPSS 13. 0统计软件进行卡方检验进行统计学分析处理。 2 结果 2.1 小鼠骨髓PCE微核形成: 骨髓涂片油镜示：细胞密度适中，可观察到多个嗜多染红细胞（PCE），有1个微核的多见，出现2个及2个以上微核的偶见（图1）。 2.2 尼古丁量效关系:尼古丁低剂量组和乙醇对照组的微核发生率分别为（1.900.88）%和（0.700.20）%，两组间有显著差异（P0.05），见表1。尼古丁在低、中、高不同剂量下，对小鼠骨髓细胞体内染毒后，骨髓嗜多红细胞的微核率（MNPCE）分别为（1.900.88）%，（4.130.85）%，（9.802.10）%，与乙醇对照组（0.700.20）%相比均有明显差异（P0.05），且存在着明显的剂量效应关系（图2）。 表1 各组骨髓中红细胞微核的出现率（%） 注：*P0.05 vs 对照组 3 讨论 尼古丁是吸烟成瘾的主要物质，具有兴奋中枢与提神的作用。进入人体后，会产生四肢末梢血管收缩、呼吸心跳加快、血压升高、精神状况改变，同时也是造成高血压、中风等心血管性疾病的主要帮凶。一旦长期停止吸烟，就会出现烦躁焦虑、注意力分散、情绪低落等戒断症状。微核实验就是利用细胞生物学方法来检测细胞遗传损伤程度的一种遗传毒物的方法，微核的形成作为染色体损伤、基因不稳定性甚至患癌风险的一种生物标志物也已被广泛的应用。本研究采用香烟毒性成分尼古丁进行体内骨髓细胞染毒，结果尼古丁低剂量组骨髓细胞微核率与乙醇对照组相比有明显的差异（P0.05），说明香烟成分尼古丁对微核率有明显影响。同时摄取尼古丁低剂量组与顺铂组微核照片，为说明香烟成分尼古丁的细胞毒性提供了形象有力的微观水平的证据。进一步采用尼古丁的不同剂量组染毒小鼠，其MNPCE率分别与乙醇对照组相比有明显的差异（P0.05），说明在量效关系上，有诱发小鼠MNPCE率增加的作用。 除了尼古丁，香烟中包含大约2500种化学成分，然而香烟烟雾中包含大约超过4000种化学物质，其中一些化学物质由于机体的影响作用，甚至有助于尼古丁成瘾，许多研究也都证明了其致人成瘾的作用。而本实验通过微核照片以及可供参考的实验数据，提供尼古丁在微观水平的毒理学证据。但是，针对于本实验尼古丁是由香烟水溶液提取而来，溶液中其它杂质是否具有类似的毒性作用将进一步实验研究证实。 参考文献 高之清.香烟烟雾中的毒物及其危害J.化学世界,2005,46（4）:255-256 罗娟,梁建辉.烟草及尼古丁成瘾的神经递质基础J.中国药物依赖性杂志,2008,17（2）:88-92 林琏,杜磊,罗万春.几种常见分离提取设备的分离提取技术J.实验科学与技术,2010,8（3）:4-7 李延兰,丰慧根,孙璐,等.高温与香烟联合对小鼠骨髓细胞微核的影响J.新乡医学院学报,1998,15（2）:108-110 李锐,李生才,刘佳,等.2种染色法在微核试验中的比较J.蛛形学报,2008,17（2）:124-128 张艳芳,许重洁,杨保胜,等.微核检测方法的比较研究J.河南科技学院学报,2008,36（2）：67-68 张艳芳,许重洁,杨保胜,等.小鼠骨髓组织细胞微核DAPI染色法J.中国组织工程研究与临床康复,2008,12（29）:5696-5698 Escobar-Chvez JJ, Domnguez-Delgado CL, Rodrguez-Cruz IM. Targeting nicotine addiction: the possibility of a therapeutic vaccineJ. Drug Des Devel Ther, 2011,5:211-224 尼玛曲珍.如何认识烟碱及烟碱的直接危害J.西藏科技,2010,12:19-20 廖若敏,周新.戒烟药物研究进展J.世界临床药物,2009,30（11）:695-697 李宏.微核试验的研究进展J.安徽农业科学,2009,37（7）:2864-2866 Iarmarcovai G,