变更场地的可比性研究-以注射用重组人生长激素为例

摘要 研究背景： 在研发过程中或正式批准后生物制品的生产商经常会发生一些变更。变 更的原因 为改进生产工艺、增大规模、扩建 /新建车间、提高产品稳定性和符合法规规定。当发生这些变更时，生产商通常需要评价产品的相关质量指标，以证明变更没有对药品的安全和有效性产生不利的影响。 研究目的：通过新建车间和老车间生产的注射用重组人生长激素比较研究，分析两个车间注射用重组人生长激素产品质量是否有差异，证明新车间产品是安全性和有效性。 研究方法： 1、工艺的研究：根据老车间的历史数据，从被变更的工艺参数和关键质量属性的关系出发， 在确定关键工艺参数和关键物料属性的基础上，研究是否由于变更而导致终产品质量的改变。 2、所涉及厂房的评估：根据工艺研究结果对涉及到的变更进行风险评估，对变更的潜在影响进行分析。 3、产品安全性和有效性研究：用产品放行标准为依据，通过比较两个车间原液、半成品和成品的关键质量属性，评价两个产品的一致性。 研究结果： 用产品放行标准为依据，我们以新车间生产的 20 批原液 和老车间原液历史上数据为比较的基础，进行了 生物学活性、免疫化学性质，原液纯度、杂质和污染情况 比较 ， 证明两个车间的产品没有显著差异。 强制降解试验 对比表明没有发现两个车间 原液的降解产物 的降解产物种类和降解速率有显著差异。两个车间 3批 原液的长期稳定性 没有显著差异。结构确证研究表明两个车间的一级和二级没有差异。大鼠体内生物学活性符合要求，没有显著差异。加速和长期稳定性研究表明，两者从杂质分布和降解速率上没有显著差异。 产品质量的相似性主要是由于新车间的在满足产品的工艺要求的基础上，并没有关键工艺参数的变更。发酵和冻干规模的放大没有对关键工艺参数的控制产生影响。这些证据表明新车间厂房和设备的验证表明其达到了设计要求，并可以满足注射用重组人生长激素的工艺要求。 研究结论 ：由于市场对于产品需求增大经常导致了厂房变更。用生产注射用重组人生长激素厂房变更为案例清楚表明：如果设计合理，在符合 则的理念的指导下，通过产品质量放行标准进行严格的比较学研究证明了在中国厂房变更的 可实现性 。 关键词： 重组人生长激素； 可比性研究；场地变更，新建车间 ue to of a is to A is of a of y of QA of we to of he in to of on of to ur 0 of to of In of of O or to ur a in be if a is 目 录 第 1 章 概述 . 1 组人生长激素的发展历史 . 1 地变更的原因 . 6 射用重组人生长激素工艺流程 . 7 第 2 章 研究目的与意义 . 10 第 3 章 注射用重组人生长激素产品介绍 . 10 液的研究方法和质量标准 . 11 组人生长激素的结构 . 11 行标准 . 12 液的研究方法和质量标准 . 12 组人生长激素的结构 . 13 行标准 . 14 物学活性 . 15 疫化学性质 . 15 制降解试验和长期稳定性 . 16 成品的研究方法和质量标准 . 16 品的研究方法和质量标准 . 16 第 4 章 初步风险评估 . 18 入物料的变更分析和风险评估 . 18 艺的变更分析和风险评估 . 21 第 5 章 对比研究结果 . 23 液的对比研究结果 . 23 构确证 . 23 物学活性 . 24 疫化学性质 . 24 度、杂质和污染 . 25 制降解试验结果 . 26 期稳定性 . 27 艺验证结果和讨论 . 28 品的对比研究结果 . 28 行检验结果 . 28 物学活性 . 29 定性 . 29 成品的对比研究结果 . 31 第 6 章 可比性研究讨论 . 32 第 7 章 结论 . 33 1 第 1章 概述 组人生长激素的发展历史 人生长激素（ 由脑垂体前叶，含有嗜酸性颗粒的生长激素（ 泌细胞所分泌，为 191 个氨基酸构成的肽类激素 。 正常情况下，生长激素 脉冲式分泌，生长激素（ 分泌受 下丘脑 产生的生长激素释放素 (调节，还受 性别 、 年龄 和 昼夜节律 的影响， 睡眠 状态下 分泌 明显增加。生长激素的主要生理功能是促进 神经组织 以外的所有其他组织生长；促进 机体 合成代谢和蛋白质合成；促进 脂肪 分解；对 胰岛素 有 拮抗 作用；抑制 葡萄糖 利用而使 血糖 升高等作用。生长激素主要生理作用是对人体各种组织尤其是 蛋白质 有促进合成作用，能刺激骨 关节软骨 和骨骺软骨生长，因而能增高。人体一旦缺乏生长激素就导致生长停滞。 1886 年 一次在临床上观察到脑下垂体的功能，发现在肢端肥大病人中脑下垂体增大。 20 世纪 约翰霍普金斯医院的 一次试验发现垂体前叶在人、小鼠和狗中具有促生长作用 14。 1921 年， 垂体前叶的提取物可以刺激正常大鼠的生长 5，很快又发现此提取物可以使去垂体的大鼠保持生长 6。促进生长的提取物发现可以刺激合成代谢效应，降低尿中氮、钙和磷的排泄 7,8。 尿中这些元素的测定提供了一个简便的生物活性检测方法，并用于在垂体提取物中分离活性组分。 1944 年 一次从牛垂体中分离现在已知为生长激素的多肽激素 9。由于牛生长激素没有成功的促进人的长高 10，因此人们开始从尸体或去除垂体的乳腺按患者的垂体中提取人生长激素 11在临床试验中，人和猴子的生长激素产生了合成代谢，并刺激了长高 14猿和非猿的生长激素的的生物化学差异被鉴别出来，同时解释了生理效应的物种特异性 14。 在 1957 和 1985 年之间，从尸体垂体提取的人生长激素 被用于很多生长激素缺乏儿童的激素替代治疗中 16。在此期间，生长激素治疗发现是有效并没有什么副反应。然而，人垂体生长激素是稀缺和昂贵的。其他治疗的应用开发，或人生长激素的细胞作用机理的研究时不可能的。 科学的进步改变了人生长激素领域的发展。人生长激素的 克隆到了细菌2 质粒上 17，从此开辟了基因工程人生长激素商业化的道路。 1985 年被报道 18发现儿童期使用人生长激素的儿童，成年后发现罹患 致命的神经退行性疾病 因此美国食品药品监督管理局（ 上世纪 80 年代命令停止一切提取自死人脑垂体的 不准 应用于人体上。 这一事件促发了重组人生长激素在临床上商业化使用。随着在细菌中大规模生产人生长激素，人生长激素的供应不再成为人体或实验室进行各种治疗研究的限制。 20 世纪 80 年代，基因工程兴起。 1981 年 司利用大肠杆菌（ E. 涵体技术研制出含 192 氨基酸的基因重组人生长激素 天然 称为 。 随着基因工程技术的发展， 1986 年 通过基因重组技术合成出 含天然序列的重组人 生长激素 。 上世纪 90 年代人们纯化了人生长激素受体蛋白，并克隆了基因 19,20。通过 X 射线晶体衍射解析了人生长激素受体蛋白和人生长激素的相互作用的三维结构 21。生长激素受体结构的知识对生长激素信号传导机理的研究提供了新的视野和方向。直接单位点突变技术被用于对生长激素配体 22，分子方法也被用于生长激素受体激动剂的设计。 人生长激素基因 簇 大约有 66,500 个碱基，位于第 17 染色体的长臂上 23。由 常生长激素基因）， 绒毛膜生长激素 ）， 绒毛膜生长激 素 A），长激素变体基因，也是胎盘生长激素）和 绒毛膜生长激素 B） 5 个基因家族组成。 时也称为 绒毛膜生长激素 也是 胎盘催乳素 基因。这 5 个基因的 列高度同源。因此猜测生长激素基因家族通过基因复制而产生的。 只有 正常健康必须的。切除或突变 因引起 生长激素缺乏，这是最严重的生长激素缺乏。具有这个缺陷的个体不能产生内源性生长激素。在出生或出生 36 个月引起有明显的重度低血糖和生长延缓 24。这些患者初始对生长激素替代有响应，但治疗 1 年内由于生长激素抗体产生而抑制了生长。 因在垂体前叶表达，是在儿童和成年人中循环的主要形式 25。生长激素是分泌蛋白，它的合成是一个含 26 个氨基酸的激素前体。当生长激素跨过内质网膜转运到贮藏粒中时信号肽被切除。 达的生长激素是一个 22191 个氨基酸的单链多肽。生长激素生物活性构象含有两个二硫键桥。 22因产物在人的肝脏和受体结3 合，并刺激 产生和长高。 所有的人生长激素都是采用注射的方式给药。皮下和肌内注射时等价的 26。因为有较小的疼痛感，皮下注射更好 。腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生长激素血清浓度，然而刺激 水平相当 27。在循环系统内生长激素和高亲和的生长激素结合蛋白（ 合，和这个蛋白结合延长了生长激素在循环系统的半衰期。给药的时间不影响血清中生长激素的水平，晚上给药模拟了生理的生长激素峰值 28。生长激素的清除半衰期大约在 2 到 3 小时之间。通过在肝脏和肾脏的代谢而清除的，成年人比儿童清除速率更快 29。 人生长激素是非糖基化的，因此目前国际上已经批准上市的重组人生长激素主要是由细菌（ E. 产的，如 。也有用哺乳动物细胞生产的，如 以及由酵母生产的，如 表 1 列出了目前主要重组人生长激素的生产商和在美国和中国批准上市的时间。我国内已上市产品均是由大肠杆菌（ E. 产的。 表 1 主要重组人生长激素的生产商 生产商 商品名 美国批准日期 中国批 准日期 美国礼来制药 987 年 3 月 2009 年 6 月 美国基因技术公司 993 年 11 月 / 辉瑞制药 995 年 8 月 2009 年 7 月 默克雪兰诺 996 年 10 月 2008 年 4 月 诺和诺德制药有限公司 2000 年 6 月 2008 年 6 月 山德士制药有限公司 006 年 5 月 / 上海联合赛生物工程有限公司 珍怡 / 1999 年 7 月 长春金赛药业有限责任公司 赛增 / 1998 年 安徽安 科生物工程股份有限公司 安苏萌 / 1999 年 *下市 重组人生长激素在大肠杆菌中的表达有两种形式，第一种形式是甲硫氨酸生长激素 和天然生长激素有一个氨基酸的差异，在 N 端多了一个甲硫氨酸，美4 国基因技术公司和诺和诺德最初的产品就是 前这种形式的重组人生长激素已经下市。第二种形式是真实的人生长激素。一些研究表明甲硫氨酸生长激素比真实的人生长激素产生较高的抗体 30，美国礼来公司的 第一个批准的和天然序列一致的重组人生长激素 31。甲硫氨酸残基和细 菌蛋白结合的痕量的人生长激素比单纯的甲硫氨酸人生长激素产生更高的免疫原性，这个问题可以通过纯化而缓解。抗体的产生很少干扰人生长激素的生物活性，因为抗体的亲和性和浓度均较低 31。生长激素抗体水平使得市场不再追随甲硫氨酸人生长激素。哺乳动物细胞的人生长激素有非常低的免疫原性 32。目前主要的重组人生长激素的生产商均提供的是和天然人生长激素一致的重组人生长激素。大多数生产商采用的是大肠杆菌系统，因为目前批准上市的产品证明大肠杆菌系统表达的人生长激素的免疫原性并未对产品的有效性和安全性产生不利的影响采用大肠杆 菌系统是最经济的，而且大肠杆菌系统已经是比较成熟的基因工程技术，上游构建和下游纯化均有比较成熟的技术，工艺控制比较稳定。 重组人生长激素是一个单链多肽激素，通常以生物活性的单体存在，但正像大家所知的他易聚集为二聚体，并在热和机械应力下（如制备过程中的摇动等）转化为多聚体而失去活性。 生长激素的药物配方趋向于不稳定，尤其在溶液中，生长激素容易生成降解产物，如脱氨和氧化产物。主要的降解反应是 1）直接水解脱氨或通过环状琥珀酰亚胺中间体而形成 及 2）在 14 和125 位上甲硫氨酸残基的氧化； 3）聚集； 4）肽骨架的截断。 冻干状态以及溶液状态的生长激素的主要降解产物是脱氨组分。脱氨发生在 149的 冬酰胺上，在 152 的天冬酰胺残基上也会产生少量的脱氨。在溶液中人生长激素在 14 和 125 位上的甲硫氨酸极易氧化。溶液中 化形成亚砜主要原因是配方中的溶解氧。蒸馏水中氧气的溶解度大约是 200对于 4IU/生长激素来说，其浓度相当于 60正常的储存条件下，溶解氧的量超过了 3000 倍生长激素的化学计量，所以是不能通 过塞盖或包装前对缓冲溶液除气来解决溶解氧的问题。 很多降解反应多可以通过冻干从蛋白质中移走水分而显著降低，所以现在生长激素通常都是冻干的，在 4以冻干形式储存的冻干剂型，使用前再重新溶解，大部分5 的商品重组人生长激素是冻干形式的。 除了常见的冻干形式制剂外，考虑到使用方便和患者的依从性，人生长激素的溶液制剂和缓释制剂的研究也很多。目前国际上诺和诺德和美国基因技术公司均有溶液剂型的生长激素上市，但由于人生长激素在溶液中很不稳定，因此货架期要比冻干剂型短很多，而且对运输的要求也比较高，溶液剂型对温度的敏感性比冻干 剂型高很多。 从二十世纪八九十年代至今，普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质的变性。 3认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下，蛋白质将失去活性；而脱水过程本身能使蛋白质损伤，从而复水后蛋白失去活性。保护剂的作用一般认为是通过与蛋白的氢键作用而保护了蛋白由于失去水分而裸露的基团。保护剂的浓度和冻干速率相关，由于对于药物制剂来说保护剂的浓度不能过高，所以要有较大的冻干速率。 人生长激素制剂的稳定性是和水分以及氧有密切的关系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制剂的稳定性最好 34。但是在不 加保护剂的情况下，如果单纯降低水分含量可能适得其反，因为蛋白如果失去最后一层水分的保护，将因为基团的暴露而聚集变性。有报道 35人生长激素在含水量 完全变性，而在含水量 没有变性。所以冻干过程应该加入合适的保护剂以及其他辅料，并且含水量不是越低越好。较少氧对蛋白的氧化，可以通过充氮气来保护 36。 冷冻干燥过程中的降温速率的选择与保护剂的浓度有关，如果保护剂浓度很高，以不太大的降温速率就能使溶液以玻璃态固化。很多人认为快速冷冻有益于生物活性，因为快速冷冻可以减少缓冲液结晶引起的 化， 减低蛋白质局部高离子强度的接触时间，减少变性可能发生的时间。但是很多证据表明冻融和冷冻干燥后，快速冷冻对蛋白的活性回收不利，并对贮藏期冻干产品的稳定性也有影响 37。用磷酸缓冲液和甘露醇作为赋形剂体系，在 ，冷冻速率对人生长激素的可溶性聚合物形成的影响检测不到，可是对不溶性聚合物形成的影响是显著的，冷冻速率越高聚合物越多。不溶性聚合物的形成被冷冻前的低 速。 冻干溶液的 重要，对脱氨的影响较大。选用不同的缓冲溶液对 要求也不一样。当选用磷酸盐作为缓冲液时，在较低的 ，有较少的脱氨组分，但在此 较易产生聚集 38。人生长激素溶液剂型就是选用较低的 加非离6 子表面活性剂防止聚集。 人生长激素最常用的冻干保护剂是甘氨酸和甘露醇。两种配方比很重要，根据剂量的不同两种物质加入的比例是不同一样的。甘露醇作为保护剂和甘氨酸一起起到稳定冻干制剂的作用。为了保证重新溶解后人生长激素的稳定，也有在溶解水中加入非离子表面活性剂来增加溶液的物理稳定性，如诺和诺德的 溶解水中加入泊洛沙姆 188 以增加物理稳定性。表 2 列出了价格典型的商品化重组人生长激素的配方。 表 2 常见商品化重组人生长激素的冻干配方 * 商品名 剂型 规格 赋形剂 缓冲盐 氨酸 甘露醇 蔗糖 干剂型 / 5 5 5 25 / 0 8 6 6 18 / 0 5 5 5 / 5 5 / / 来源于 站相关产品的说明书 表 2 中可以看到大多数上市产品采用的甘氨酸和甘露醇配方系统。本文讨论的产品就是采用冷冻干燥技术制备的冻干粉针剂型，也采用和上市产品同样的甘氨酸和甘露醇体系，配方均得到批准，长期稳定性研究发现，冻干剂型和溶液剂型相比较在货架期要稳定的很多，这也是目前市场上还是主要以冻干剂型为主的原因。 地变更的原因 注射用重组人生长激素是上海联合赛生物工程有限公司已上市十多年的老产品，随着市场的扩大，原生产车间已不能满足市场需求，为此在原址上新建了注射用重组人生长激素生产车间，用于 注射用重组人生长激素 的生产。由于在原址上新建，原质量检测、原辅材料采购和储存，以及质量保证系统均采用原来的系统，检测、原辅材料和质量保证系统的风险较低。 本次是在原厂址增建了一个注射用重组人生长激素的生产线，包括了原液生产车间和制剂生产车间，对于本次新建车间经历了下面几个阶段。 表 3 新增车间 经历的阶段流程 7 阶段 要求 设计前 根据历史研究和生产数据分析和评估原液和制剂的关键工艺参数，并分析其对终产品质量属性的影响。 厂房设计 根据关键工艺参数的分析结果，提出对厂房和设备的工艺设计要求。厂房和设备应可以满足有效控制关键工艺参数的要求。 安装确认 完成厂房和设备 3Q 试制 在新建车间进行试制，考察车间、设备、人员等是否可以按照预定的工艺参数进行生产，并得到合格的产品。 工艺验证 根据是试制的结果完善工艺规程和批记录等，然后进行工艺验证。 比较研究 新车间和老车间的原液和成品进行全面的药 学比较研究。 持续改进 新老车间进行持续的考察和比较，对更多批次的原液和成品进行回顾性的验证，进一步确认工艺的稳定性。 在新车间的设计前根据实际需要，放大了发酵规模和冻干规模，保持其他操作单元规模不变。对于生物制品，其生产工艺是关键的，因此在整个新车间发展阶段，以不改变关键工艺参数和关键质量属性为前提进行设计、实施和验证。 射用重组人生长激素工艺流程 注射用重组人生长激素是冻干粉针剂型，其原液通过基因工程技术将目的基因插入载体质粒中，然后将质粒转化到大肠杆菌而得到可以表达重组人生长激素的大肠杆菌工程菌 ，再通过大肠杆菌的培养使之生产目的蛋白重组人生长激素。由于重组人生长激素是通过大肠杆菌来生产的，因此需要将目的产物和大肠杆菌其他组分如宿主蛋白等进行分离。培养后的大肠杆菌需要通过一系列的工艺步骤进行分离纯化后才能得到纯净的重组人生长激素原液。得到的原液经过配制、除菌过滤、冻干和包装等制剂过程，得到终产品注射用重组人生长激素冻干粉针。 对于药品的生产，图 1 形象的给出了关键物料属性和关键工艺参数对关键质量属性的影响。根据这一定义，工艺状态取决于该工艺的关键工艺参数和输出物料的关键物料属性 39。 8 图 1 关键物料属性（ 关键工艺参数（ 关键质量属性（ 影响 生物制品 由于分子量大，结构复杂，对于分析方法和仪器设备要求颇高；尽管如此，现代分析技术 难以按照个体分子 的 2 级及 3 级结构 进行 完整 表征 化测定，因此主要通过 控制 其生产工艺 来说明批次生产的相似性；而生产工艺是通过多个生产单元操作来实现的。注射用重组人生长激素的生产工艺也被分为多个单元操作， 图 2给出 了注射用重组人生长激素生产工艺流程图。流程图中根据 图 1 的方法，给出了每个单元操作的输入物料和产出物。从图中可以看出，上一步骤的产出物是下一步骤的输入物料，这里将工艺的产出物除原液、半成品和成品外的工艺产出物均定义为中间品。 根据多年的生产经验对每一个单元操作的物料属性和工艺参数进行分析，并评估其对关键质量属性的影响。当输入物料的某个质量属性（如水分、纯度）的变化能显著影响产出物的属性时，则定义其为关键物料属性。当工艺参数运行参数（如流速、转速）或工艺状态变量（ 如温度、压力、 实际变化能显著影响产出物料的属性时，则定义该工艺参数是关键的 40。新建车间输入物料和产出物的关键属性 和老车间保持一致。 药品生产单元操作 入物料 出物 键工艺参数 9 图 2 注射用重组人生长激素工艺流程图 （下划线表示单元操作的产出物） 从总体的工艺流程上看原液是成品关键物料，新车间原液的关键质量属性和老车间不应有显著差异，原液后面工艺的变更不对原液的质量属性产生不利的影响。 细胞库（ 培养基、工艺空气、纯化水 发酵培养 中间品 1 离心捕获菌体 中间品 1 中间品 2 初纯 中间品 2 各种盐、纯化水 中间品 3 精纯 重组人生长激素原液 中间品 3 层析介质、过滤膜、注射用水 配制 中间品 4 重组人生长 激素原液 辅料、注射用水 除菌过滤 半成品 中间品 4 过滤膜、工艺空气、注射用水 灌装 中间品 5 半成品 胶塞、西林瓶、注射用水 冻干 中间 品 6 中间 品 5 氮气 钆盖 成品 冻干品 铝盖 包装 包装成品 成品 瓶贴、说明书、外包装 输入物料 产出物 生产操作单元 10 第 2章 研究目的与意义 根据关于贯彻实施 的通知（国食药监安 2011 101 号） 和 关于进一步明确眼用制剂等产品实施新修订药品 限的通知（国食药监安 2012 106 号）要求， 涉及无菌检查项目制剂和原料药均应在 2013 年 12 月 31 日前达到新修订的药品 求。其他应在 2015 年 12 月 31日前达到新修订药品 求。生物制品均应在 2013 年 12 月 31 日前达到新修订的药品 求。 药品生产质量管理规范（ 2010 年修订） （简称新版 41是一次重大的订，特别是针对无菌药品的生产提高了要求，很多生产商为符合新版 建，与此同时很多生物制品通过改建或扩建淘汰老的工艺，采用新工艺。如何将变更后的产品与变更前的产品进行对比是很多生产商面临的问题。 生产方法、工艺、质控检测方法以及产品表征检测方法的改进， 使生产商能够较好对变更对生产工艺和生产设施的影响进行识别和评估 ，这使得从药学上证明其有可比性成为可能 。 比如，近年来大分子分离技术、产品以及工艺相关技术大大改进，生产商在建立产品和生物活性表征方面经 验证的灵敏方法以及对这些检测中差异显著性评价方面所具有的能力， 有能力在不必重复进行临床药效研究的情况下，对产品可比性研究进行评价 。 如果可比性试验证明生产变更并未对产品的安全性、特性、纯度和效价产生影响，可认为这两种产品具有可比性。 可比性研究是厂房变更的关键，本文尝试以注射用重组人生长激素新建厂房的可比性研究为例，对如何评价产品变更前后的可比性进行探讨。 第 3章 注射用重组人生长激素产品介绍 药品的安全性和有效性是通过上市前非临床和临床试验而评价，药品的关键质量属性通过临床期间的药学研究而最终确定的，因此对于已上市产品的变更，其关键质量属性不应发生变更，否则需要追加非临床或临床试验来确认其安全性和有效性。 注射用重组人生长激素产品已上市 10 多年，欧洲药典、美国药典和中国药典均11 收录了此产品，具有比较成熟的分析方法，质量标准也是基于对产品和工艺的了解而建立的，因此质量标准反映了其关键质量属性。下面从原液、半成品和成品 3 个方面分别介绍新车间产品的研究方法和质量标准。 液的研究方法和质量标准 重组人生长激素的关键质量属性包括一级、二级和三级结构、理化性质、免疫化学性质、生物活性、纯度和杂质以及产品的稳定性，原液的研究方法应包含上述内容。 组人生长激素的结构 图 3 给出了人生长激素的一级氨基酸序列和二硫 键位置。 图 3 人生长激素一级结构图 42 重组人生长激素的分子式为 子量 22125 道尔顿。其他结构信息列于 表 4 中。 新车间重组人生长激素原液应进行结构的确证，证明其和天然的人生长激素的结构具有一致的一级和二级结构。结构确证检测包括：肽图质谱覆盖率、质谱分子量、N 末端和 C 末端序列检测、二硫键配对检测和圆二色谱法检测。两个车间各取 1312 批原液进行结构检测， 表 4 列出了检测项目和两个车间原液结构的一致性评价标准。 表 4 人生长激素结构确证研究内容 检测项目 理论值 一致性标准 质谱分子量 22,125 批原液检测，分子量和理论值误差小于 1%；和对照品平均分子量相差小于 20图质谱覆盖率 氨基酸序列 两种酶酶切，分子量覆盖率应 大于 90% 圆二色谱法 旋占多数 相同条件检测，应和对照品谱 图一致 二硫键配对 两对二硫键： 有 有错配和分子间二硫键 N 末端序列 末端 10 个残基序列为 末端序列 末端 8 个残基序列为 放行标准 注射用重组人生长激素产品已上市 10 多年，并且是在中华人民共和国药典中有收录，因此质量标准反映了其关键质量属性，下面从原液、半成品和成品 3 个方面分别介绍新车间产品的研究方法和质量标准。 液的研究方法和质量标准 重组人生长 激素的关键质量属性包括一级、二级和三级结构、理化性质、免疫化学性质、生物活性、纯度和杂质，以及产品的稳定性，因此原液的研究方法应从上述方面进行。 13 组人生长激素的结构 图 3 给出了人生长激素的一级氨基酸序列和二硫键位置。 图 4 人生长激素一级结构图 重组人生长激素的分子式为 子量 22125 道尔顿。其他结构信息列于 表 4 中。 新车间重组人 生长激素原液，应进行结构的确证，证明其和天然的人生长激素的结构具有一致的一级和二级结构。两个车间各取 13 批原液进行结构检测，检测包括：肽图质谱覆盖率、质谱分子量、 N 末端和 C 末端序列检测、二硫键配对检测和圆二色谱法检测。 表 4 列出了这些检测的理论值和两个车间原液结构的一致性评价标准。 表 5 人生长激素结构确证研究内容 检测项目 理论值 一致性标准 质谱分子量 22,125 批原液检测，分子量和理论值误差小于 1%；和对照品平均分子量相差小于 20图质谱覆盖率 氨基酸序列 两种酶酶切，分子量覆盖率应 大于 90% 圆二色谱法 旋占多数 相同条件检测，应和对照品谱 图一致 14 二硫键配对 两对二硫键： 有 有错配和分子间二硫键 N 末端序列 末端 10 个残基序列为 末端序列 末端 8 个残基序列为 放行标准 新车间重组人生长激素原液不仅应符合放行检验标准，还应基于收集的历史数据，通过统计学方法建立两个车间比较的验收标准。 根据分析方法的性质，可以将放行标准分为定量标准和定性标准，定性标准作为定量标准的补充，更全面的展现产品杂质增减情况。重组人生长激素主要相关杂质有：脱氨组分、氧化组分、多聚体、工艺中被截断的人生长激素片段。主要工艺杂质有：