运用生物信息学分析牛奶中细菌菌群

精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 1 / 12 运用生物信息学分析牛奶中细菌菌群 目前，对于环境中微生物菌群的研究主要分为培养和非培养的方法。培养法是利用不同的选择性培养基结合生化反应鉴定细菌的种类。该方法具有一定的针对性，但是费时耗力，且只能获得可培养微生物的信息，对于那些不可培养的细菌则无能为力。非培养的方法主要是通过分子生物学技术，直接从环境中提取细菌基因组 用分子生物学的方法进行分析研究，如聚合酶链式反应 核酸杂交（ 高通量测序（ 。目前分析细菌的 16列已经成为细菌菌种鉴定的“金标准”。16长为 ，包括 9 个“高度可变区”，其中 （ 位点 456细菌间的比对中获 得 最 多 的 单 核 苷 酸 多 态 性（ ,能够鉴定 110多种细菌。研究者已经利用 16结合 序等技术对环境中的细菌进行鉴定及菌群分析研究，其中包括对牛奶中细菌的鉴定和菌群分析，并发现牛奶中存在多种细菌，具有较高的菌群多样性。本研究中，我们从市售的常温牛奶和巴氏消毒牛奶中提取细菌基因组 用通用引物扩增牛奶中细菌的 16，荧光实时定量 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 2 / 12 测定样品中细菌总数；通过克隆、测序，获得 16进行序列比对、鉴定菌种。分析不同品牌牛奶中的细菌数量、菌群分布，推测生奶的奶源环境、储存时间及奶牛的健康情况。 1 材料和方法 材料 与试剂 样品收集 :从超市购买了 4 个品牌的 5 种牛奶，包括高温灭菌奶（常温保质期 30 天）和巴氏消毒牛奶（ 2 6保质期 7 天），分别标记为 A、 B、 c、 D、 E。样品 高温灭菌奶， 巴氏灭菌奶， c 和 D 是同一品牌的常温奶和巴氏奶，每种牛奶收集了同一批次的 3 个样品。所有的样品均在2012 年 57 月进行取样。 试剂： 购 自 德 国司，、 自日本 司，购自美国 司， 自北京全式金生物技术有限公司，自美国 司。 仪器与设备 光光度计购自美国司， 自美国 司， 心机购自美国司， 泳仪购自美国 胶成像系统购自美国 司 。精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 3 / 12 时定量 购自美国 司。 方法 提取取 100牛奶样品用 （ 2009）的方法提取牛奶中的细菌 71500掉上层溶液，收集沉淀，用 51x）重新悬浮沉淀； 7150g 离心 5掉上层溶液，沉淀用 取细菌基因组 取的 解在 50 E（ 1x）中，用 光光度计测定 度，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 提取的 段大小。样品于箱中保存备用。 用 通 用 引 物 338534增 16。引物由上海生物生工（北京合成部）有限公司合成。 应体系为： L，上下游引物各 10 m，模板 20水（ 化水，高压灭菌备用）到 20 L。反应条件为： 95预变性 594变性 30s， 55退火 30s， 72延伸 30s，共 30 个循环， %琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物， 100V， 40外光下观察电泳条带（如图 1）。 物用 行纯化，测定浓度。纯化产物用于随后的克隆实验。 序列信息分析测序获得的序列在 （ 的比对，当精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 4 / 12 98%时，记录该序列对应的细菌属名和一致的始末位点。用 件对所得的序列根据一致位点提取16的扩增序列，用 进行序列 比对。线软件 ，对每个样品的菌属进行归类。用“ 12”（ H 是每种菌属占样本所有菌属的百分比）来评估每个牛奶样品中的 群多样性。软件构建 统发生树。 基因的 量细菌总数提取的牛奶中细菌于模板定量细菌总数， 隆获得的 10 倍梯度稀释的质粒用于实时定量 标准曲线的生成。反应体系为：2） 10 L，上下游引物各 4 m，模板 20水到 20 L。反应条件为： 95预变性 35变性 3s， 60延伸 40s，共 40 个循环。数据结果用7300行分析。每孔 3 个重复。 2 结果分析 提取与 增我们成功提取了 5 种牛奶的 15 个样品的细菌基因组 脂糖凝胶电泳的结果显示， 现弥散状，没有明显的主带。用 16的通用引物对全部样品进行 增，均得到约为 190扩增片段，阴性对照无扩 增条带（图 1）。在 15 个 增产物中随机选精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 5 / 12 择了 5 个（每个品牌选择一个样本）进行 隆。每个样品得到了至少 1000 个克隆，随机选取 100 个克隆进行测序（表 1）。 牛奶中的细菌总数利用检测细菌的 16因数量来反映牛奶中细菌总数。结果显示，所有牛奶样品中均含有大量的 16因片段。考虑到不同种类细菌中 1615 个，我们对绝对定量获得的数据进行最小化和最大化处理（各样品中的细菌 16因按照最小拷贝数和最大拷贝数计算），所得结果和国家标准进行比较 （图 4）。按照每个细菌含有最少 16因拷贝数计算获得最大细菌总数，各品牌牛奶样品中最大细菌总数均低于国家标准。 菌种鉴定及菌群结构分析我们对 5 个牛奶样品的 500个克隆进行了测序，成功的获得了 472 条 16的序列，其中有 131 种不同的序列。样品 A 和 B 得到 93 条序列，其中 A 中有 20 种不同的序列，样品 B 中有 25 种不同序列。 c、 D、 E 分别得到 95、 96、 95 条序列，不同的序列数目为 39、 51、 32（表 1）。菌属鉴定的结果表明， 472 条序列中的 452 条序列可以鉴定到五个纲的 17 个属 ：芽孢杆菌纲（ 12%、黄杆菌纲（ 3%、 2%、放线菌纲（ 占 1% 和 - 变 形 菌 纲精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 6 / 12 （ 82%（表 1）。另外的 20 条序列只能鉴定到纲的水平，分别为黄杆菌纲（ 5%）、 5%）和 90%）。可以明确鉴定到属的序列中，有 58 条序列鉴定为革兰氏阳性菌，分属于棒状杆菌属（ 厌氧芽孢杆菌属（ 链球菌属（ 占总序列的 12%。其中在样品 E 中检测到 1 个克隆；所有的 10个 样品中检测得到，且与有 99%以上的相似性。在样品 c 和 E 中都检测到 别占其所测序列的 1%和 49%。 c 样品中的 ； E 样 品 中 的 46 个隆全部与无乳链球菌（）有 100%的相似性。革兰氏阴性菌的序列占所有序列的 83%，分属于 14 个属：假单胞菌属（ 不动杆菌属（ 沙雷氏菌属（ 气单胞菌属（ 黄杆菌属（ 水栖菌属（ 嗜冷菌属（ 希瓦尔氏菌属（ 金黄色杆菌属（ ， 肠 杆 菌 属（ 詹森菌属（ 无色杆菌属（ 微小菌属（ 戴米提亚菌属（ 其中 多，占全部序列的 46%，其次为 23%，而且这两种细菌精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 7 / 12 都以较高比例存在于在所有样品中。 各个样品中检测到的比例分别为： A（ 71%，16%）、 B（ 75%， 13%）、 c（ 30%， 43%）、 D（ 40%， 17%）、 E（ 16%，25%）（表 1，图 3）。 样品 A（ 8%）和 B（ 5%）中检测到； 在于样品 B（ 1%）、 c（ 1%）、 D（ 13%）和 E（ 1%）中； 样品 c（ 8%）和 D（ 3%）中发现。 c 样品中有 3%的序列为 对结果显示，与气囊栖水菌（）有 99%的序列相似性。样品 c 克隆中有 3%为 列比对结果证明为腐败希瓦尔氏菌（）。样品 c 和 D 中检测到 别占比例为 3%和 1%。 布在样品 c 和 E 中。 c 和 D 中分别占 1%和 4%。 优势菌群的系统发育树分析各牛奶样本中不但检测到的菌属 不同，即使是同一菌属，其序列（菌株）也存在差异，图 4a 是所有 列构建的 统发育树，发现样品 A、 B 的序列集中在上端的分支上，中间的分支中大部分序列出自样本 E，而样品 c、 D 的序列集中在下端的分支上。说明同一品牌牛奶中的细菌可能具有更近的亲缘关系。图 4b 是所有 列构建的 统发育树，与图 4a 情况相似，同一品牌牛奶中的序列相似性更高。 市售牛奶中细菌的多样性我们发现各个样品中能够明确鉴定的属为： A 到 D 依次为 5 个、 5 个、 11 个、 8 个、 8 个，精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 8 / 12 各个样品中 有一定差异。为了更好了解牛奶样本中的细菌多样性，我们利用各样品中所有的序列进行了多样性分析。 5个样品 A、 B、 c、 D、 E 的值分别为、，平均值为。可以看出， A 和 B 的菌群多样性明显低于 c 和 D。 3 讨论 基于 16对其进行分析，再结合增等方法研究环境中菌群多样性及结构是近年来国内外比较常见的研究方法。如林海龙等对中药废水污泥中的菌群结构的分析， 、 对生奶中细菌菌群结构以及冷藏 过程中的菌群结构的变化情况的分析。几乎所有这些研究都基于基本的培养法获得生牛奶（即原料奶）中细菌的单克隆，再通过大量培养后提取细菌的基因组 行定。然而市售牛奶，尤其是高温灭菌的市售牛奶，细菌 牛奶中已经成游离状态，对 取的要求比较高。所以如何从市售牛奶中提取到可以用于 增的 为整个研究成功的关键。本研究通过增加牛奶的使用量，利用提取粪便中细菌 对这些 行细菌 16的 增，成功获得了目的产物（图 1）。通过 隆和测序分析，得到了不同品牌的 5 种市售牛奶中菌群的 16列信息，并对其进行比对、鉴定。所得结果表明，用该方法可以精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 9 / 12 提取到市售牛奶中的细菌 提基因组 以用来进行下游的实验研究。 各品牌牛奶中的细菌总数均处于相对较高水平牛奶中细菌总数是评价牛奶质量的一个重要标准。虽然牛奶中不可避免的存在一些细菌，但是各种细菌的大量存在势必影响牛奶的品质。我们的实验结果表明各个品牌牛奶中细菌总数均低于国家标准，然而相比较于乳业发达国家的 105 个 /菌数量，各牛奶样品中细 菌总数均处于相对较高水平（图 2）。这与我国部分奶源依赖散户养殖，饲料质量和卫生状况都不佳造成细菌总数不易控制，长时间储存导致的细菌繁殖，以及规模化养殖管理不善不无关系。因此，监督部门应加强管理，促使国内奶制品产业环境进一步得到改善。 不同品牌牛奶中的菌群结构不同 用通用引物扩增 16的结果显示 牛奶中的主要菌群， 也得到的相同的结果；与此不同， 的结果则表明牛奶中的优势菌群是 们在市售牛奶中检测到的优势菌群是 与部分研究者的检测结果一致。即使同为优势菌群，我们发现它们在 5 个样品中所占比例也不尽相同（图 3）。然而在 非优势菌群 ,进化树的聚类分析显示同一属的细菌中，来自同一样本的细菌序精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 10 / 12 列具有更高的相似性，其亲缘关系更近（图 4）。各个样本中的非优势菌的种类也不同，如 在于样品 A 和 样品 c、 D 检测到了 在样品 1）。 后到牛奶中，而且牛奶中存在的大部分细菌都能在乳头表面发现。因此我们推测不同品牌牛奶中菌群结构的差异是由于奶源不同所造成的，而奶源环境中的菌群结构存在较大差异。 牛奶中的致病菌乳腺炎是世界奶牛养殖业中发病率最高、造成经济损失的主要疾病之一。其病因多为细菌感染。根据感染特点提出环境感染和接触感染的观点。环境感染的主要病原 菌为大肠杆菌（），其次有停乳链球菌（）、乳房链球菌（）和副乳房链球菌（）等；接触感染的主要病原菌是金黄色葡萄球菌（）和无乳链球菌（）。我们在样品 E 中不仅检测到，且检测到近一半的序列（ 49%）为，说明该品牌的该批次生奶可能受到了严重污染。所以我们怀疑 E 样品奶源已有患有乳腺炎的奶牛，尽管这些奶牛可能没有表现乳腺炎的病症。 牛奶中的耐冷细菌耐冷细菌是牛奶的主要腐败菌，它们被定义为能在 7生长的细菌。许多的研究者已经报道，在牛奶冷藏过程中耐冷细菌会大量繁殖，从而影响牛奶质精品文档 2016 全新精品资料 公文范文 独家原创 11 / 12 量。在农场和加工厂，制冷技术在保证 牛奶品质的同时，也为耐冷细菌的生长提供了选择条件。所以随着生奶低温保存的时间延长，耐冷细菌的数目就会随之增多。 利用基于 16隆测序的 生牛奶在制冷条件下细菌菌群的变化进行研究。结果表明，在农场到乳制品加工厂的冷藏过程中， 主要的细菌类群，尤其是耐冷细菌 总数的 46%63%。 的 结 果 则 显 示 ， 随 着 牛 奶 冷 藏 时 间 的 延 长 ，别占总细菌 株的 %和 40%。我们的结果显示， c、 D 样品中全部序列的 30%和 41%，这与文献报道的结果基本一致。多样性分析表明样品 A 和样品 B 在 5 个样品中多样性低（分别为和），聚类分析发现其不同的序列数少且集中在一起。 序列数分别占 A 和 B 样品总体的71%和 75%，其中相同的序列数分别为 56 和 54，占 A 和 B 样品中 列的 86%和 79%。因此我们推测生奶在加工为市售牛奶前，样