课件：HIV感染导致的免疫缺陷病.ppt

HIV感染导致的免疫缺陷病,广州医学院检验系 廖伟娇,HIV的一些相关知识： 1. HIV的结构 2. HIV基因组成及结构 3. HIV感染及复制 HIV感染与免疫 1. HIV感染与补体及其它体液因子的作用 2. HIV感染与血清抗体 3. HIV感染与CD4+、CD8+淋巴细胞 4. HIV感染与CTL细胞 5. HIV感染与单核、巨噬细胞、NK细胞 HIV的实验室检查 1. 初筛试验 2. 确证试验,一、HIV的结构 gp120 gp41 脂质膜 蛋白酶 RNA p18 反转录E 整合酶 基质 p24 核蛋白 核衣壳(由微粒组成),二、HIV的基因分型 HIV可分为两个型：HIV-和HIV-。 : LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-LTR. : LTR-gag-pol-vif-vpx-vpr-tat-rev-env-nef-LTR. 两者的主要区别在于型含有vpu,而型含vpx。另外，vpr和nef与其他基因的关系也不同， HIV-的vpr与vif相互重叠，而nef与env不重叠；HIV-的vpr与vif不重叠，而nef与env相互重叠。 LTR gag vpr env LTR pol vif rev rev tat vpu tat nef vpx vif rev vpr,M组:包括AJ 10个亚型 HIV- HIV O组:包括O1O4四个亚型 HIV-:分为AE五个亚型 、型病毒之间核酸序列同源性只有5560%，而同 一型内的基因变异水平只有20%左右。 型M组：不同亚型间的遗传变异程度在gag基因为 10%左右，而在env基因变异为20%左右。 O组：病毒只有少数基因序列是已知的。 型：各亚型间的遗传变异约为20%，A、B间的变异 在10%以内。C、D、E各亚型只有一个病毒基 因序列经过测定，其遗传变异水平尚不清楚。,结构基因 gag p55 前体蛋白：可再被切割成p24、p17、 p9、p6 p17 基质蛋白：gag前体的膜定位、病 （p16) 毒颗粒的成熟及稳定、脱壳和整合 前复合体的核内转运。 p24 核心蛋白：形成RNA及酶的保护 (p26) 层，病毒颗粒形成的重要成分。 p9 核壳蛋白：与RNA结合在一起， 在RNA包装过程中起重要作用。 p6 脯氨酸丰富蛋白：RNA结合蛋白， 帮助病毒的装配和释放。,pol p10 蛋白酶：特异性水解和合成gag和 gag-pol前体。 p66/p51 逆转录酶：具有DNA多聚酶和RNA (P68/p53) 酶活性，将病毒RNA逆转录成cDNA p31 整合酶：将病毒DNA整合到细胞染 (p32) 色体上。 env gp160(gp140) 前体蛋白，被切割为gp120/41 gp120 外膜糖蛋白：介导病毒与受体结合， (gp125/105)决定病毒感染性、细胞亲和性及细 胞致病变性。 gp41 穿膜糖蛋白：将病毒外膜蛋白固定 (gp36/41) 在膜表面，介导病毒与细胞融合。,早期调控基因 tat p14 转录和转录后病毒基因表达调节 因子：增加所有病毒基因的表达。 rev p19 转录后病毒基因表达调节因子： 参与含RRE结构的病毒mRNA的核 外转移、稳定及翻译。 nef p27 细胞浆内蛋白：降低感染细胞表面 的CD4受体的表达，调节病毒繁殖。,晚期调控基因 vif p23 病毒感染因子：增加病毒感染性。 vpu p15 一种膜蛋白：为HIV-所特有，参 与病毒的成熟，增强病毒从细胞内 释放，降解细胞内gp160-CD4复合 体。 附属基因 vpr p18 病毒颗粒成分：协调整合前复合体 的核内转运；使感染细胞休止在G0 期。 vpx p16 病毒颗粒成分：为HIV- 所特有， 作用同p18。,三、HIV的繁殖： RNA RNA 逆转录酶 DNA HIV 与CD4结合 双股前病毒DNA 基因组mRNA 病毒DNA转录 病毒颗粒 装配 病毒mRNA 装配 病毒蛋白 新病毒,HIV的复制周期： 吸附 融合与穿入 逆转录和整合 早期合成 晚期合成 病毒颗粒释放 1.吸附：与CD4结合。CD4分子的V1区与HIVgp120相互作用，导致病毒结合于细胞上，但HIVgp120上哪些位点与CD4作用，尚不完全明了。 2. 融合与穿入： HIVgp120与CD4结合后出现一系列反应导致病毒与宿主细胞膜融合，病毒核酸核心进入宿主细胞浆，机制尚不清楚。但 HIVgp120与CD4结合不足以导致病毒与细胞融合而进入宿主细胞，1996年发现了第二受体。,V1,V2,V3,V4,S,S,S,S,S,S,N,C,CDR1,CDR3,CDR2,98,92,1,14,85,26,40,53,CD4分子结构模式图,3.逆转录和整合：HIV-1进入细胞后立即脱壳，脱壳后利用自身的DNA多聚酶，以病毒RNA为模板合成一条互补的DNA。核糖核苷酸酶H切割分开RNA-DNA杂合体，新合成的DNA在作为模板合成另一条互补的DNA(即形成双链DNA)，某些双链DNA被转运致细胞内，以直链DNA的形式通过病毒自身携带的整合酶，整合入宿主细胞。 4.早期合成：病毒基因整合后，即开始小量的转录(以整合病毒DNA为模板合成全长病毒mRNA)，经多次剪接后，其中一段被翻译成调节蛋白Tat、Rev、Nef。Tat能大大促进病毒转录，而Rev则使其余的mRNA转运到细胞浆内以备晚期合成之用。,5.晚期合成：Rev启动晚期合成，促使未剪接的gag-pol mRNA和一次剪接的表面蛋白mRNA在细胞浆内翻译成相应的酶和蛋白，以供组装病毒颗粒。 6.已合成的病毒成分组装成病毒颗粒并通过芽生从细胞中释放。,HIV感染的免疫反应 HIV进入机体，5d4w出现临床症状，急性 感染期持续12w，出现临床症状时，伴发高滴 度的P24抗原血症，抗原血症持续24w，在这期 间，HIV复制非常活跃，血浆、单个核细胞中有 大量HIV， 抗原血症缓解时，抗gp120、gp160、 gp41、P24等抗体开始出现，所以HIV感染后的 46w即可检测到抗体。Ab与Ag结合后被树突状 细胞捕获，所以急性感染晚期，HIV繁殖水平下 降，急性症状消失，但淋巴结中有大量HIV潜伏 细胞存在，机体进入无症状HIV潜伏期。经过一 定的潜伏期最后出现AIDS。,一、体液免疫： 1.HIV与补体及其它体液因子的相互作用： HIV的传播方式，跨越了皮肤屏障，一般来说，HIV附着于粘膜表面或进入血液、淋巴系统时，免疫反应即开始，原发性HIV感染时整个免疫系统均被激活。在特异性抗体还未形成时，补体及其它体液因子是抵抗Ag的重要机制(补体被激活而清除Ag)。HIV进入机体，也能激活补体，HIV的跨膜蛋白也能直接与C1q结合而导致C3在病毒表面沉积，这种沉积可清除普通的Ag，也可清除和灭活动物的反转录病毒，但不能灭活人的反转录病毒(HIV、HCV等人类反转录病毒)。不仅如此，多种人类体液(包括精液、乳汁、血浆、阴道分泌物、补体CH因子、C3b、C4b、CRb等)被证实能提高HIV-1的感染力，例如补体抑制因子H能与gp120的C1区结合而促进多核巨细胞的形成，该因子加上某些血浆因子，具有稳定HIV-1及其感染细胞，使HIV-1和被感染细胞免受吞噬细胞溶解的作用。再如：精液中的复合因子(CD46)和迟发性加速因子(DFA)均可抑制补体激活而对HIV起保护作用。,2.血清抗体： HIVIgM抗体在感染后2w出现，5w达高峰，3m内降到难以检测到的水平。26w出现IgG抗体，其抗体包括gag编码的p24、p55、p17，pol编码的p68、p53、p34，env编码的gp120、gp160、gp41、rev、tat、nef、vpu、vpr基因编码的针对调节蛋白的抗体及HIV增强型抗体等。 中和抗体：中和抗体的作用部位大多数在gp120/gp41上，少数在p24蛋白上。在gp120蛋白结构中，在第303338氨基酸的两侧为胱氨酸，它们之间由二硫键相连而形成一个环状结构(称为v3环)，针对gp120V3环的中和抗体，能阻止gp120的切割和变形，使HIV无法与靶细胞融合及进入靶细胞，中和了HIV的感染性。此外gp120V1/V2区、gp41ELDKWA/RALAVRY的抗体也是中和抗体。有人认为：p24、p17抗体也是中和抗体。,ADCC抗体：该类抗体可吸附在NK细胞表面的Fc受体上，激活NK细胞，帮助NK细胞杀伤表达gp120/gp41的感染细胞。这类抗体主要为HIVgp120/gp41抗体。 但中和抗体、ADCC抗体一般都出现在感染的晚期，此时病毒滴度已开始下降。 目前，还没有证明正常B可受HIV感染，但可感染病毒转化的B细胞(例如EB病毒转化)，使这类细胞处于多克隆激活状态，使Ig增高，但多克隆B细胞分泌的Ig常常是自身抗体，攻击自身细胞，造成免疫损害。而且正常B细胞由于自身内在功能的失调和 Th细胞功能的丧失而对新抗原的反应能力大大减弱，这在持续性HIV感染时是灾难性的。 HIV增强型抗体：该抗体不是抑制HIV的繁殖，而是促进HIV的繁殖。这类抗体主要为gp41抗体。具体作用机理未明，它的存在与AIDS的发展有一定关系。,二、细胞免疫反应 T细胞：HIV患者细胞免疫有二个独特的表现，一是：感染早期呈现一过性的总T细胞下降(CD4+下降引起)，然后T总数可略回升(CD8+上升引起),到AIDS时T总数全面下降，即T总数随病情进展而变化。二是：外周血单个核细胞中，激活的T细胞占很高比例，由于激化的T细胞很容易自溶而死亡，是容易造成感染后期大量T细胞死亡的原因之一。 1.CD4+细胞数量下降： HIVgp120与CD4结合后： 被巨噬细胞吞噬。 介导ADCC而溶解。 发生程式性凋亡。,HIV在CD4+细胞复制，产生大量病毒RNA，干扰了自身RNA的转录和蛋白的合成。细胞因没有养分而死亡。 大量病毒颗粒经细胞膜释放到胞外，造成胞膜严重破坏而引起死亡。 2. CD4+ 细胞功能受到抑制： HIVgp120与CD4结合，影响了CD4的表达，使表面的CD4下降，而T的抗原反应性需CD4的辅助。 HIVgp120与CD4结合后，由于空间位阻效应使CD3无法与MHC结合，从而难以启动T细胞激化程序。 有报导认为gp120与CD4结合后，可产生一种抑制性的传导信号，使T功能受抑制。 CD4+细胞对免疫调节，特别是维持细胞免疫与体液免疫之间的平衡有着重要的作用，其数量和功能的变化，势必打破免疫平衡。,3.CD8+细胞感染早期数量上升，后期则数量下降，其功能也随病情进展而逐步丧失。但其机制不明。 CTL细胞： 一般认为：HIV特异的CTL反应尽管未能有效地遏制HIV的复制和扩散以致最终导致AIDS，但在宿主的多种防御系统中，CTL是控制HIV复制和扩散的主要机制，在原发性感染时对清除病毒血症有着决定性作用，在潜伏期对抑制HIV繁殖起重要作用。除直接杀伤感染细胞外，还可通过分泌炎症因子和趋化因子而抑制HIV的繁殖。 HIV特异的CTL反应具有两大特点：一是反应异常强烈。二是反应多克隆性，表现为HIV特异的CTL具有针对几乎所有HIV抗原决定族的克隆。,HIV感染的初期(1w内)，特异的CTL即出现在循环血中(早于Ab的出现)，随着HIV复制，TL迅速增加，早期的CTL由相对均一的原发病毒所诱导，具有寡克隆的特征，而且具有严格的抗原特异性，一旦HIV发生变异，便失去细胞毒作用。保持1w左右，CTL由寡克隆迅速演变为多克隆，识别几乎所有的病毒蛋白，包括辅助蛋白(例rev、vif、tat)。表现为早期的超强反应和AIDS晚期的功能丧失。 1.HIV由于突变而逃脱CTL的监控：HIV复制的特点之一是高速率的复制错误。AIDS发病时大量变异株出现，而强烈的CTL反应只能使原发病毒和较早期的变异株受到抑制或杀死，但新的变异株则被复制而出现病毒逃脱现象。CTL始终在追逐HIV的变异而无法消灭该病毒。,2.CTL的耗竭：反馈性免疫调节功能紊乱甚至丧失，使CTL过度激活而耗竭。正常情况下，持续的抗原暴露将导致免疫效应细胞的自溶，并进行反馈性调节，避免免疫系统过度且无限制的激活。但HIV感染者反馈调节功能紊乱或丧失，无法控制CTL的无限激活，且激活的CTL比正常人激活CTL细胞更容易自溶而耗竭。 3.HIV蛋白产物可能具有超抗原的作用，可以直接激活TCR上受体而造成T细胞的大量激活，产生自溶。 4.CTL的效应功能下降：原因不详，一般发生在CD4+T严重降低后，可能是CD4+T下降引起IL-2分泌下降，Th1下降造成CTL功能下降。,三、单核、巨噬细胞 由于单核、巨噬细胞表面表达低水平的CD4，所以亦可受HIV感染，但与CD4+细胞不同的是：单核、巨噬细胞对HIV所致的细胞病变和细胞毒不敏感，所以不出现明显的数量下降。单核、巨噬细胞感染HIV后可产生大量的新病毒，而且这些病毒不一定释放到细胞外却可存放于吞噬小泡中，使特异性的CTL无法识别而不能被清除。单核、巨噬细胞成了AIDS的发病源，病毒扩散的携带者(例如单核细胞可穿过血脑屏障进入神经系统，通过循环血在体内扩散并感染肺、肝等器官）,四、NK细胞：目前还没有证据证明NK细胞受到HIV病毒的直接感染，其数量也没有明显改变，但其细胞毒功能、ADCC功能以及分泌IFN-和TNF-的能力下降，目前认为NK细胞的无反应性主要归因于缺乏激活因子(IL-12和IL-2)，但当受到因子激活则仍有杀伤靶细胞的能力。,HIV的检测： 1.初筛试验：ELISA、明胶凝集试验、金标法、自动化仪器直接测定 2.确证试验：免疫印迹法 确证试验结果判断：