PCR定点突变应用实例.docVIP

PCR定点突变应用实例+ T) E, , c% Q% ! r+ l. i1、 PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体，并比较研究FALL-39及其突变肽的功能：方法：应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1T为载体，构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术，用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和或第32位的天门冬氨酸，构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽；对纯化产物进行的：MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1：iNOS的表达，研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒pGEX-1T-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正确；DNA测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质粒pGEX-T-FALL-39-Lys32，用两步法得到pGEX-1T-FALL-39-Lvs24以及pGEX-T-FALL-39-Lys2432；重组原核表达质粒pGEX-T-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达，经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39，FALL-39-Lys24，FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys2432(约4Kd)：突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)值FALL-39-Lys2432最小，其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24，均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39两种蛋白均在含：Medium E的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后FALL-39-Lys32蛋白对LPS引起的iNOS mRNA的表达量增强抑制作用明显。结论：用FALL-39基因大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白；用高保真的Polybest DNA多聚酶进行一步法PCR定点突变技术简单、有效；突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加，较大剂量时略有增加，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。引自：用PCR定点突变方法研究人抗菌肽FALL-39功能与结构的关系，作者：杨云霞。) f) c2 , E1 8 |2、 基因改造中快速PCR定点突变方法应用：铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因为可以消除O-? 2而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症，但是由于多种因素影响，尤其是Cu，Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有610min)，使得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。定点突变技术是改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等。但由于这些方法操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到一定限制。本研究采用一种近年来新的定点突变技术快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD进行了基因改良(将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子，以提高其稳定性)，同时对该定点突变技术要点进行探讨。4 m8 I0 Q) M8 n1 R1) 材料# S+ 2 g* v& u 菌株与质粒? E.coli DH5，由本实验室保存。质粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约33kb)由本实验室构建，并转化于E.coli DH5保存。7 y# F# I$ ? + | 主要试剂? Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNA Marker,T4DNA连接酶，Eco RI等常规酶(上海Sangon公司)。# % r6 d+ B) N1 k # $ W pESOD质粒提取及鉴定? 用质粒快速抽提纯化试剂盒从含pESOD质粒的E.coli DH5转化菌里提取pESOD质粒，取部分质粒用EcoRI酶切后琼脂糖电泳鉴定，另取部分质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。$ H; x j0 l& m6 W X; H: x0 L2) 定点突变( z; 7 P* _ & t- c 引物设计? 根据hCu，Zn-SOD基因序列和定点突变的要求(将hCu，Zn-SOD中第111位Cys的密码子TGC突变为Ala密码子GCC)设计出一对包含突变位点的引物(正、反向)P1和P2,具体序列如下：P1：5CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3；P2：5GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3。下划线的碱基为突变位置。所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。% i0 Q1 |1 r|( U2 p: N3 L PCR定点突变? 整个反应体系为50l，其中含无菌去离子水41l，10Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5l，20molL P1、P2引物各1l，pESOD质粒1l(约100ng)，Pfu DNA聚合酶1l(5U)；反应条件为：94预变性3min；然后94变性1min，65 30s，72延伸7min，25个循环；最后72延伸7min，4保存。R3 Fi# _; Ds9 Q( o 转化? 用Dpn I限制性内切酶处理PCR反应产物，直接转化感受态的E.coli DH5，涂布培养后随机挑3个菌落并提取相应质粒，由上海博亚生物技术育限公司测序，测序引物P3：5ACTCAGGTACTGGGAGTG 3。 b% ! L p3 I) X 通过快速PCR定点突变，本研究实现了把hCu,Zn-SOD基因中的Cys111突变为Ala111。整个突变过程只需要1次PCR反应、1次DpnI酶解和1次转化，即完成了定点突变，无需对PCR产物进行末端处理，也无需进行亚克隆等，大大减少了传统定点突变的工作量，而突变成功率较高(本次实验随机挑取的3个菌落中有2个是阳性突变菌落)，尤其适用于大肠埃希菌来源的DNA。4 i. P. s, I3 ?* _; t% u- 快速PCR定点突变的技术要点：(1)准备突变的质粒必须是甲基化。(2)引物是一对包含突变位点的互补的(正、反向)核苷酸链，而且要比一般的PCR引物(18bp21bp)长，一般要在25bp以上，因为引物中含有突变位点，和模板不能完全匹配。(3)须要高保真的DNA聚合酶如Pfu Turbo聚合酶。(4)PCR产物要用DpnI酶充分酶切消化，以提高突变检出率。(5)PCR延伸步骤时间要充足；因为Pfu DNA聚合酶扩增速率为05kbmin，比Taq酶慢1倍左右。(6)高保真Pfu DNA聚合酶酶量要比普通PCR所需的Taq酶多一些；因Pfu DNA聚合酶不但扩增速率较慢，而且一步法PCR定点突变扩增的是整个质粒，故所需的总时间比一般的PCR时间要长很多，适当增加酶量以补充长时间高温下的酶活力损失。(7)克隆子最后需经测序验证；高保真不等于100保真。本研究挑选测序的3个菌落中有1个是未突变的阴性菌落，故后续的测序步骤不能省略。引自：周赞虎，张永祥，陈枝华，刘仁海，田蕴，郑天凌 2007-4-18 9:32:56 中国公共卫生 2007 年 1 月 第 22 卷 第 1 期基于PCR技术的常用基因突变检测方法有：8 X $ l( V, e4 ; _1、 PCR/ASO(allele specific oligonucleotide,ASO,等位基因特异性寡核苷酸) PCR/ASO探针诊断点突变，系在扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探针杂交，来明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。: Z9 7 v9 R+ & x2、 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR-SSCP系1989年由Orita首先报道的，它是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。该方法操作简单、灵敏且特异性高，是目前检测点突变最简捷的方法。, C# |& Y0 j7 |6 P, 3、 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism，RFLP，限制性片段长度多态性分析)RFLP分析与PCR反应相结合，先用PCR来扩增待检的片段，再进行RFLP来检测那些发生在酶切位点的突变简化了RFLP的分析过程，并使该项技术得到了广泛的应用。, H% z; 3 R( K2 m4、 DNA序列测定法(direct sequencing, DS). , 9 b8 ?* |, e0 q/ Y8 H# e; SPCR产物经克隆后测序或直接对PCR产物进行测序是所有进行基因突变检测的方法中最灵敏、最直接、最全面的，不仅可以确定突变的部位，还可以确定突变的性质。尤以循环测序法最具有代表性，该方法以TaqDNA聚合酶代替测序酶。测序反应通过多次的变性、退火、延伸来完成，具有快速、简便、灵敏等优点。但是DNA序列测定法所需的仪器和高昂的费用限制了它在临床诊断中的应用。! 1 z7 w1 i- % A3 t5、 异源双链分析(heteroduplex analysis, HA)该方法类似于SSCP。在一个PCR反应中，如果同时存在野生型和突变型的DNA模板，那么在PCR循环中突变型和野生型DNA形成的杂合双链DNA分子即异源双链DNA片段，它与同源双链在聚丙烯酰胺电泳中呈现不同的电泳速率，经聚丙烯酰胺电泳就可以将仅有一个碱基改变的异源双链片段与同源双链片段分开，从而达到诊断碱基突变的目的。该方法依赖于双链DNA分子序列依赖性的构象变化。对于小于300bp的小DNA片段其敏感性较好，且已在许多遗传性疾病中得到应用。 EO0 t2 D5 Q% 6、 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)DGGE是一项根据DNA解链特性分离鉴定DNA片段的技术。在温度和变性剂浓度增加时，DNA分子内一些称为变性区域的独立片段将发生变性。PCR扩增片段通过一线性增加的变性凝胶电泳体系时，一旦进入相当于某些区域解链温度(Tm)的变性剂浓度区将会解链形成分叉的DNA分子，并因此使迁移率显著下降。变性区域的解链温度(Tm)由其核苷组成决定，序列中发生一个碱基的改变，其解链温度Tm改变1.5，在变性梯度凝胶上表现出不同的迁移率。同SSCP比较，DGGE需要制备新鲜的梯度胶，检出率也较低，且只能确定突变的存在，不能进行突变位置和性质的定量分析。但DGGE无需知道待测片段的DNA序列，无需制备测试引物。# |9 D+ u/ t2 _ q0 w7、 化学错配裂解法(chemical mismatch cleavage, CMC) CMC是将同位素标记过的野生型DNA分子和突变型DNA(或RNA)片段混合后经过变性与复性, 形成DNA-DNA或DNA-RNA的异源杂交双链，在突变部位会产生凸起。对凸起处错配碱基进行化学修饰并使之从双链分子上断开，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影即可确定是否有突变发生。CMC法最大优点是能对放大片段进行“扫描”式分析,存在于序列中任何部位的突变都能被检出,多用于多基因突变的遗传病。9 T3 5 Q% h! C; r r0 O3 k此外还有等位特异性PCR(allele