维生素含量测定.docVIP

维生素C含量测定1、2,6-二氯酚靛酚滴定法2、碘量法3、2,4-二硝基苯肼比色法 碘量法 VC在水果中主要以还原型存在(还有氧化型及少量结合态)，因此通常测定的是还原型VC J。VC属于不稳定维生素，尤其是在液态时，易被热、碱、氧和光破坏，氧化型VC更不稳定，在测定中易受杂质的干扰。采用二氯酶法测定VC极不稳定，易受到还原性杂质的干扰，所以测定VC的准确性很大程度上取决于分析技术。选择合适的提取剂可以延长VC的稳定时间，提高VC的提取效率。VC在酸性溶液中相对稳定，因此试验中采用2的偏磷酸、2草酸、10三氯乙酸、2草酸+10盐酸溶液作为提取剂，分别对5种水果中的VC进行提取，并采用碘量法测定其含量。1 试验原料与试剂11 原料草莓、鲜枣、香蕉、西瓜、桃：市售，长春本地产。12 试剂1淀粉指示剂，001 molL的碘溶液，2偏磷酸，2草酸，10三氯乙酸，2草酸+10盐酸。2 工作原理碘可将VC氧化，且2分子碘可氧化1分子VC，碘遇淀粉变蓝，C2H8O6+2I2!=C2H4O6+4HI。在提取的水果样液中加人淀粉指示剂，用 0.01molL碘标准溶液进行滴定。当样液变蓝且保持15 S不褪色时，记录所用碘液的体积，计算得VC的含量【 。3 步骤与方法31 样品的制备取各水果样品400 g清洗、沥干，将每份样品平均分成4份，即每份100 g，用破碎机破碎。在破碎的同时加人提取剂，以减少VC损失。之后，用榨汁机榨汁，然后每份样品分别用2偏磷酸、2草酸、10三氯乙酸和2草酸+10盐酸提取。32 VC含量的测定在各份提取液中加人淀粉指示剂，用酸式滴定管装人碘标准溶液进行滴定，当溶液变蓝15 S不褪色时即为终点，记录碘液的体积.4 计算结果VC含量的计算公式为(1762)001V ，将消耗I2标准溶液的体积代人上式，得VC含量。5 结论2,4-二硝基苯肼比色法方法原理：维生素C总量包括还原型Vc、脱氢型Vc和二酮古乐糖酸，将样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一步水解为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2,4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。17.2.3.2主要试剂1、10 gL-1草酸，20 gL-1草酸；2、酸处理活性炭：取活性炭200g，加入19HCl 1000mL，煮沸后，抽气过滤，再用沸水1000mL煮沸过滤，重复用水洗至溶液中无Fe2+离子(用10 gL-1KSCN溶液试验无红色)，放在100120烘干。3、 20 gL-1 2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼(分析纯)2.00g溶解于100mL 4.5molL-1 H2SO4中。4、 4.5molL-1 H2SO4溶液：量取浓H2SO4(分析纯)250mL，慢慢倒入750mL水中，边加边搅拌。5、 100 gL-1硫脲溶液： 用500mLL-1酒精溶液溶解5.00g硫脲(分析纯)，使其最终体积为50mL。6、 H2SO4(91)溶液：量取浓硫酸90mL，慢慢倒入10mL水中。7、标准Vc溶液：称取维生素C(C6H8O5，分析纯) 20mg溶解于10 gL-1草酸溶液中，移入100mL容量瓶中，并用10 gL-1草酸溶液定容。吸取此溶液50mL，加入活性炭0.1g，摇1min，过滤。吸取此溶液5mL于100mL容量瓶中，用10 gL-1草酸溶液稀释定容。此Vc工作液为10mgmL-1。17.2.3.3操作步骤1.样品处理：称取适量样品(m)加等重量的20 gL-1草酸溶液，在组织捣碎机中打成浆状。取浆状物20g用10 gL-1草酸溶液移入100mL容量瓶中，定容过滤。2.样品中总Vc的测定：取滤渡10mL，加入10 gL-1草酸10mL(总Vc约110mgmL-1)，加一勺活性炭。摇1min，静置过滤。各取滤液2mL于样品管和样品空白管中，各管加入1滴硫脲溶液(注1)。于样品管中加入2,4-二硝基苯肼0.5mL，两管都加上盖子，置于37保温箱中保温3h。然后取出样品管放入冰水中(终止反应)。样品空白管取出后冷却至室温，然后加入2,4-二硝基苯肼0.5mL。然后在样品管和样品空白管皆置于冰浴中，从滴定管中滴加91硫酸溶液2mL于各管中，边滴边摇试管(防止溶液温度上升，溶液中糖炭化而转黑色)。将各管从冰浴中取出，在室温下放置30min后(注2)，立即在分光光度计540nm波长比色，读取吸收值，根据吸收值从标准曲线查出相应含量。3.标准曲线的绘制：吸取Vc标准工作液10，20，30，40，50mL稀释至50mL，即此系列含有2，4，6，8，10mgmL-1的Vc标准溶液。各取2mL于各标准管中，以下操作步骤同上样品测定。以上述Vc浓度系列为横座标，以吸收值(A)为纵座标作标准曲线。17.2.3.4结果计算 Vc总量(mgkg-1) =r201000/1000=r20式中 r从标准曲线查得的总抗坏血酸的含量(mgmL-1)； 20样品稀释倍数(2m/m)(100/20)(20/10) = 20 ； 1000分别代表1000g样品中总Vc的含量和将mg换算成mg。17.2.3.5 注释注1.硫脲可防止Vc被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。注2.加入H2SO4(91)溶液后试管从冰水中取出，溶液颜色会继续变深，所以必须准确加入H2SO4后30min内比色。维生素A测定法本法是用分光光度法测定维生素A在特定波长处的吸收度来计算其含量，以单位表 示，每单位相当于全反式维生素A醋酸酯0.344g或全反式维生素A醇0.300g。由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料药中混有其他杂质，所测得的吸收度不是维生素A独有的吸收。在以下规定的条件下，非维生素A物质的无关吸收所引入的误差可以用校正公式校正，以便得到正确结果。校正公式系采用三点法，除其中一点是在吸收峰波长处测得外，其他两点分别在吸收峰两侧的波长处测定，因此仪器波长若不够准确时，即会有较大误差，故在测定前，应校正仪器波长。测定应在半暗室中尽速进行。合成维生素A和天然鱼肝油中的维生素A是酯式维生素A。如供试品中干扰测定的杂质较少，能符合下列第一法测定的规定时，可直接用溶剂溶解供试品后测定；否则应按第二法，经皂化提取，除去干扰后测定。第一法取供试品适量，精密称定，加环己烷溶解并定量稀释制成每1ml中含915单位的溶液，照分光光度法（附录 ）,测定其吸收峰的波长，并在下列各波长处测定吸收度，计算各吸收度与波长328nm处吸收度的比值和波长328nm处的E1 1cm值。波长, nm吸收度比值波长, nm吸收度比值3000.5553400.8113160.9073600.2993281.000如果吸收峰波长在326329nm之间，且所测得各波长吸收度比值不超过上表中规定的0.02，可用下式计算含量：每1g供试品中含有的维生素A的单位E11cm(328nm)1900如果吸收峰波长在326329nm之间，但所测得的各波长吸收度比值超过表中规定值的0.02，应按下式求出校正后的吸收度，然后再计算含量。A(校正)3.52(2AAA)如果校正吸收度与未校正吸收度相差不超过3.0,则不用校正吸收度，仍以未经校正的吸收度计算含量。如果校正吸收度与未校正吸收度相差在15至3之间,则以校正吸收度计算含量。如果校正吸收度超过未校正吸收度的-15或+3,或者吸收峰波长不在326329nm之间，则供试品须按下述第二法测定。第二法精密称取供试品适量(约相当于维生素A总量500单位以上,重量不多于2g),置皂化瓶中，加乙醇30ml与50(g/g)氢氧化钾溶液3ml，置水浴中煮沸回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内部，将皂化液移至分液漏斗中（分液漏斗活塞涂以甘油淀粉润滑剂）,皂化瓶用水60100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的.振摇提取4次，每次振摇约5分钟，第一次60ml，以后各次40ml，合并.液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤应缓缓旋动，避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色，.液用铺有脱脂棉与无水硫酸钠的滤器滤过，滤器用.洗涤，洗液与.液合并，放入250ml量瓶中，用.稀释至刻度，摇匀；精密量取适量,置蒸发皿内,在水浴上低温蒸发至5ml后，置减压干燥器中，抽干，迅速加异丙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含维生素A915单位，照分光光度法(附录 ),在300、310、325与334nm四个波长处测定吸收度 ，并测定吸收峰的波长。吸收峰的波长应在323327nm之间，且300nm波长处的吸收度与325nm波长处的吸收度的比值应不超过0.73，按下式计算校正吸收度。A(校正)6.815A2.555A4.260A每1g供试品中含有的维生素A的单位E11cm(325nm,校正)1830如果校正吸收度在未校正吸收度的3以内,则仍以未经校正的吸收度计算含量。如果吸收峰的波长不在323327nm之间，或300nm波长处的吸收度与325nm波长处的吸收度的比值超过0.73，则应自上述皂化后的.提取液250ml中，另精密量取适量(相当于维生素A300400单位)，减压蒸去.至约剩5ml，再在氮气流下吹干,立即精密加入甲醇3ml，溶解后，精密量取500l，注入维生素D测定法（附录 K）第二法项下的净化用色谱柱系统，准确收集含有维生素A的流出液，在氮气流下吹干,而后照上述方法自“迅速加异丙醇溶解”起，依法操作并计算含量。【附注】（1）甘油淀粉润滑剂取甘油22g，加入可溶性淀粉9g, 加热至140,保持30分钟并不断搅拌，放冷，即得。（2）不含过氧化物的.照.项下的过氧化物检查，如不合于规定,可用5硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取.层，再用水振摇洗涤1次，重蒸,弃去首尾5部分，馏出的.再检查过氧化物，应符合规定。维生素D测定法 本法系用高效液相色谱法(附录 )测定维生素D(包括维生素D和D,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D0.025g。测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。 无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测 定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。 第一法 对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D或D对照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。测定维生素D时，应另取维生素D对照品25mg，同法制成维生素D对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。 内标溶液的制备 称取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷正戊醇（9973）为流动相，检测波长为254nm。量取维生素D对照品贮备溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90水浴中加热1小时，取出迅速冷却，加正己烷5ml， 摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下， 将石英吸收池斜放成45,并距灯管56cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D、反式维生素D、维生素D和速甾醇D；取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D的峰值，先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0；前维生素D(与维生素D的比保留时间约为0.5)与反式维生素D(与维生素D的比保留时间约为 0.6)以及维生素D与速甾醇D(与维生素D的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D的校正因子f。另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后，密塞，置90水浴中加热15小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f。 f(AmfmA)Am式中 A为内标的峰值； m为加入对照品的量； f为维生素D的校正因子； m为加入内标物质的量； A为维生素D的峰值； A为前维生素D的峰值。 含量测定 取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量(m)。 m(fAfA)mA 式中 A为维生素D的峰值； A为前维生素D的峰值； m为加入内标物质的量； A为内标的峰值。 第二法 精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50(gg)氢氧化钾溶液3ml若供试量为3g，则加50(gg)氢氧化钾溶液4ml，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60100ml分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml,以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供