益生菌在酸乳保鲜中的应用研究.doc

益生菌在酸乳保鲜中的应用研究摘要：当前天然食品保鲜方案的开发和应用已成为国内外食品科技研究的前沿热点，生物保鲜以优越的特性获得人们越来越多的重视。以商业生物保鲜菌为参照，研究了益生菌Lactobacillus plantarum P-8(L. plantarum P-8)在酸乳发酵和贮藏过程中对酵母菌和霉菌污染的控制，并评价其对酸乳品质的影响。结果表明，L. plantarum P-8添加量为3.0106cfu/g时，酸乳25 贮藏15 d时能显著抑制酵母菌和霉菌的生长(P0.05)，对污染酸乳的酵母菌和霉菌控制效果良好，且在贮藏过程中不会影响酸乳的品质，此外益生菌L. plantarum P-8的活菌数在贮藏期间也维持稳定。说明益生菌L. plantarum P-8具有作为生物保鲜菌的优良特性，可应用于酸乳制品的工业化生产。关键词：Lactobacillus plantarum P-8；生物保鲜菌；酸乳品质Application of probiotic Lactobacillus plantarum P-8 in yoghurt aspreservative culturesAbstract:Fresh-keeping strategy application and development in natural food become more and morepopular in current frontier of food biotechnology research and bio-fresh keeping had aroused great publicfocus. The aims of present study was to investigate the effect of probiotic Lactobacillus plantarum P-8(L. plantarum P-8) and commercial fresh-keeping bacteria in yogurt during storage with respect to yogurtquality and yeast and mould control. The result showed that adding 3.00106cfu/g of L. plantarum P-8in milk could significantly inhibit the growth of yeast and mould during the storage of yogurt at 25 for益生菌酸乳具有高营养价值，且含大量对人体健康有益的活性益生菌，但酸乳保质期相对较短，即便在冷藏条件下也不超过21 d，这在一定程度上限制了酸乳市场的拓展空间1。影响酸乳保质期的主要因素有2个：一是酵母菌、霉菌及其他杂菌的污染，表现为胀包，有异味；二是酸乳的后酸化作用2。过去酸乳里曾添加化学制剂山梨酸，防止酵母菌及霉菌的生长，控制酸度和发酵过程3。但我国卫生部明确规定(GB 27461999)，酸乳中不允许添加防腐剂，利用乳酸菌的抑菌作用延长乳制品、发酵蔬菜和肉品货架期逐渐被应用于食物的保鲜，并被认为是安全可靠的天然防腐剂4。L. plantarum P-8分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗牧民家庭手工制作的酸牛乳样品中，L. plantarum P-8在pH2.5人工胃液中消化3 h，存活率为90.16%；pH2.0人工胃液中消化3 h，存活率为42.85%，之后进入pH8.0的人工肠液消化12h，存活率为94.87%。L. plantarum P-8在胆盐浓度为0.3%1.8%范围内均具有耐受性5-6。动物试验证实L. plantarum P-8具有降胆固醇和降血脂的功效7。本试验以商业生物保鲜菌为参照，研究益生菌L. plantarum P-8对酸乳发酵时间、酸乳发酵和贮藏过程中对酵母菌和霉菌的抑制效果以及对酸乳品质的影响，还有酸乳贮藏过程中益生菌活菌数的变化情况，旨在为益生菌L. plantarum P-8进一步应用于实际生产提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株来源 L. plantarum P-8分离自内蒙古巴彦淖尔市牧民家庭手工制作的酸牛乳样品中，由内蒙古农业大学乳品与生物技术教育部重点实验室乳酸菌菌种库保藏，其发酵剂活菌数为21011cfu/g。商业生物保鲜菌活菌数为1.31011cfu/g。1.1.2 菌株的活化 将冷冻干燥保存的菌粉(接种量1%)接种于MRS液体培养基中，37 培养18 h传代培养2次。1.2 主要试剂和仪器全脂乳粉、脱脂乳粉：新西兰恒天然公司；蔗糖、鲜牛乳(无抗生素等添加剂)：市售；商业发酵剂L822：丹麦科汉森公司。雷磁PHS-3C pH计：上海精密科学仪器有限公司；NSC-A-1200无菌工作台：日本；HIRAYAMAHA-300M型全自动高压灭菌器；ADVANTECSP-650全自动高压干热灭菌器；STAC-S45F恒温培养箱；Brookfield DV-1VISCOMETE黏度仪。1.3 方法表1为试验的分组和设计。表1 试验分组和设计编号 组别L.plantarum P-8添加量/(cfu/g)1 L822(2%) 02 商业生物保鲜菌+L822(2%) 1.301063 P-8+L822(2%) 2.401064 P-8+L822(2%) 3.001065 P-8+L822(2%) 3.601061.3.1 酸乳的制备 全脂乳粉或脱脂乳粉10%、蔗糖6.5%，经巴氏杀菌后冷却至42 ，分别接种汉森发酵剂L822(接种量2%)和L. plantarum P-8或汉森发酵剂L822和商业生物保鲜菌，于42 发酵至终点pH4.50.05。采用市售新鲜牛乳直接制备酸乳(未灭菌)。42 时，分别接种汉森发酵剂 L822(接种量2%)和L. plantarum P-8或汉森发酵剂L822和商业生物保鲜菌，于42 培养6.5 h。发酵结束时，将发酵样品迅速降温至4 ，并在4 后熟，于发酵前、后熟后、3、15 d时分别取样检测酵母菌及霉菌活菌数。新鲜牛乳预热至(555) ，将白砂糖完全溶解其中，过滤后于20 MPa(65 )均质，95 杀菌5min，冷却至42 分别接种汉森发酵剂L822(接种15 d (P0.05). It suggested that L. plantarum P-8 showed favorable inhibitory effect on contaminatedyoghurt. The quality of yoghurt was not influenced by adding L. plantarum P-8 during the storage and theviable counts of L. plantarum P-8 did not change significantly. These results indicated L. plantarum P-8possessed the potential preservative ability for industrial application.Key words: Lactobacillus plantarum P-8; preservative culture; the quality of yogurt食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第10期生物工程 4 量2%)和L. plantarum P-8或汉森发酵剂L822和商业生物保鲜菌，置于42 培养6.5 h。发酵结束时，将发酵乳样品迅速降温至4 ，并在4 后熟，之后于25 贮藏21 d，每7 d测定酸乳的pH值、滴定酸度、黏度、持水性和L. plantarum P-8活菌数。1.3.2 pH值的测定 试验样品调整温度至2022，用雷磁PHS-3C型pH计测量。1.3.3 酸度(T)的测定 参照GB 5413342010食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定方法。1.3.4 霉菌和酵母菌检验8参考GB/T 4789.152010，采用孟加拉红培养基。1.3.5 酵母菌和霉菌抑制率的测定抑制率(%)=(对照组活菌数-商业生物保鲜菌组活菌数或L. plantarum P-8组活菌数)/对照组活菌数1.3.6 黏度测定 将发酵乳样品调整温度至2022 ，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度仪(Brookfield Engineering Laboratories，inc，Middleboro，MA)4#转子进行测定，其中转子转速为100 r/min、扭矩10%100%、测定时间30 s。1.3.7 持水性的测定 称取20.0 g酸乳样品，置于带有滤纸的漏斗中，4 放置2 h，收集滤液称重。持水性(%)=1-(滤液质量g/样品质量g)1001.3.8 活菌数的测定 对L. plantarum P-8的选择培养：10.0 g酸乳样品与90.0 g生理盐水溶液(质量分数为0.85% NaCl)中，于水平摇床(200 r/min)振摇20 min，然后于上述生理盐水溶液梯度稀释，采用MRS-V(万古霉素10 mg/L)固体培养基平板倾注法，37 厌氧培养48 h。1.4 数据及统计分析每个样品的pH值、滴定酸度、黏度、持水性等指标均做3个平行样，试验结果用平均数标准差(MeansSD)来表示，采用DPS软件在P0.05水平进行ANOVA分析，采用Origin8.0软件做图。2 结果与讨论2.1 L. plantarum P-8对酸乳发酵时间的影响制备酸乳的原料成分不同对其发酵速度有影响9，为了排除鲜乳成分不稳定因素的干扰，本部分试验分别采用复原脱脂乳及复原全脂乳进行发酵。如图1所示，L. plantarum P-8的添加可以不同程度地缩短复原脱脂乳(RSM)和复原全脂乳(RWM)的发酵时间，其原因在于L. plantarum P-8能够在发酵过程中产生微量的有机酸，并促进酸乳菌种的生长，从而加快酸乳发酵速度，缩短发酵时间。以L. plantarum P-8添加量为3.0106cfu/g为例，添加L. plantarum P-8的RSM与添加商业生物保鲜菌组发酵时间没有显著差异(P0.05)，RWM的发酵时间没有变化。并且复原脱脂乳的发酵时间普遍较复原全脂乳的发酵时间长。谢继志10研究发现，在乳固体含量相同的原料乳中，由于复原脱脂乳中要比复原全脂乳含有更高的非脂乳固体，产生较少的游离脂肪酸。结果表明，L. plantarumP-8不会对酸乳发酵时间造成显著影响。2.2 L. plantarum P-8在酸乳发酵和贮藏过程中对酵母菌及霉菌的抑制作用图1 L. plantarum P-8对复原脱脂乳/复原全脂乳发酵时间的影响图2 L. plantarum P-8在发酵和贮藏过程中对酵母菌和霉菌的抑制作用酸乳保质期限制的主要因素是乳中酵母菌和霉菌的污染，酸乳的较高酸度会抑制大部分细菌的生长，而酵母菌及霉菌生长所需的pH值范围较宽(pH2.08.5)，尤其是弱酸性环境(3.0pH7.0)更利于其生长繁殖，因此，酸乳本身的条件决定了其可作为霉菌和酵母菌生长的理想培养基质11。试验对未经过灭菌的市售鲜牛乳，测定酵母菌和霉菌的活菌数分别为 3.47104、1.00103cfu/mL。如图2所示，酸乳后熟完成时，酵母菌活菌数增加了近一个数量级，而霉菌活菌数减 5 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第10期生物工程少近一个数量级。以1#(对照组)为基础，2#(商业生物保鲜菌组)与L. plantarum P-8组(2.40106、3.00106、3.60106cfu/g)对酵母菌的抑制率分别为3.37%、2.84%、3.55%、1.95%，对霉菌的抑制率分别为8.65%、4.81%、6.25%、8.17%。添加3.00106cfu/g的L. plantarum P-8能较好地抑制酵母菌的生长，且与商业生物保鲜菌的抑制作用没有显著差异(P0.05)。酸乳25 贮藏3 d，与对照组相比，商业生物保鲜菌组与L. plantarum P-8组(2.40106、3.00106、3.60106cfu/g)对酵母菌的抑制率分别为3.30%、2.15%、3.01%、2.44%，对霉菌的抑制率分别为8.42%、7.63%、9.21%、7.89%。添加L. plantarum P-8组与商业生物保鲜菌组对酵母菌的抑制作用没有显著差异(P0.05)，添加3.00106cfu/g的L. plantarum P-8抑制霉菌的效果优于商业生物保鲜菌。酸乳在贮藏15 d时，与对照组相比，商业生物保鲜菌组与L. plantarum P-8组(2.40106、3.00106、3.60106cfu/g)对酵母菌的抑制率分别为18.20%、17.16%、19.24%、18.37%，对霉菌的抑制率分别为15.68%、10.27%、14.59%、11.35%。添加L. plantarumP-8组与商业生物保鲜菌组对霉菌的抑制作用没有显著差异(P0.05)，添加3.00106cfu/g的L. plantarum P-8对酵母菌的抑制效果优于商业生物保鲜菌。与对照组相比，添加商业保鲜菌组和添加益生菌L. plantarum P-8组抑制酵母和霉菌的作用显著(P0.05)，且添加3.00106cfu/g的L. plantarum P-8抑菌效果较好。贮藏15 d的酸乳与贮藏3 d的酸乳相比，对照组、商业生物保鲜菌组、L. plantarum P-8组(2.40106、3.00106、3.60106cfu/g)酵母菌活菌数分别减低17.22%、29.97%、27.40%、31.07%、30.74%；霉菌活菌数分别减低2.63%、10.34%、8.03%、8.41%、6.82%。其中，酸乳添加3.00106cfu/g的L.plantarum P-8抑制酵母菌和霉菌的能力较好，且抑制酵母菌的能力优于商业生物保鲜菌。有研究者发现，由乳酸菌分泌的细菌素在pH降低到5.5的情况下可以对革兰阴性细菌及酵母菌发挥抑菌作用12。低pH值联合EDTA类的螯合剂可以使革兰阴性细菌和酵母菌对于乳酸菌分泌的细菌素产生过敏反应，这一效果的产生主要由于细菌素干扰细胞壁的通透性及破坏细胞外膜的完整性13。然而，我们不能忽略一点即由有机酸(乳酸或者乙酸)造成的低pH环境，对酵母菌和霉菌的生长及致腐败作用有一定的抑制效果14。通过上述试验得出，添加3.00106cfu/g的L.plantarum P-8能有效抑制酵母菌和霉菌的生长，且不影响酸乳的发酵时间。后续的试验主要研究添加3.00106cfu/g的L. plantarum P-8对酸乳贮藏期间品质的影响以及贮藏期间益生菌L. plantarumP-8活菌数的变化情况。2.3 酸乳贮藏期间pH值、滴定酸度、黏度和持水性的变化酸乳于25 贮藏21 d期间，pH值、滴定酸度、黏度和持水性的变化如图3、图4所示。图3 酸乳贮藏期间pH、滴定酸度的变化图4 酸乳贮藏期间黏度、持水性的变化如图3所示，随着贮藏时间的延长，3组样品的pH呈降低趋势，相应的滴定酸度呈上升趋势。后熟完成时，3组样品的酸度差异不显著(P0.05)。贮藏7 d时，商业生物保鲜菌组和L.plantarum P-8组的酸度显著高于对照组(P0.05)，这可能是由于商业生物保鲜菌和L. plantarum P-8与发酵菌L822发生共生作用，样品中有更多的乳酸和乙酸生成，导致样品中酸度的增加15。贮藏14 d时，商业生物保鲜菌组的酸度显著高于对照组和L. plantarum P-8组(P0.05)。贮藏21 d时，商业生物保鲜菌组的酸乳酸度显著高于对照组酸乳酸度(P0.05)，虽然L. plantarum P-8组酸乳酸食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第10期生物工程 6 度高于对照组酸乳酸度，但没有显著性差异(P0.05)，L. plantarum P-8组酸乳酸度低于商业生物保鲜菌组酸乳酸度。这说明，与这种生物保鲜菌相比，益生菌L. plantarum P-8对酸乳的后酸化影响较小。王水泉16研究L. plantarum P-8在豆乳及牛乳中发酵特性的研究时发现，L. plantarum P-8与Thermophillus ND05复配发酵酸乳，具有黏度高、酸度适宜、无乳清析出、拉丝性和风味好的优点。酸乳的黏度受很多因素影响，主要包括原料乳的热处理、酪蛋白含量、发酵剂和培养温度等。乳酸菌分泌的乳酸使乳中酪蛋白凝固并通过氢键和二硫键形成一个网状结构。当酸乳中的蛋白含量下降或者酸乳受到机械处理时，会导致可接触链数量上的减少及脆弱化学键的断裂，从而引起酸乳表观黏度的降低。如图4所示，贮藏7 d时，酸乳的黏度有所增加，之后逐渐减低，酸乳的持水性则是持续减低。这可能是因为乳酸菌中的酶作用乳中酪蛋白胶束，使黏度和持水性减低17。在贮藏过程中，虽然添加L. plantarum P-8的酸乳在贮藏过程中，持水性和黏度都有所下降，但L. plantarumP-8组黏度和持水性比商业生物保鲜菌组较高，且具有显著性差异(P0.05)，说明添加益生菌L.plantarum P-8的酸乳在贮藏过程中黏度和持水性维持较好。2.4 酸乳贮藏期间L. plantarum P-8活菌数变化益生菌酸乳于25 贮藏21 d期间，益生菌L.plantarum P-8活菌数变化如图5所示。P-8活菌数在贮藏过程中保持恒定。而大量研究表明，益生菌在酸乳贮藏过程中存活率较低18-20，后酸化导致的低pH值是造成其存活率较低的主要原因，这显示出益生菌L. plantarum P-8在益生菌酸乳中的优势。3 结论酸乳中添加3.00106cfu/g的益生菌L.plantarum P-8，能够有效控制霉菌和酵母菌对酸乳的污染，起到延长酸乳保质期的作用。益生菌L. plantarum P-8对酸乳发酵时间的影响较小，不会显著增加酸乳的后酸化进程，对酸乳贮藏期的酸度、黏度和持水性无不良影响。酸乳中的益生菌L. plantarum P-8在25 ，21 d贮藏期间活菌数不会显著减低。综上所述，益生菌L. plantarumP-8具有作为生物保鲜菌的潜在优良特性。参考文献：1李向东,吕加平,范贵生.长保质期酸乳的研究进展J.食品与发酵工业,2006,32(10):119-1232潘利华,夏云梯,朱克美,等.Nisin对酸乳品质的影响研究J.合肥工业大学学报,2002,25(4):619-6233陈历俊,乔为仓.酸乳加工与质量控制M.北京:北京轻工业出版社,20104Budde BB, Hornbaek T, Jacobsen T, et al. 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Food Chemistry,2008,1(106):11-17图5 酸乳贮藏期间L. plantarum P-8活菌数变化(25 ，21 d)如图5所示，酸乳贮藏期间，L. plantarum P-8活菌数变化没有显著性差异(P0.05)，始终保持在1.9107cfu/mL以上。王水泉16研究L. plantarumP-8在豆乳及牛乳中发酵特性时发现，L. plantarum(下转第11页) 11 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第10期生物工程肠球菌对于青霉素、红霉素、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星的药敏率有着明显的差别，但是对于氨基糖苷类耐药率都较高，这与其他研究者的结果一致14。6株试验菌株均对喹诺酮类(氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星)、大环内酯类(红霉素)、青霉素类(氨苄西林、阿莫西林)药物敏感，有2株菌对氨基糖苷类药物有抗性，说明试验菌株安全，但对其是否存在潜在的可转移的耐药质粒，有待进一步研究。参考文献：1徐少泽.马奶、酸马奶的食疗和医用价值J.中国民族医药杂志,2012,(2):21-222王瑞珍.酸马奶的营养成分与保健特性J.养殖技术顾问,2012,(10):247-2483贺银凤,翟光超,李少英,等.酸马奶酒中粪肠球菌H1-1抑菌物质的提取与纯化研究J.食品科技,2008,29(3):50-524贺银凤,李少英,母智深,等.酸马奶酒中微生物的分离鉴定及抗菌特性的研究J.农业工程学报,2002,18:91-955李少英,乌尼.马奶酒中乳酸菌的分离及其生物学特性的研究J.内蒙古农业大学学报:自然科学版,2002,23(4):59-666李少英,乌尼,李培峰,等.内蒙古牧区乳与乳制品中乳酸菌资源及其生态分布J.生态学杂志,2006,25(12):1495-14997张刚.乳酸细菌基础技术和应用M.北京:化学工业出版社,2007:4218内村泰,岗田早苗.乳酸菌试验手册(日文版)M.东京,朝仓书店,1992:30-739李少英.奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的分离鉴定及耐药性研究D.呼和浩特:内蒙古农业大学博士学位论文,2008:37-4310孙长贵.抗菌药物敏感性试验执行标准S.2009: 56-58,83-8411Hunger W, Peitersen N. 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