芦丁的提取分离及鉴定16K.doc

2011届本科生毕业论文 2011届本科生 毕 业 论 文 题 目 芦丁的提取分离及鉴定 作 者 单 位 陇东学院化学化工学院 指 导 老 师 胡浩斌 作 者 姓 名 张娜娜 专 业 班 级 2007级化学本科(2)班 提 交 时 间 二一一年四月 芦丁的提取分离及鉴定张娜娜，胡浩斌（陇东学院 化学化工学院，甘肃 庆阳 745000）摘 要：目的 以芦丁为例学习黄酮类化合物的提取方法，掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮甙，甙元和糖的部分鉴定方法。方法 采用水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法对芦丁进行提取分离，并对其进行定性分析及色谱鉴定。结果 水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法，三种方法均可制的芦丁，且质量合格。结论 从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流是较理想的提取方法。制得芦丁产率高，且测定方法简单、迅速、灵敏度高。关键词：槐花米；芦丁；槲皮素；提取；分离；鉴定Extraction, Seperation and Identification of RutinZhang Nana, Hu Haobin(College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu)Abstraction: Objection Rutin as an example to learn the extraction of flavonoids square. Grasp the main properties and flavonoids ingredients flavonoids glucoside. Method With the water extraction method, buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) extraction to extraction and separation of rutin and chromatographic identification. Result Water extraction method, Buck (limewater) extraction, organic solvent (alcohol) extraction,three methods are made rutin and obtaining rutin quality qualified. Conclusion From improve yield and purity of rutin angle, ethanol refluxing was ideal extraction method. Preparation of rutin of high yieldhigh sensitivity. determination method is simple to rutin rapid.Key word: Sophora japonica; rutin; quercetin; extraction; separation; identification引 言 随着人们生活水平及质量的不断提高，心脑血管病的发病率也呈上升趋势，而且死亡率居各种疾病之首，因此，对治疗和预防心脑血管病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要，黄酮类化合物在心脑血管病的治疗上起到举足轻重的作用。目前研究最为广泛的是以槐米为主要原料提取黄酮类化合物。槐米，豆科植物槐（Sophora japonica L）的未开放花蕾。中医临床上作为止血药，常用来治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻出血等，并有清肝泻火、治疗肝热目赤、头痛眩晕的功效。药理研究表明，它能保持毛细血管正常的抵抗力，降低血管通透性，可使因脆性增加而出血的毛细血管恢复正常的弹性，还有抗炎，解痉等作用。槐米的主要成分中芦丁含量高达1216，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。近年来有文章报道槐米具有治疗糖尿病的功效。芦丁的药用价值开发利用较早，但芦丁与其苷元槲皮素均难溶于水，为了改善其在水中的溶解性状，增强其药理活性，科研人员对其进行了长期而又有效的研究，主要包括化学结构的改造，衍生物、复合物的制备，无机酸酯盐以及B-环糊精包合物和共沉淀物的研制等。为了提高芦丁的提取效率，避免资源浪费，摸索一种芦丁的提取方法也显得尤为重要，目前可采用的提取方法有（热）碱提取法、热水提冷析出法、热水提大孔吸附树脂纯化法、超声辐射法、热水提、醇除杂、酸沉淀法、冷碱渗漉提取酸沉淀、连续回流提取、乙醇浸提法、超临界二氧化碳提取法、杀酶碱提、连续萃取法从槐米中提取芦丁和微波法等。其中最常用，工艺较成熟的是石灰水法。芦丁，又名芸香甙、维生、紫槲成甙，广泛存在于植物界，如芸香、苦荞麦、槐树蕾、楸树叶、蒲公英、番茄茎、赤豆等均含有丰富的芦丁，尤以槐花米（Sophora japoina L.的花蕾）和荞麦叶中含量最高。芦丁能凉血止血，清肝泻火，具有抗炎作用。还具有抑制醛糖还原酶的作用，用于预防脑溢血，高血压，视网膜出血，急性出血肾炎，治疗慢性气管炎，对糖尿病型白内障也有较好的治疗，而且芦丁对紫外线具有较强的吸收作用，在化妆品中添加10%的芦丁，紫外线的吸收率可达98%以上9。本实验主要以槐花米为原料提取芦丁，并以芦丁为例学习黄酮类化合物的性质及部分鉴定方法。1 实验部分1.1 实验原理 芦丁（Rutin）：C27H30O163H2O，浅黄色针状结晶，mp 174178 （含三分子水）；188 （无水物）。难溶于冷水（1:800010000），可溶于热水（1:180200），热甲醇（1:10），冷甲醇（1:100），热乙醇（1:60），冷乙醇（1:650），难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮，易溶于碱液芦丁槲皮素（Quercetin）：C15H10O72H2O，黄色结晶，mp313314 （2分子结晶水），316 （无水物）。能溶于冷乙醇（1:290），易溶于沸乙醇（1:23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，难溶于水、苯、石油醚等溶剂。槲皮素还含有皂甙，其粗制品为白色粉末，经酸水解后得二种皂甙元及糖部分，这两种皂甙元是白桦酯醇和槐花米双醇，另外还含槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。本实验是利用芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液，在酸液中沉淀析出的性质进行提取分离。利用芦丁易溶于热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此可进行槲皮素的制备。通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。1.2 实验仪器及药品SHZ-D循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器一厂），HH-Z电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），烧杯（1000ml），圆底烧瓶，球形冷凝管，漏斗，托盘天平，抽滤瓶，布氏漏斗滤纸，试管，滴管，新华1号滤纸，铅笔，铁架台，电炉，石棉网，橡皮管。 槐花米（2011年购于同仁堂大药房），95%乙醇，浓硫酸，浓盐酸，镁粉，醋酸铅试剂，1-萘酚，正丁醇，醋酸，1%三氯化铝-乙醇溶液，无水乙醇，硼砂水，饱和石灰水。1.3 芦丁的提取1.3.1 水提法取20 g槐米于烧杯中用水漂洗干净，捞取上浮的花蕾弃去下沉的杂质，将洗净的花蕾置于1000 ml的烧杯中，加沸水500 ml煮沸45 min，不断补充蒸发掉的水，趁热过滤（用棉花），再用200 ml沸水提取30 min，合并两次滤液，浓缩体积至1/2放置过夜，析出芦丁，抽滤、沉淀用少量冷水洗三次、抽干，60 以下干燥、称重，计算得率。1.3.2 碱水(石灰水) 提取法取20 g槐花米于研钵中研成粉状物，置于250 mL烧杯中，加入150 mL饱和石灰水溶液，于石棉网上加热至沸腾，并不断搅拌，煮沸15 min后抽滤，滤渣再用100 mL饱和石灰水溶液煮沸10 min，抽滤。合并两次滤液，然后用15%盐酸(约5 mL )中和，调节pH为34。放置1 h2 h，使沉淀完全，抽滤，沉淀用水洗涤23 次，得芦丁粗品。将粗品芦丁置于250 mL的烧杯中，加水150 mL于石棉网上加热至沸腾，不断搅拌并慢慢加入约50 mL饱和石灰水溶液，调节溶液pH为89，待沉淀溶解后，趁热过滤。滤液置于250 mL的烧中，用15%盐酸调节溶液的pH值为45，静置30 min，芦丁以浅黄色结晶析出。抽滤，产品用水洗涤12次，烘干后约重1.5 g，熔点183 190 (不含结晶水)。碱水提取是利用芦丁在碱水中成盐而增大溶解能力，加酸酸化后可析出结晶的原理进行的。1.3.3 有机溶剂(乙醇) 回流法将20 g粉状槐花米、碳酸氢钠和酒精置于回流装置中，加热至沸，待芦丁完全溶解后，取出过滤，进行蒸馏浓缩，至粘稠状时，加入蒸馏水及2 %的活性炭，调节pH为7.58，加热煮沸20 min，趁热过滤，滤液调节pH=为7，自然冷却，结晶析出，烘干，称重。1.4 芦丁的精制1.4.1 重结晶将粗制芦丁研细，加95%乙醇回流溶解（每2 g芦丁需加70 ml左右乙醇）趁热过滤，取1/2滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，放置，析出结晶，抽滤，干燥称重，得精制芦丁，计算得率。1.4.2 芦丁的水解取另1/2量芦丁滤液，加入1 mol硫酸（80 ml）水浴回流一小时（用聚酰胺薄层检查水解是否完全）待全部水解后，蒸去乙醇，冷却、析出槲皮素、抽滤、滤液内含糖。槲皮素沉淀经水洗、抽干、干燥称重，计算得率。再用乙醇重结晶一次，得黄色针晶，为槲皮素精品。 +鼠李糖+葡萄糖含糖的溶液，取20 ml于水浴上加热，同时于搅拌下加硫酸钡细粉中和至中性。滤除白色的硫酸钡沉淀，滤液在水浴上浓缩至1-2 ml，供纸色谱用。表1 芦丁的提取与精制（t=45min）Table 1 Rutin extraction and refined (t = 45min)原料槐米芦丁精制芦丁槲皮素质量（g）19.23.02.01.2得率（%）9615.6366.71.0表2 芦丁的提取与精制(t=90min）Table 2 Rutin extraction and refined (t = 90min)原料槐米芦丁精制芦丁槲皮素质量（g）19.21.80.90.6得率（%）969.385066.672 鉴定2.1 性质实验2.1.1 盐酸-镁粉反应：取芦丁少量，加乙醇数滴溶解，再加浓盐酸5滴，最后加少量镁粉，观察颜色变化。2.1.2 醋酸铅沉淀反应：取芦丁少许溶于热水，加醋酸铅试剂数滴，观察结果。2.1.3 Molish反应：取芦丁和槲皮素少量，分别置于两支试管中各加乙醇数滴，加1-萘酚数滴摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加浓硫酸5滴，静置，观察二层溶液界面处的颜色变化。表3 槲皮素和芦丁的性质实验Table 3 Rutin quercetin and the nature of the experiment盐酸-镁粉反应醋酸铅沉淀反应Molish反应样品芦丁芦丁芦丁槲皮素实验现象呈现红色出现粉红色沉淀出现棕色环呈现橘黄色2.2 色谱鉴定2.2.1 点样：取新华一号滤纸，距下端3厘米处用铅笔划线，为起始线，隔1.5厘米处点样品。将点好样品的滤纸挂在层析缸中饱和半小时，在上行展开。 a. 芦丁乙醇溶液 b. 精制槲皮素乙醇溶液展开剂：正丁醇-醋酸-水（4:1:5，上层）2.22. 显色：a. 可见光下观察色斑，紫外灯下观察荧光斑。b. 1%三氯化铝-乙醇溶液，在观察荧光斑点。表4 色谱鉴定Table 4 Chromatographic identification展开剂 正丁醇-醋酸-水 1%三氯化铝喷雾灯光日光紫外日光紫外芦丁黄色浅亮绿色黄色亮绿色槲皮素黄色浅亮黄色黄色亮黄色2 结果与分析3.1 从表1和表2的对比中可以看出：槐米煮沸45 min提出芦丁的得率为15 %比煮沸90 min提出芦丁的产率高。因此，水提法制芦丁煮沸时间太长会引起芦丁分解，导致产物产率太低。3.2 在可见光下，芦丁和槲皮素的色斑均呈现黄色，在253.7 nm紫外灯下，芦丁呈亮绿色，槲皮素呈亮黄色。再加入1%三氯化铝-乙醇溶液，荧光斑点的亮度更加明显。3.3 芦丁和槲皮素的区别在于芦丁水解后失去了糖苷，其本身的结构发生了变化，故在紫外灯光的照射下呈现出不同的颜色。3.4 水提法取20 g 槐花米按水提法的流程操作，可提取出粗产品，收率仅为5.32 %。3.5 碱液提取法在加入石灰水中煮沸时, 调节不同酸度，得酸度对产品质量的影响（见表5）。表5 酸度与产品质量的关系Table5 Acidity and product quality relationshippH10987产品质量 / g1.251.511.461.10由表5可知，最佳提取酸度为pH= 89。pH9，煮沸时间稍长，可使芦丁水解；pH8，芦丁溶解不完全。3.6 有机溶剂回流法适宜的回流时间为5 h6 h，结果见表6。表6回流时间与收率的关系Table 6 Backflow time and yields of the relationship回流时间 / h3456收率 / %7.48.910.110.83.7 三种方法的收率结果见表7。表7 方法与收率的关系Table 7 Method and yield relationship方法水提法碱提法乙醇法收率 / %5.39.610.13.8 三种方法产品纯度结果见表8。表8 方法与产品颜色及熔点的关系Table 8 Method and product color and melting point relationship实验方法水提法碱提法乙醇法产品颜色暗黄色灰绿色黄绿色熔点 /174178183190186190旋光度(醇中) /013.7513.7513.834结论4.1水提法装置简单，操作方便，也是平常中药的煎服方法，该法不足之处在于产率太低, 原料浪费严重。4.2用碱水提取可得粗产品，提取效率较水提法有明显提高，但该提取液通常因含有大量粘稠的杂质而难以过滤，而且整个过程对酸度控制要求较高。4.3从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流法要优于以上两种方法，且乙醇可以回收再利用，其回收率达到92.3%。通过实验可得该方法最佳操作条件为：槐花米尽可能研细，加0.8%碳酸氢钠，20倍乙醇，回流4 h5 h，浓缩回收溶剂。浓缩液加等量蒸馏水和2%的活性炭，调节使pH为7，冷却、结晶、过滤、烘干，产品收率可达10.1%。此实验中，水提取法制取芦丁的得率为15%，纯度高达80%，所得产物量与张来新2的研究结果基本符合，实际产量相当。实验结果表明，芦丁是重要的黄酮类生物活性物质，槐米中含有丰富的芦丁，通过性质试验及色谱鉴定，能够清楚的表现处黄酮类化合物的一些性质。但与舒晓宏等12采用频率20 kHz的超声法从槐米中提取芦丁成分及黄汉昌13采用冷碱（Na2SO3与石灰水混合渗漉提取）酸沉淀法相比较则产率太低，原料浪费比较严重。因此，本研究认为在探索芦丁的提取方法的过程中，特别是在医疗方面10，我们应尽可能采取更高效率的提取方法，如超声辐射法，热水提大孔吸附树脂纯化法等。无论采用什么方法,在实验的操作过程中，我们必须做到操作规范，严谨细致，实事求是。参考文献:1 孟祥颖,郭良,李玉新等. 芦丁的来源用途及提取纯化方法 J.长春中医学院报. 2003,12(3):43-45.2 张来新.槐花中芦丁的提取 J.山西化工. 2002,22(1):16-17.3 胡节,邓宗.芦丁提取工艺综述 J.中国食品添加剂.2006,13(5):94-99.4 龙全江,杨韬.芦丁的研究概况及展望 J.中国中医药信息杂志. 2002,9(4):39-42.5 唐爱莲,刘宁,程南秋.pH值对芦丁提取工艺影响及槲皮素制备工艺的研究.桂林医学院报 J.1994,7 (3):29-32.6 陈运中.苦荞麦黄酮含量的测定.食品化学 J.1998,19(3):54-56.7 杨德全,叶建阳,刘鸿云等.从苦荞麦中提取芦丁的研究.延安大学报(自然科学版) J.1997,16 (4):67-71.8 中草药化学编写,中草药化学.南京:江苏科技出版社.1980,10(2):350-352.9 陈松林,魏秀莉.苦荞芦丁的提取及在护肤品中的应用 J.日用化学工业.1995,21(2):12-15.10 孙文基,谢世昌.天然药物成分定量分析 M.北京:中国医药科技出版社.2003,20(2):400-403.11 张来新.槐米中芦丁的提取.山西化工.200