生物技术实践专题4 ppt课件

专题4 生物技术在其他方面的应用,2015高考导航,一、植物的组织培养技术 1植物组织培养的基本过程,再分化,脱分化,MS培养基,(2)实验操作过程,火焰灼烧,70%的酒精,无菌水,酒精灯火焰,无菌箱,3月季的花药培养 (1)花粉发育过程：花粉母细胞(小孢子母细胞)四分体时期单核期双核期花粉粒。 (2)产生花粉植株的两种途径 (3)影响花药培养的因素：主要因素是材料的选择和培养基的组成。花药培养一般选择在_，选择的花粉处于发育过程中的_。,胚状体,愈伤组织,初花期,单核期,(4)实验操作的关键 材料的选取：挑选完全未开放的花蕾，确定花粉发育时期最常用方法是醋酸洋红法。 接种：灭菌后的花蕾，在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。 培养:温度控制在25 左右,幼小植株形成后才需要_。 二、DNA的粗提取与鉴定 1原理：利用DNA与RNA、蛋白质等在_性质 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。,光照,物理和化学,2实验设计 (1)材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织。 (2)细胞的破碎(以鸡血为例)： (3)杂质的去除方案 利用DNA在不同浓度的_溶液中溶解度的不同，通过控制其溶液的浓度去除杂质。 用木瓜蛋白酶去除蛋白质。 用高温(6075 )使蛋白质变性。,NaCl,(4)DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等 的、_溶液可使DNA析出。 (5)DNA的鉴定：将析出的DNA溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热，溶液变蓝。,冷却的酒精,三、多聚酶链式反应扩增DNA片段 1PCR原理 在80100 的温度范围内，DNA发生_，双螺旋结构解体，在温度缓慢降低后，DNA发生_，DNA单链与 _通过碱基互补配对结合，耐高温的DNA聚合酶从引物的_开始延伸DNA链。 2PCR的条件 缓冲溶液、DNA模板、2种_、4种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时要控制温度。,变性,复性,引物,3端,引物,四、血红蛋白的提取和分离实验 1常用的分离方法：_法、凝胶电泳法等。 2基本原理 (1)凝胶色谱法的原理：相对分子质量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程_，流动_；相对分子质量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程_，流动_。 (2)凝胶电泳法的原理：不同蛋白质的带电性质、形状和 _不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,凝胶色谱,短,快,长,慢,大小,3血红蛋白的提取和分离程序 (1)样品处理：红细胞的洗涤_的释放分离血红蛋白溶液。 (2)粗分离_：除去样品中相对分子质量较_的 杂质。 (3)纯化:一般采用_法对血红蛋白进行分离和纯化。 (4)纯度鉴定：一般用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的相对分子质量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。,凝胶色谱,血红蛋白,透析,小,植物组织培养技术,1原理：植物细胞的全能性。 2高度分化的细胞全能性表达的条件 (1)离体状态。 (2)营养物质：有机营养、无机营养。 (3)植物激素：生长素、细胞分裂素。 (4)无菌、适宜的外界条件。,3影响植物组织培养的因素及成功的关键 (1)影响因素 内部因素：材料的选取。 外部因素：营养成分的种类及配比；植物激素的用量及使用顺序；pH、温度、光照等。 (2)获得成功的关键 植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗逆性差，对培养条件要求较高。 无菌技术主要包括对操作空间、实验用具、实验材料以及操作者的消毒或灭菌。 培养材料一旦被微生物污染，就会导致实验失败。原因是微生物增殖快，生长迅速，消耗养分多，并产生代谢废物毒害培养材料。一旦发现培养物被污染，特别是真菌性污染，应先将被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽灭菌锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶进行清理。,4菊花茎段组织培养技术和月季花药离体培养技术的比较,植物细胞的全能性,基本过程,脱分化再分化,外植体的细胞类型,体细胞,生殖细胞,操作流程,制备培养基外植体消毒接种培养移栽栽培,选材消毒接种和培养筛选和诱导移栽栽培选育,影响因素,选材、营养、激素、pH、温度、阳光等,培养结果,正常植株,单倍体植株,生殖方式,无性生殖,有性生殖,可育性,可育,高度不育，秋水仙素处理后可育,5.植物激素在组织培养过程中的重要作用 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点为： (1)在生长素存在的情况下,细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。 (2)使用顺序不同，结果不同(具体如下表),有利于细胞分裂，但细胞不分化,先使用细胞分裂素，后使用生长素,细胞既分裂又分化,同时使用,分化频率提高,提醒 (1)在剥离花药时，要尽量不损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织，同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。 (2)花药开裂长出愈伤组织或释放出胚状体时，应及时转移到分化培养基上。,6实验操作中易错的几个问题 (1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝；月季花药的培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。 (2)外植体消毒：所用消毒剂为体积分数为70%的酒精和质量分数为0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。 (3)培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照；月季花药的培养前期不需光照，而在后期均需光照。 (4)月季花药培养得到的并不都是单倍体植株：花粉壁发育成二倍体，花药发育成单倍体。,植物的花药培养在育种上有特殊的意义。植物组织培养可用于无病毒植株及细胞产物的工厂化生产等方面。请回答相关问题： (1)利用月季的花药离体培养产生单倍体时，选材非常重要。一般来说，在_期花药培养的成功率最高。为了选 择该时期的花药，通常选择_的花蕾。确定花粉发育时期最常用的方法有_法；但是对于花粉细胞核不易着色的植物，需采用_法，该法能将 花粉细胞核染成_色。,单核靠边,完全未开放,醋酸洋红,焙花青铬矾,蓝黑,(2)若要进行兰花无病毒植株的培育，首先选择兰花的 _作为外植体。从外植体到无病毒植株试管苗, 要人为控制细胞的_和_过程。 (3)进行组织培养需配制MS培养基,在该培养基中常需要添加 _、_等激素。欲有利于根的分化，植 物激素的用量比例_。 (4)不同植物的组织培养除需营养和激素外,_ 等外界条件也很重要。 (5)无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，下列各项中使用化学药剂进行消毒的是_，采用灼烧方法进行灭菌的是_。(填序号) 培养皿 培养基 实验操作者的双手 三角锥形瓶 接种环 花蕾,茎尖分生组织,脱分化(或去分化),再分化,生长素,细胞分裂素,生长素多于细胞分裂素,pH、温度、光照,解析(1)早期的花药比后期的更容易培养成功。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。该时期的花药通常存在于完全未开放的花蕾中。(2)根尖、茎尖约00.1 mm区域中几乎不含病毒。病毒通过维管系统移动，而分生组织中不存在维管系统，且茎尖分生组织中，代谢活动旺盛，在竞争中病毒复制处于劣势。(3)生长素与细胞分裂素等植物激素可调节脱分化和再分化。当生长素含量多于细胞分裂素含量时，利于生根。(4)植物组织培养时，除需要营养、激素外，还需要适宜的温度、pH和光照等。(5)对实验器具进行灭菌处理，对实验过程中的具有生物活性的材料或用具进行消毒处理。,1(2014中山高三检测)下列有关月季花药培养的实验操作中，不正确的是( ) A花药培养可在同一培养基上培养至长出幼小植株再更换培养基继续培养 B镜检花粉时可用醋酸洋红法或焙花青铬矾法染色，后者能将花粉细胞核染成蓝黑色 C在剥离花药时，要尽量不损伤花药，否则易从受伤部位产生愈伤组织 D如果接种的花药长出愈伤组织并分化成幼小植株，还需对植株作进一步的鉴定和筛选,A,解析：花药培养形成愈伤组织或胚状体后，要转移到分化培养基上进行再分化生芽、生根，发育成小植株；由于花粉植株常出现染色体倍性变化，需对再生植株作进一步的鉴定和筛选。,DNA和蛋白质技术,1DNA的粗提取与鉴定 (1)DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较,0.03 g/ mL,抗凝剂,除去血液中的钙离子，防止血液凝固,取材,NaCl 溶液,2 mol/L,溶解 DNA,0.14 mol/L,析出 DNA,2 mol/L,鉴定时 的溶剂,DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2 mol/L时较大、在0.14 mol/L时最小,粗提取,(2)实验步骤中两次加入蒸馏水的目的 第一次加入是使鸡血细胞吸水涨破，第二次是稀释NaCl溶液浓度至0.14 mol/L，从而析出DNA。 (3)实验中四次过滤的比较,含DNA的 核物质,DNA,溶于0.14 mol/L NaCl溶液 的杂质,DNA,纱布上,细胞膜、核膜等残片,不溶于 2 mol/L NaCl溶液 的杂质,DNA,不溶于 2 mol/L NaCl 溶液的杂质,提醒 (1)鸡血经济且易获得，鸡血中的红细胞、白细胞都具有细胞核，含大量DNA。 (2)甲基绿可将DNA染成绿色且不需水浴加热,二苯胺鉴定DNA属于颜色反应,需要沸水浴加热5 min,可使DNA呈蓝色。 (3)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。,蒸馏水,NaCl溶液,蒸馏水,NaCl 溶液,过滤的 目的,去除细胞 膜、核膜等杂质,去除不溶 于2mol/L NaCl的 杂质,去除溶于 014 mol/ L NaCl溶 液的杂质,去除不溶 于2 mol/ L NaCl溶 液的杂质,2多聚酶链式反应(PCR)扩增DNA片段 (1)比较细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR),场所,细胞内,细胞外,能量,ATP提供能量,不需ATP提供能量,酶,解旋酶、 DNA聚合酶,耐高温的Taq、 DNA聚合酶,是否有 转录,伴有转录， 产生引物,无转录，需加入 两种引物,特点,边解旋边复制， 半保留复制,体外迅速扩增,循环 次数,受生物体 自身控制,30多次,缓冲液,不需要,需要人为控制,设备,无,严格控制温度 变化的温控设备,原料,四种脱氧核苷酸,复制 原则,严格遵循碱基 互补配对原则,模板,DNA为模板,引物,都需要与模板 相结合的引物,(2)PCR反应过程 变性：当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链，(如下图)。,复性：系统温度下降至50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，(如下图)。 延伸：当系统温度上升至72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，(如下图)。,3)结果 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。 两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。 提醒 DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从5端开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。,3血红蛋白的提取与分离 (1)常用的蛋白质分离方法 凝胶色谱法,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,分析比较列表如下：,排阻在凝胶颗粒 外面，迅速通过,进入凝胶颗粒 内部，被滞留,运动方式,垂直向下,垂直向下和无 规则扩散运动,运动路程,较短,较长,洗脱次序,先流出,后流出,电泳法原理：在一定pH下，一些生物大分子(如多肽、核酸等)可解离的基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。由于分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 (2)实验流程 第一步 样品处理 红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化； 血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来；,图示： 注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 第三步 纯化 一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。,注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 第三步 纯化 一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 第四步 纯度鉴定 一般用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。 (3)结果分析与评价 血红蛋白的提取和分离时红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,凝胶的装填标准是紧密、均匀。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 G75：“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g。 装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的是使凝胶装填紧密。 实验过程中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固；低速、短时离心防止白细胞沉淀；缓慢搅拌防止红细胞破裂释放出血红蛋白。,下列有关提取和分离血红蛋白的叙述中，不正确的是 ( ) A样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C可以通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂蛋白除去，即样品的纯化 D.可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度,B,解析样品处理是洗涤红细胞，使血红蛋白释放出来，通过离心法得到血红蛋白溶液。透析袋能使小分子自由进出，则大分子留在袋内，这样可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,这些蛋白质分子就可以分离开。判断纯化的蛋白质是否达到要求,通常用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质的纯度进行鉴定。,2在DNA粗提取与鉴定实验中，将获得的含有DNA的黏稠物(含较多物质)分别处理如下： 其中杂质所处的位置在( ) A B C D,C,解析：在2 mol/L的氯化钠溶液中，DNA溶解而杂质在黏稠物中；在0.14 mol/L的氯化钠溶液中，DNA溶解度小而析出，杂质在滤液中；在95%的酒精溶液中，DNA析出而杂质溶于酒精中。,1(2013高考江苏卷)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷， 可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)( ) A设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列 B用PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 C.PCR 体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA 聚合酶 D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞,BD,解析：设计引物时应当考虑需扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对，A项错误；利用PCR技术扩增目的基因只需要知道基因两端的序列，据此设计合适的引物即可，不必知道基因的全部序列，B项正确；PCR体系中应该用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶，C项错误；需根据目的基因的编码产物的特性来选择合适的受体细胞，如果是分泌蛋白，则最好选用真核细胞作为受体细胞，D项正确。,2(2012高考江苏卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是( ) A洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度 B将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝 C常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取 D用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少 解析：洗涤剂可瓦解植物细胞膜，有利于释放DNA，但不能增加DNA在NaCl溶液中的溶解度，A项错误；含DNA的丝状物应先溶解在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，再用二苯胺试剂在沸水浴条件下检测，冷却后变成蓝色,B项错误；常温下菜花匀浆中某些酶如DNA水解酶，其活性较高，会影响DNA的提取，C项正确；用玻棒缓慢搅拌滤液可防止DNA分子断裂，有利于DNA分子的提取，D项错误。,C,3(2011高考广东卷)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( ) A洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少 C血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,D,解析：D错误，凝胶色谱法分离蛋白质的原理是相对分子质量越大的通过凝胶色谱柱的速度越快。A正确，洗涤的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化，加入的是生理盐水，缓慢搅拌10 min，低速短时间离心，重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。B正确，哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器，提纯时杂蛋白较少。C正确，如果操作都正确，能清楚的看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出。,4.(2011高考江苏卷)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定” 的实验中，相关叙述正确的是( ) A用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物 B.调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶,都可以去除部分杂质 C将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色 D用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同,B,解析：在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度最低，DNA存在于析出物中，故不能滤去析出物，A项错误；利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，进行相应操作，可在实验中去除部分杂质，B项正确；进行DNA鉴定时，加入二苯胺试剂后再