毕业论文---袁亚龙.doc

天津渤海职业技术学院毕业环节论文系 部： 生物工程系 专 业： 生物化工工艺 学生姓名: 袁亚龙 学 号: 36号 设计(论文)题目： TTC法检测牛奶中抗菌药物的研究 起 止 日 期: 2010.122011.4 设计(论文) 地点: 天津渤海职业技术学院 指 导 教 师: 张荟 日期: 2011 年 4 月14 日目录TTC法检测牛奶中抗菌药物的研究1一牛奶中抗生素残留的来源及其危害2二抗生素的检测标准4三TTC法实验4四实验结果与分析 5参考文献7 8TTC法检测牛奶中抗菌药物的研究摘要：针对用TTC法检测牛奶抗菌药物残留过程中因为在被检乳样中加入指菌的数量不稳定而影响检测的问题，本研究增设了菌液稀释度试验以确定加入的菌液量。同时，采用TTC法对奶牛场常用的几种抗菌药物检测其乳中最低检测浓度。结果是：青霉素3g/kg，链霉素660g/kg，庆大霉素620g/kg，卡那霉素6200g/kg，红霉素30g/kg，环丙沙星500g/kg，土霉素100g/kg，金霉素100g/kg，磺胺嘧啶100g/kg。本研究用TTC法对青霉素、红霉素、土霉素、金霉素和磺胺嘧啶的检测灵敏度均达到农业部规定的牛乳中兽药残留最高限量要求。TTC法具有简便、价廉的优点，并且所检测的抗菌素范围较广，符合我国奶牛场中使用抗菌药物种类较多的现状。 关键词：牛奶；TTC；抗菌物；抗生素；残留一 牛奶中抗生素残留的来源及其危害1.1 牛奶中抗生素残留的来源 一般认为，对泌乳牛用药不当或不注意安全时间是牛乳中抗生素残留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。随着畜牧业的发展，在牛饲料中添加饲料添加剂已十分广泛，其中含量有一定比例的抗生素，主要作用是预防疾病的发生，这也是牛乳抗生素残留重要原因。此外，在高温季节，一些不法交奶户为防止乳的酸败，往往向牛乳中掺杂各种抗生素，这也是乳中抗生素残留的一个来源。1983年，Egan调查表明，重用经抗生素治疗的乳牛用过的挤乳器给正常乳牛挤乳，可使正常牛的乳中残留抗生素，于是他指出：挤乳是乳中抗生素残留的另一个来源。1.2 牛奶中抗生素残留的危害 牛奶是老少皆宜的营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素有过敏体质的人服用残留抗生素的乳后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患者再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素是奶牛场治疗乳房炎的常规药物。由于长期大量使用抗生素，使耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。 这又促使临诊兽医在治疗过程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素残留会影响奶制品的品质，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，则残留在其中的抗生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。因此市场不允许出售抗生素残留过量的牛奶，这样也造成牛奶生产者的经济损失。2 牛奶中的抗生素残留检测方法研究进展2.1 微生物检测法 微生物检测法是应用较广泛的方法，如纸片法、 TTC法等等，因其测定原理基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，因而与临床应用的要求一致，但其测定时间长且结果误差较大。目前趋向灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法研究，如酶标抗体检测法等。2.2 TTC法检测的简介抗菌药物在奶牛养殖场被广泛应用于治疗各种感染性疾病，容易造成牛奶中的药物残留。随着生活水平的提高，人们越来越关注自身的健康，牛奶中的抗菌药物残留问题也日益受到社会的重视。牛奶中残留的抗菌药物主要是抗生素，它对饮用者的潜在危害包括产生过敏反应，引起细菌耐药性，导致人体肠道内菌群失调等1，并对生鲜乳的后续加工产生不利影响2，3，4，5。为了控制牛奶中的药物残留，世界许多国家作了相应的规定，如欧盟国家卫生和健康部门规定了牛乳中青霉素类药物残留的最高限量为430g/kg，四环素的残留限量为100g /kg；联合国粮农组织(FAO)和联合国世界卫生组织(WHO)共同创建的FAO/WHO食品法典委员会(CAC)也规定了各类常用兽药在牛奶中的残留限量，如苄青霉素限量为4g /kg，头孢噻呋最高残留限量为100g/kg9。我国在2001年9月由农业部发布的无公害食品生鲜牛乳明确规定“抗生素不得检出”8；2002年12月又发布了动物性食品中兽药最高残留限量，其中对牛乳中的兽药残留限量作了明确规定10。牛奶中抗菌药物残留的检测方法主要有微生物学、理化学和免疫学检测法。理化学检测法要求复杂昂贵的仪器和设备，一般只适用于实验室检测。目前我国生产管理上常用的抗菌药物残留快速检测方法主要有TTC法和Snap法。Snap法是利用免疫学原理采用ELISA法进行检测，具有特异性高的优点，但不同的抗生素需要用不同的试剂盒来检测。我国目前主要是针对内酰胺类抗生素进行检测。由于Snap法需要用到进口试剂，对一个奶样检测一种抗生素的费用为50元左右，对许多奶农来说是一个负担。TTC法是一种微生物学方法，其原理是嗜热链球菌(S.thermophilus)在牛乳中生长时会将无色的2，3，5氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）还原为红色的三苯甲瓒，而当牛奶中存在抗生素等抗菌物质时，会抑制嗜热链球菌的生长，TTC则无法被还原。TTC法具有广谱、价廉的优点，已列入国家标准11。但是在采用该法检测牛奶中残留药物的具体操作过程中，我们发现加入检测牛奶中的嗜热链球菌的数量会对检测结果产生影响。若加入的量过多，会产生假阴性结果，若加入的量过少，则细菌在对照奶样和待测奶样中不会使TTC明显变色。因此，本研究在应用TTC法时，增设了细菌稀释度的试验，以确定检测乳样中所加入的合适的细菌数量，达到了国家标准规定的灵敏度要求。二抗生素的检测标准 用荧光免疫法测定牛奶中的6种-内酰胺类抗生素，检测分析系统组成：一个内含4个毛细管的测定管、一个带有4个用来干燥试剂的的凹面的试剂盘和一个毛细管反应器。反应在毛细管反应器内进行，并通过毛细管反应器识别荧光显示结果，然后输出测定结果。牛奶中-内酰胺类抗生素的最低检测限为：青霉素G,3.2 ppb、, 氨苄青霉素2.9 ppb 、羟氨苄青霉素,3.6 ppb 、邻氯青霉素,7.4 ppb 、头孢匹林,16.3 ppb 、头孢噻呋33.7 ppb。三TTC法实验3.1 实验材料青霉素钾、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、环丙沙星、土霉素、金霉素、磺胺嘧啶标准品，由中国药品生物制品检定所提供；嗜热链球菌(S.thermophilus)，由杭州微生物研究所提供；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC），国药集团化学试剂有限公司所提供；不含有抗生素的健康鲜牛奶，由杭州美丽健乳品有限公司提供。Snap仪和试剂盒（New SNAP Beta-Lactam Test Kit），IDEXX Laboratories提供。 3.2 实验步骤3.2.1 首先，将无抗健康鲜牛乳以2000rpm的转速离心15min，去除上层脂肪，113灭菌15min，待用。3.2.2 确定被测奶样中需要加入嗜热链球菌的量。将嗜热链球菌冻干粉接种于脱脂牛乳中，36培养18小时后，菌液接种至灭菌脱脂乳，再经36培养15小时。用灭菌脱脂乳以1：10、1：20、1：40、1：80的比例稀释菌液，待用。3.2.3 取10mm150mm试管，每管加入无抗奶9ml，80水浴加热5min后，冷却到37以下。加入1ml上述用灭菌脱脂乳稀释好的菌液，在36水浴中培养2小时。然后加入4TTC溶液0.3ml，继续水浴培养30分钟后观察结果。以显色为微红色的试管相对应的菌液稀释度作为以下试验用稀释度。 为测定本实验条件下TTC法检测的最低药物浓度，将各抗菌药物用无抗牛乳配制成三种不同浓度（表1）。在试管中加入9ml含抗生素的牛奶，对照管牛奶不含抗生素，80水浴5分钟，随后冷却到37以下。各加入1ml菌液（稀释度由上述试验确定），36水浴2小时。然后加入4TTC溶液0.3ml，继续水浴，每隔15分钟观察一次结果。若待测牛奶的颜色比对照乳液颜色浅，则判定为阳性。每种药物阳性结果中对应的最低含量，即为该药物的最低检出量。每种药物重复测定3次。表1 牛奶中各种抗菌药物的浓度（g/kg） 药物 牛奶中药物浓度 青霉素 2 3 4 链霉素330 660 1300 庆大霉素310 620 1200 卡那霉素3100 6200 13000 磺胺嘧啶60 80 100 红霉素20 30 40 环丙沙星400 500 600 土霉素50 100 200 金霉素50 100 200 四实验结果与分析 4.1 实验结果 本研究用TTC法检测到的各类抗菌药物最低检出量以及农业部2002年12月发布的动物性食品中兽药最高残留限量所规定的有关抗菌药物在牛奶中允许的最高残留限量见表2。比较结果表明，对于牛奶中的残留的青霉素、磺胺嘧啶、红霉素、土霉素和金霉素进行检测，TTC法的灵敏度可以达到农业部的检测要求；对链霉素和庆大霉素的检测，TTC法的灵敏度还不够；卡那霉素和环丙沙星的残留限量则未在农业部规定中列出。 表2 TTC法检测牛奶最低药物浓度与农业部规定的比较(g/kg)药物TTC法最低检出量农业部规定 青霉素 3 4 链霉素660 200 庆大霉素620 200 卡那霉素6200 _ 磺胺嘧啶100 100 红霉素30 40 环丙沙星500 _ 土霉素100 100 金霉素100 100 我们用Snap法检测上述几种药物在牛奶中残留，Snap仪器仅仅对青霉素含量超过3g /kg时报告阳性，而对其余8种药物均不敏感。这是由于本实验所用试剂盒特异性针对青霉素的缘故。4.2 实验分析 国家标准在介绍TTC法中被检牛奶加入嗜热链球菌菌液的量时，只是说将培养15小时的细菌原液1：1稀释后使用。事实上，由于受菌种活力、培养用脱脂乳营养成分等多种因素的影响，此时的菌液量已难以统一6,7。加入的细菌数量过多或过少均会对试验结果产生影响。因此，我们在检测时，增设了一个确定菌液稀释度的步骤，收到很好的效果，试验结果重现性好，灵敏度符合要求。另外，按照国家标准描述，在被检牛奶中加入TTC试剂培养30分钟后观察结果，若试验管呈现白色，则继续培养半个小时。我们在实验时发现，当牛奶中抗生素含量比较低时，可以在加入TTC试剂培养10至15分钟后就可以观察牛奶的颜色变化。因为有时加入TTC后培养时间过长，低含量的含抗奶颜色会和无抗奶颜色趋于一致而无法分辨出两者之间的差别。 目前，我国养殖场使用兽药尚不规范。兽药使用种类多，例如，牛场兽医在治疗奶牛乳房炎、子宫内膜炎等一些常见多发病时，除青霉素类药物外，还使用庆大霉素、磺胺类药物、土霉素等。我国牛奶收购站和牛奶公司在检测牛奶中的抗菌药物残留时，主要采用针对内酰胺类抗生素的Snap快速检测试剂盒。Snap法的优点是特异性高、快速、准确。但是因为我国目前的Snap试剂主要针对内酰胺类抗生素，对其它抗生素如庆大霉素、磺胺类药物、土霉素等常用药物均不敏感，因此在实际检测过程中难免会造成疏漏。而TTC法的检测谱较广，本试验中可以检出牛奶中的残留的青霉素、磺胺嘧啶、红霉素、土霉素和金霉素等，并且灵敏度达到农业部规定的检测要求。和Snap法比较，TTC法的成本低廉。TTC法的缺点是检测花费的时间较长，需要34小时才能完成对一个样品的检测，而Snap法只需要9左右分钟。因此，在实际使用时，可以根据具体情况，选择合适的检测方法。参考文献 1. 陈怀宇，黄周英，林育腾.牛乳中抗生素的残留与危害现状J.泉州师范学院学报，2004，22（6）：102106 2. 孟昭赫等.食品卫生检验方法注解（微生物学部分）M.人民卫生出版社，北京，1990年,第838页 3. 马兆瑞，祝战斌，卡尔莱金特.乳和乳制品中残留抗生素的检测方法J.中国乳品工业，2003，31（4）：3740 4. 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