注射用龙葵总碱(Coramsine)的抗肿瘤机理研究.doc

肇蚇蚀袄莆蚆螂聿节蚅袄袂膈蚅蚄肈膄芁螆羀肀芀衿膆莈艿薈罿芄芈蚁膄膀芈螃羇肆莇袅螀莅莆薅羅芁莅螇螈芇莄衿肄膃莃蕿袆聿莂蚁肂莇莂螄袅芃莁袆肀腿蒀薆袃肅葿蚈肈羁蒈袀袁莀蒇薀膇芆蒆蚂罿膂蒆螅膅肈蒅袇羈莆薄薇螁节薃虿羆膈薂螁蝿肄薁薁羄肀薁蚃袇荿薀螅肃芅蕿袈袅膁薈薇肁肇蚇蚀袄莆蚆螂聿节蚅袄袂膈蚅蚄肈膄芁螆羀肀芀衿膆莈艿薈罿芄芈蚁膄膀芈螃羇肆莇袅螀莅莆薅羅芁莅螇螈芇莄衿肄膃莃蕿袆聿莂蚁肂莇莂螄袅芃莁袆肀腿蒀薆袃肅葿蚈肈羁蒈袀袁莀蒇薀膇芆蒆蚂罿膂蒆螅膅肈蒅袇羈莆薄薇螁节薃虿羆膈薂螁蝿肄薁薁羄肀薁蚃袇荿薀螅肃芅蕿袈袅膁薈薇肁肇蚇蚀袄莆蚆螂聿节蚅袄袂膈蚅蚄肈膄芁螆羀肀芀衿膆莈艿薈罿芄芈蚁膄膀芈螃羇肆莇袅螀莅莆薅羅芁莅螇螈芇莄衿肄膃莃蕿袆聿莂蚁肂莇莂螄袅芃莁袆肀腿蒀薆袃肅葿蚈肈羁蒈袀袁莀蒇薀膇芆蒆蚂罿膂蒆螅膅肈蒅袇羈莆薄薇螁节薃虿羆膈薂螁蝿肄薁薁羄肀薁蚃袇荿薀螅肃芅蕿袈袅膁薈薇肁肇蚇蚀袄莆蚆螂聿节蚅袄袂膈蚅蚄肈膄芁螆羀肀芀衿膆莈艿薈罿芄芈蚁膄膀芈螃 注射用龙葵总碱（Coramsine）的抗肿瘤机理研究一、对荷瘤（S180）小鼠血清TNF-和IL-2的影响在药效学实验中，我们观察到龙葵总碱具有一定的抗肿瘤作用，且对放、化疗具有增效作用。为了进一步观察其对免疫因子的影响，探讨其抗肿瘤的作用机理，我们观察了其对荷瘤小鼠血清TNF-和IL-2水平的影响。（一）实验材料1、药材与试剂龙葵总碱，6mg/瓶，由吉林市卓怡康納制药有限公司提供，批号：20050602。氟尿嘧啶注射液（5-Fu），天津金耀氨基酸有限公司，批号：0505231；华蟾素注射液，安徽金蟾生化股份有限公司，批号：050316；生理盐水，南京小营制药厂，批号：2005052505；白介素-2（IL-2）放射免疫分析药盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号：20051125；肿瘤坏死因子（TNF）放射免疫分析药盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号：20051125。2、实验动物：ICR小鼠，由南京医科大学实验动物中心（生产许可证：SCXK(苏)2002-0031）。3、实验仪器：MP12001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司；AR2140型电子分析天平，奥赛斯国际贸易（上海）有限公司。4、实验条件：给药前后，小鼠分笼饲养，用全价颗粒饲料(由江宁青龙山动物繁殖场提供)喂养；温度2025，湿度4060%。5、统计方法：本实验量反应资料采用方差分析，统计软件用SPSS13.0。（二）实验方法无菌条件下抽取ICR小鼠腹腔内生长8天的腹水癌细胞悬液，癌细胞悬液和灭菌生理盐水按1：3稀释，取ICR小鼠70只，体重1822g，接种稀释后的癌细胞悬液0.2ml于腋部皮下。24h后随机分为7组，即模型组、5-Fu组（25mg/kg）、华蟾素组（3g/kg）和SNSA小、中、大剂量组（1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg）及口服组（2mg/kg），每组10只，另取10只小鼠作为正常对照组。分别静脉注射给予相应药物(正常对照组和模型组注射等容积生理盐水，口服组灌胃给药)。给药容积均为10ml/kg。给药8天后，眼眶取血，常规分离血清，-20保存，待测TNF-和IL-2；脱颈椎处死小鼠，剥取肿瘤，称重，按照下面公式计算抑瘤率；取胸腺、脾脏，称重，按下面公式计算胸腺指数和脾指数1。抑瘤率(%)=对照组平均瘤重实验组平均瘤重100%对照组平均瘤重胸腺（脾）指数=胸腺（脾）重量（g）100体重（三）实验结果小鼠接种S180移植性实体瘤后，3天皮下即可触到肿瘤，8天后解剖肿瘤平均重量均大于1g，龙葵总碱三个剂量组小鼠肿瘤浸润范围均小于模型组，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻(p0.01)。模型组小鼠血清TNF-、IL-2含量均低于正常对照组，龙葵总碱各组均可以升高血清TNF-、IL-2含量，其中龙葵总碱中、大剂量组和模型组相比，具有统计学意义(p0.05，p0.01)。结果见表13。Table 1 Effects of Coramsine on tumor weight inhibitory rates of beared S180 mice（S，n10）GroupDose（mg/kg）tumor weight（g）tumor weight inhibitory rates（）Control1.550.435-Fu250.610.28*60.9Huachansu31030.870.33*43.6Coramsine 11.030.47*33.6Coramsine 20.840.47*45.5Coramsine40.700.23*54.5Coramsine oral group21.280.3917.4Compared with control group，* p0.05，* p0.01。Table 2 Effects of Coramsine on thymus gland index and spleen indexof beard S180 mice（S，n=10）GroupDose（mg/kg）thymus gland indexspleen indexNormal 0.2610.0610.8810.196Control0.2530.0460.8690.2005-Fu250.1320.043*0.5990.217*Huachansu31030.2600.0560.7840.256Coramsine 10.2710.0720.8800.299Coramsine20.2580.0650.8290.204Coramsine40.2670.0610.9200.187Coramsine oral group20.2430.0400.7890.212Compared with normal group，* p0.05，* p0.01。Table 3 Effects of Coramsine on serum TNF- and IL-2 levelsof beard S180 mice（S，n=10）GroupDose（mg/kg）TNF- (ng/ml)IL-2 (ng/ml)Normal 1.410.291.240.78Control1.020.291.000.495-Fu251.070.430.930.32Huachansu31031.070.311.551.42Coramsine 11.250.321.311.05Coramsine 21.310.27*2.091.41*Coramsine41.390.19*2.161.53*Coramsine oral group21.240.331.221.15Compared with normal group， p0.01；Compared with control group，* p0.05，* p0.01。（四）小结TNF是迄今发现的抗癌作用最强的细胞因子。TNF能特异性地杀伤肿瘤细胞，诱导细胞凋亡。TNF能与靶细胞膜表面的TNF受体结合，传递细胞外信号至细胞内，使细胞内cAMP浓度增高，使DNA链断裂，从而发挥抗肿瘤作用。也有研究认为TNF先与肿瘤细胞表面的TNF受体结合，继之引起线粒体和内质网破坏、溶酶体破裂、最后细胞裂解。TNF具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，其作用于G2和M期，此两期的细胞膜面积最大，代谢活跃，膜通透性也大，自我修复能力降低，同时大量的自由基进入细胞内，导致细胞代谢紊乱而死亡2。IL一2又称T细胞生长因子(TCGF)是机体免疫调节中最重要的细胞因子之一，它具有激活NK细胞与细胞毒性T淋巴细胞，及促进B细胞分化与增殖，诱导LAK细胞的产生，从而达到杀伤肿瘤作用3。IL-2在体内能提高机体免疫应答的能力，具有抗肿瘤作用4。有资料表明，TNF-通过增强IL-2的受体表达而实现其免疫调节功能5，此外，在肿瘤的过继免疫治疗中，IL-2等细胞因子还可减少TNF的毒副作用6。在本次实验中，接种肿瘤后，小鼠血清TNF-和IL-2和水平降低，而SNSA制剂则可以不同程度升高肿瘤小鼠TNF-和IL-2水平，对肿瘤的治疗具有积极意义。（五）参考文献1 徐叔云，卞如濂，陈修. 主编. 药理实验方法学（第二版）M.北京：人民卫生出版社，1991：14232 关燕清，杨鑫华，何丽梅，等.TNF与IFN协同诱导癌细胞凋亡机制的研究进展J.华南师范大学学报（自然科学版），2006，3：1221263 曾雪涛白细胞介素-2的基础与临床M北京：北京科技出版， I990；504 谢巍，周智. 白细胞介素-2介导体内T细胞调节功能的研究进展J. 国外医学.药学分册. 2006，33（4）：272274，2895 Owen-Schaub LB， Gutterman JU， Grimm EA. Synergy of tumor necrosis factor and interleukin 2 in the activation of human cytotoxic lymphocytes: effect of tumor necrosis factor alpha and interleukin 2 in the generation of human lymphokine-activated killer cell cytotoxicity. JCancer Res. 1988， 15;48(4):788926 Agah R， Malloy B， Sherrod A， et a1Successful therapy of natural killer-resistant pulmonary metastases by the synergism of gamma-interferon with tumor necrosis factor and interleukin-2 in miceJ.Cancer Res. 1988，15;48(8):2245-8二、龙葵总碱对Lewis肺癌移植瘤小鼠血清IL-6和IL-8水平的影响龙葵植物中的生物碱类成分具有抗肿瘤作用，已有多次文献报道1，2，3，4。但是这些报道多局限于龙葵醇提物、复方龙葵制剂等较低水平的研究。且对龙葵中生物碱类成分对肿瘤细胞的凋亡及细胞周期研究尚未见报道。我们现在已提取出高纯度的澳洲茄碱和澳洲茄边碱，并制成的制剂。在前面的实验中，我们观察到龙葵总碱具有一定的抗肿瘤作用，且具有增强免疫作用。为了进一步观察龙葵总碱制剂对肿瘤的治疗作用，我们复制了Lewis肺癌小鼠移植瘤模型，观察龙葵总碱制剂对Lewis肺癌小鼠移植瘤模型抑瘤率以及血清中IL-6和IL-8水平的影响，初步探讨龙葵总碱制剂的抗肿瘤作用以及对免疫细胞因子的影响，为进一步探讨其抗肿瘤作用机理提供基础。（一）实验材料1、药材与试剂龙葵总碱，6mg/瓶，由吉林市卓怡康納制药有限公司提供，批号：20050602；A549、LLC肿瘤株，由南京中医药大学惠赠；注射用环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：06011921；生理盐水，南京小营制药厂，批号：2005052505；戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司（进口分装），批号：F20020405。2、实验动物：C57BL/6J小鼠，68周龄，由南京大学模式动物中心提供，生产许可证：2005-00023、实验仪器GS-15R台式冷冻离心机（Beckman）；DK-8D电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）；CO2培养箱（Forma scientific）；Pureplus 纯水器(U.S.A)；SW-CJ-1FD净化工作台（苏净集团安泰公司）；Leica-DMIL型倒置显微镜（Leica）；MP12001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司；AR2140型电子分析天平，奥赛斯国际贸易（上海）有限公司。4、实验条件：给药前后，小鼠分笼饲养，用全价颗粒饲料(由江宁青龙山动物繁殖场提供)喂养；温度2025，湿度4060%。5、统计方法：本实验量反应资料采用方差分析，统计软件用SPSS13.0。IC50计算用LOGIT法。（二）实验方法取接种Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠，脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1：3制备匀浆液，500转/分离心，弃上清，用生理盐水调整细胞数1106/ml备用，取C57BL6J小鼠40只，分别于右腋皮下接种匀浆液，每只0.2 mL(细胞数2105)。接种后每日观察小鼠，等小鼠肿瘤长出，体积约为1cm3时，按肿瘤体积将上述小鼠随机分为5组：生理盐水(saline)组、龙葵总碱（SNSA）低、中、高剂量组和环磷酰胺(CTX)组。分组后每组给予相应药物。龙葵总碱低、中、高剂量组剂量分别为2、4、8mg/kg，腹腔注射，连续给药5天。环磷酰胺60mg/kg，每隔7天给药一次。生理盐水组腹腔注射同体积生理盐水。第14日眼眶取血，常规分离血清，-20保存，待测IL-6和IL-8含量。脱颈椎处死各组小鼠，取皮下肿瘤块称重，计算肿瘤抑制率5，6。（三）实验结果1、对Lewis肺癌移植瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响C57BL/6小鼠接种Lewis肺癌细胞悬液后，4天皮下可见肿瘤，接种肿瘤细胞悬液14日后，模型组瘤重为4.01g。龙葵总碱各给药组瘤重均低于模型组，抑瘤率分别为20.8，37.9和65.9。提示龙葵总碱具有一定的抑制Lewis肺癌增长作用，结果见表1，Figure 5455。Table 1 Effects of Coramsine on tumor weight inhibitory rates of beared LLC mice（S，n8）GroupDose（mg/kg）tumor weight（g）tumor weight inhibitory rates（）Control4.010.97CTX601.800.69*55.1Coramsine23.180.6520.8Coramsine42.491.3037.9Coramsine81.370.56*65.9Compared with control group，* p0.05，* p0.01。2、对Lewis肺癌移植瘤小鼠血清IL-6和IL-8水平的影响和正常对照组相比，模型组小鼠血清IL-6和IL-8水平均下降。龙葵总碱用药各组，均可以显著增加模型小鼠血清中IL-6和IL-8水平，具有一定的增强免疫作用，结果见表2。Table 2 Effects of Coramsine on serum IL-6 and IL-8 levelsof beard LLC mice（S，n=8）GroupDose（mg/kg）IL-6（ug/ml）IL-8（ug/ml）Normal72.5117.26*0.140.05*Control52.607.100.050.03CTX6062.6217.890.080.03Coramsine268.5510.40*0.090.04Coramsine474.2512.77*0.140.07*Coramsine881.7323.24*0.180.10*Compared with control group，* p0.05，* p0.01。（四）小结IL-6生物活性多样，有许多文献报道IL-6对不同肿瘤细胞的生长具有完全不同的作用，如Lu等在小鼠皮下接种Lewis肺癌细胞5天后给小鼠皮下注射r-IL-6(每次100ug，每天2次，连续5d)，2l天后观察其抗瘤效果，结果发现r-IL-6可明显抑制肿瘤生长，肺转移结节减少；如果在注射rIL-6的同时对小鼠进行局部放疗(800cGy)，可以明显提高放疗效果，且与单纯放疗组比较，可以观察到生存期延长7。这一结果提示IL-6可抑制肿瘤生长，同时具有放射增敏的作用。Hilbert等报道，IL-6对多发性骨髓瘤及肾癌等恶性细胞的生长具有促进作用8。刘永彪等观察了IL-6对受全身分次照射荷瘤小鼠肿瘤细胞增殖与凋亡的影响，发现IL-6对荷Lewis肺癌小鼠具有放射增敏作用，对荷S180小鼠具有提高辐射抗性作用，对荷H22肝癌小鼠无明显影响9。本次实验我们建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，模型组血清IL-6和IL-8水平均降低。龙葵总碱各组不仅具有抑制肿瘤增长的作用，还可以显著提高荷瘤小鼠血清IL-6和IL-8的水平，具有增强免疫的作用，这可能是其发挥抗肿瘤作用的机理之一。（五）参考文献1 李秀霞，张海洋龙葵的药理作用及临床应用J佳木斯医学院学报，1998，21(1)：23252 Son YO，Kim J，Lim JC，et al Ripe fruit of Solanum nigrum Linhibits cell growth and induces apoptosis in MCF-7 cells JFood Chem Toxicol 2003，41(10)：142183 Yen GC，Chen HY，Peng HHEvaluation of the cytotoxicity， mutagenicity and antimutagenicity of emerging edible plantsJFood Chem Toxicol2001，39(11)：1045534 Hu K，Kobayashi H，Dong A，et alAntineoplastic agentsIII：Steroidal glycosides from Solanum nigrum JPlanta Med1999，65(1)：3585郭斌，韩冠英，李智. 魟鱼软骨多糖对Lewis肺癌MMP-9表达的影响J. 中国中药杂志，2006，31（4）：3253286 戴关海，杨锋，沈汉澄. 长必安胶囊对小鼠Lewis肺癌肺转移及免疫功能的影响J. 中国中医药科技，2006，13(4):2302317 李同度，译.临床肿瘤学M.合肥：安徽科技出版社出版，199585878 Hilbert DM， Kopf M， Mock BA， et a1Interleukin 6 is essential for in vivo development of B lineage neoplasms J . J Exp Med，1995，182(1)：2432489 刘永彪， 梅开， 刘颖， 等. 白介素一6对受全身分次照射荷瘤小鼠肿瘤细胞增殖与凋亡的影响J. 核技术. 2004， 27(5): 379384三、龙葵总碱对Lewis肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞凋亡率和细胞周期的影响龙葵植物中的生物碱类成分具有抗肿瘤作用，已有多次文献报道1，2，3，4。但是这些报道多局限于龙葵醇提物、复方龙葵制剂等较低水平的研究。且对龙葵中生物碱类成分对肿瘤细胞的凋亡及细胞周期研究尚未见报道。我们现在已提取出高纯度的澳洲茄碱和澳洲茄边碱，并制成的制剂。现就其对Lewis肺癌移植瘤细胞凋亡及细胞周期的影响做一初步探讨，为后续研究其作用机理打下基础。（一）实验材料1、药材与试剂龙葵总碱，6mg/瓶，由吉林市卓怡康納制药有限公司提供，批号：20050602；A549、LLC肿瘤株，由南京中医药大学惠赠；注射用环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：06011921；生理盐水，南京小营制药厂，批号：2005052505；戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司（进口分装），批号：F20020405。2、实验动物：C57BL/6J小鼠，68周龄，由南京大学模式动物中心提供，生产许可证：2005-0002。3、实验仪器GS-15R台式冷冻离心机（Beckman）；DK-8D电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）；CO2培养箱（Forma scientific）；Pureplus 纯水器(U.S.A)；SW-CJ-1FD净化工作台（苏净集团安泰公司）；Leica-DMIL型倒置显微镜（Leica）；MP12001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司；AR2140型电子分析天平，奥赛斯国际贸易（上海）有限公司。4、实验条件：给药前后，小鼠分笼饲养，用全价颗粒饲料(由江宁青龙山动物繁殖场提供)喂养；温度2025，湿度4060%。5、统计方法：本实验量反应资料采用方差分析，统计软件用SPSS13.0。IC50计算用LOGIT法。（二）实验方法取接种Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠，脱颈椎处死，无菌条件取瘤组织，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1：3制备匀浆液，500转/分钟离心5分钟，弃上清，用生理盐水调整细胞数1106/ml备用，取C57BL6J小鼠40只，分别于右腋皮下接种匀浆液，每只0.2 mL(细胞数2105)。接种后每日观察小鼠，等小鼠肿瘤长出，体积约为1cm3时，按肿瘤体积将上述小鼠随机分为5组：生理盐水(saline)组、龙葵总碱低、中、高剂量组和环磷酰胺(CTX)组。分组后每组给予相应药物。龙葵总碱低、中、高剂量组剂量分别为2、4、8mg/kg，腹腔注射，连续给药5天。环磷酰胺60mg/kg，每隔7天给药一次。生理盐水组腹腔注射同体积生理盐水。第14日脱颈椎处死各组小鼠，取皮下肿瘤块，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1：10制备匀浆液，500转/分钟离心5分钟，弃上清，用75乙醇溶液固定，过300目筛，04保存待测细胞周期和凋亡率5，6。（三）实验结果流式细胞仪检测结果表明，龙葵总碱低剂量时具有较强的诱导肿瘤细胞凋亡的作用（P0.05），中、高剂量时无诱导凋亡作用，但是却使较多的肿瘤细胞处于G1前期（P0.05，P0.01），即使肿瘤细胞处于静止期。结果见表1，2，见Figure 6671。Table 1 Effects of Coramsine on apoptosis rates of LLC cells（S，n8）GroupDose（mg/kg）apoptosis rateControl12.212.64CTX6021.029.36*Coramsine224.5312.43*Coramsine413.395.77Coramsine813.127.37Compared with control group，* p0.05，* p0.01。Table 2 Effects of Coramsine on cell cycles of LLC cells（S，n8）GroupDose（mg/kg）G0G1G2MSG2/G1Control34.074.267.902.9558.035.241.970.03CTX6038.737.899.834.5651.456.961.960.03Coramsine231.153.3512.682.77*56.175.031.940.02Coramsine 438.763.83*10.151.9451.094.55*1.950.03Coramsine858.127.14*6.592.7535.298.58*1.980.02Compared with control group，* p0.05，* p0.01。（四）小结：细胞凋亡可引起细胞程序性死亡，受一定的体内体外信号物质控制7。细胞凋亡功能的异常可以导致许多疾病，包括恶性肿瘤、神经退行性病变和自身免疫疾病等8。因为许多化疗药物可以诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡已成为抗肿瘤药物研发的靶点之一9。而且，由于几乎没有什么副作用，近年来，天然药物和天然产物被越来越多的用来预防和治疗恶性肿瘤10，11。龙葵中含有多种生物碱类成分，民间早已用来治疗恶性肿瘤，并有多种复方制剂在临床使用1220。我们观察龙葵总碱对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡率的影响。结果表明龙葵总碱在较低剂量时可显著诱导肿瘤细胞凋亡，在高剂量时作用反而不显著。由此说明，诱导凋亡可能是龙葵总碱低剂量时抗肿瘤的作用机理之一，高剂量时其抗肿瘤的作用机理可能不是通过凋亡途径。细胞周期(cell cycle)是指细胞从上一次分裂结束开始生长到下一次分裂终了所经历的过程，所需的时间则称细胞周期时间。细胞周期分为G1，S，G2和M 4期。G1期是DNA合成前期，是细胞周期的关键步骤，细胞周期长短决定于G1期长度；S期是DNA合成期，G2期是DNA合成后期；M期指有丝分裂期。M期一结束，2个子代细胞就形成了。某些细胞或某个阶段的细胞可从G1期退出细胞周期而仍存活，称为G0期。在细胞周期中主要有3个限制点，即G1S，G2M和纺锤体装配检查点。在G1S检查点细胞DNA开始复制；在决定细胞是否一分为二的G2M检查点染色体收缩，有丝分裂开始。这些检查点能够监视细胞周期调控的运作，确保基因准确遗传。细胞周期调控是在上述检查点控制下，通过各种调控因子的激活和灭活，使细胞依次启动和完成细胞周期循环的过程。细胞周期调控因子参与多种发育途径，不仅调节细胞周期，还影响细胞增殖、分化、凋亡、黏附和癌变。很多理化因素、生长因子、原癌基因和抑癌基因的产物都能通过调控细胞周期来促进或抑制细胞增殖21。在本次实验中，龙葵总碱高剂量时可以阻断细胞周期，使大部分肿瘤细胞处于G1前期，抑制了细胞分裂。这可能是龙葵总碱抗肿瘤的作用机理之一。至于其是通过什么途径阻断了细胞周期，还尚需进一步研究。（五）参考文献1 李秀霞，张海洋龙葵的药理作用及临床应用J佳木斯医学院学报，1998，21(1)：23252 Son YO，Kim J，Lim JC，et al Ripe fruit of Solanum nigrum Linhibits cell growth and induces apoptosis in MCF-7 cells JFood Chem Toxicol 2003，41(10)：142183 Yen GC，Chen HY，Peng HHEvaluation of the cytotoxicity， mutagenicity and antimutagenicity of emerging edible plantsJFood Chem Toxicol2001，39(11)：1045534 Hu K，Kobayashi H，Dong A，et alAntineoplastic agentsIII：Steroidal glycosides from Solanum nigrum JPlanta Med1999，65(1)：3585 郭斌，韩冠英，李 智.魟鱼软骨多糖对Lewis肺癌MMP-9表达的影响J.中国中药杂志，2006，31（4）：3253286 童彤，郭素平，韩遁王君. 阿糖胞苷及云南霉素的细胞周期阻滞作用研究J. 中华肿瘤防治杂志，2006，13（20）：152515297 LA PORTA， C.A. Cellular targets for anti-cancer strategies. Drug Targets 2004.5:347355.8 THOMPSON， C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease.Science 1995. 267: 14561462.9 KAUFMANN， S.H. & W.C. EARNSHAW. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. Exp. Cell Res. 2000. 256: 4249.10 THATTE， U.， S. BAGADEY&S. DAHANUKAR. Modulation of programmed cell death by medicinal plants. Cell. Mol. Biol. 2000. 46: 199214.11 CHEN， Q.， G.W. YANG & L.G. AN. Apoptosis of hepatoma cells SMMC-7721 induced by Ginkgo biloba seed polysaccharide. World J. Gastroenterol. 2000. 8:832836.12 章永红中药抗癌大全南京：江苏科学技术出版社，1998：13513 潘伟光，刘宗潮，潘启超，等中药复方龙葵合剂在动物体内外的抗癌药效J癌症，1996，15（6）：43844014 谷善青，梁云燕，樊立人，等白英龙葵复方制剂诱导人胃癌分化的两条信号同路的共调作用J 世界胃肠病学杂志，1997，3(1)：535615 谢启梅，谢军荣龙葵在肿瘤治疗中的运用江西中医药，1996，27(2)：525316 赵晓琴，曾祥法龙葵片对原发性肝癌治疗作用的临床研究辽宁中医杂志，2002，11(29)：67167217 潘伟光，刘宗潮，潘启超，等中药复方龙葵合剂在动物体内外的抗癌药效癌症，1996，15(6)：43844018 赵晓琴，曾祥法龙葵片对原发性肝癌治疗作用的临床研究J辽宁中医杂志，2002，29（11）：67167219 何其梅，陈积圣，刘晋华，等岩龙抗癌液在中、晚期肝癌综合治疗中的应用J实用医学杂志，1998，14（6）：46820 梁新文，林显敢，谢德荣，等中晚期恶性肿瘤化疗辅以岩龙口服液的近期疗效J实用医学杂志，2000，16（4）：32032121 王霞. 细胞周期调控与肿瘤研究进展J.中国医学检验杂志，2006，7（1）：5961 四、龙葵总碱对Lewis肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞细胞MMP-9基因mRNA表达的影响肿瘤，尤其是恶性肿瘤，是引起人类死亡的主要疾病之一。在原发灶的远处组织形成转移灶的能力（即转移的能力）是高度恶性肿瘤的一个重要特征，而肿瘤的转移性也是癌症引起死亡的主要原因。对于绝大多数原发灶肿瘤细胞来说，其中只有一小部分具有转移能力。这些具有高度转移能力的细胞具有以下几种特性：脱离原发肿瘤组织，向淋巴管或血管中迁移，穿过血管基底膜，穿透血管腔，逃脱免疫监视，与远离原发灶器官的血管内皮细胞粘附，离开血管（extravation）,在被侵入的微环境中存活和生长。现在的观点认为基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases,MMP）在肿瘤侵袭和转移过程中起重要作用。MMP在肿瘤侵袭转移中的作用曾一度被认为只是破坏基底膜及ECM中的其他部分。现已确认MMP在肿瘤演进的多个阶段均有作用，它影响肿瘤的起始、生长、血管生成、进入血管/离开血管和转移。因此，研究抗肿瘤药物对MMPs的影响，对研究药物的抗肿瘤转移方面具有重要意义1.关于龙葵中生物碱对肿瘤细胞MMPs的影响，尚未见报道。本次实验，我们建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，观察龙葵总碱对MMP-9基因mRNA表达的影响，初步探讨其抗肿瘤转移的作用机理。（一） 实验材料：1、 药材与试剂：龙葵总碱,6mg/瓶，由吉林市卓怡康纳制药有限公司提供，批号：20050602；A549、LLC肿瘤株，由南京中医药大学惠赠；注射用环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：06011921；生理盐水，南京小营制药厂，批号：2005052505；戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司（进口分装），批号：F20020405.2、 实验动物：C57BL/6J小鼠，6-8周龄，由南京大学模式动物中心提供，生产许可证：2005-0002.3、 实验仪器：GS-15R台式冷冻离心机（Beckman）;DK-8D电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）；CO2培养箱（Forma scientific）;Pureplus纯水器（U.S.A）;SW-CJ-1FD净化工作台（苏净集团安泰公司）；Leica-DMIL型倒置显微镜（Leica）;MP12001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司；AR2140型电子分析天平，奥赛斯国际贸易（上海）有限公司。4、 实验条件：给药前后，小鼠分笼饲养，用全价颗粒饲料（由江宁青龙山动物繁殖场提供）喂养；温度20-25，湿度40-60%。5、 统计方法：本实验量反应资料采用方差分析，统计软件用SPSS13.0。IC50计算LOGIT法。（二） 实验方法：取接种Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠，脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，按肿瘤质量（g）与生理盐水（ml）1：3制备匀浆液，500转/分钟离心5分钟，弃上清，用生理盐水调整细胞数1106/ml备用，取C57BL/6J小鼠40只，分别于右腋皮下接种匀浆液，每只0.2ml（细胞数2105）。接种后每日观察小鼠，等小鼠肿瘤长出，体积约为1cm3时，按肿瘤体积将上述小鼠随机分为5组：生理盐水（saline）组、龙葵总碱（SNSA）低、中、高剂量组和环磷酰胺（CTX）组。分组后每组给予相应药物。龙葵总碱低、中、高剂量组剂量分别为2、4、8mg/kg，腹腔注射，连续给药5天。环磷酰胺60mg/kg，每隔7天给药一次。生理盐水组注射同体积生理盐水。第14口脱颈椎处死各组小鼠，取皮下瘤块，迅速放入液氮中保存，待测MMP-9基因mRNA表达2-4。用RT-PCR法检测Lewis肺癌组织MMP-9基因表达。检测方法如下：（1）耗材处理：0.1%DEPC水浸泡组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000l、100l、10l枪头等过夜。弃DEPC水，高压蒸汽灭菌组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000l、100l、10l枪头等。主要试剂：RNAiso为TAKARA产品，RT-PCR试剂盒为PROMEGA产品，dNTPs、MgCl2、rTaq PCR聚合酶、PCR DL2000 Marker为TAKARA产品，其余试剂为进口分装。以下引物序列是根据网上NCBI数据库中各自基因序列设计而获得，序列如下，由上海博亚生物技术有限公司合成： -actin:211 bp5-CCTCTATGCCAACACAGTGC-35-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3MMP-9:365 bp5-AGCCAACTATGACCAGGAT-35-TGCCGTCTATGTCGTCTTTA-3（2）大鼠组织提取总RNA及纯度鉴定：取材：每组分别随机6各组织（模1、2、4、5、7、8；阳1、3、4、6、7、8；高1、2、3、4、5、6；中1、2、3、4、6、8；小1、2、3、4、5、7），切取约50-100mg组织/管。每管加入1mlRNAiso试剂，匀浆器中进行匀浆至无组织碎片，移入1.5ml离心管中。室温静置10min。台式高速冷冻离心机（美国IEC公司，MP4R）每管加入0.2ml氯仿，小心盖上盖子，有力振荡混合液15s，室温放置5min。4、12000g离心15min小心将水相转移至一干净的离心管内，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置30min。4、12000g离心10min弃上清，加入75%乙醇1ml，4、12000g离心5min。弃乙醇上清，干燥，加入无酶水，轻振荡使溶解，离心、混匀，转入80保存。总RNA纯度鉴定：取出各组总RNA少量，核酸蛋白定量仪（德国EPPENDORF公司，EPPENDORF）检测各组总RNA浓度及纯度，各组总RNA纯度A260/280值在1.70-1.80。（3） RT-PCR反应RT反应：取0.6ml离心管，每管内加入随机引物：2l总RNA：1.0g混匀，70孵育10min每管加样：MgCl2（25mM）:4lRT10Buffer:2ldNTPs（10mM）: 2lRNasin Inhibiter:0.5lAMV逆转录酶：0.5l加水至总体积：20lPCR扩增仪：42，1h;95，10敏；4保存。PCR反应：25l PCR(MMP-9、-actin)反应液如下：dNTPs（10mM） 0.5 lMgCl2（25mM） 2.5 lrTaqPCR10Buffer 2.5 lMMP-9上游引物P1（10M） 0.7 lMMP-9下游引物P1（10M） 0.7 l-actin上游引物P1（10M） 0.3 l-actin下游引物P1（10M） 0.3 lrTaq DNA聚合酶 0.3 lcDNA第一链合成液 5 l无酶水 12.2 l总体积 2.5 l反应程序：94，3min; 94，30s; 60，30s;72，45s,30个循环；72，7min；4保存。PCR产物电泳：1.5%琼脂糖凝胶电泳；1.05g琼脂糖凝胶+70ml 0.5TBE，加热溶解，加入EB，混匀后倒平板。Marker为PCR DL2000。加5.0lPCR扩增 电泳，100V电泳30min。Alpha Imager 2000凝胶图像系统（美国Alpha公司）对凝胶进行拍照、光密度数据分析。以MMP-9和-actin的光密度比值（m/b）作为评价指标。（三） 实验结果 龙葵总碱制剂各组和模型组相比，MMP-9基因mRNA表达均降低，其中高剂量和模型组比较，有显著性差异（P0.01）。结果见表1，Figure72。Table Effects of Coramsine on mRNA expression of MMP-9 in LLC cells（xs,n=6）Group Dose（mg/kg） m/bControl - 0.5990.188CTX 60 0.3570.097*Coramsine 2 0.4690.176Coramsine 4 0.4850.153Coramsine 8 0.3470.052*Compared with control group,*p0.05,*p0.01。（四）小结基质蛋白溶解在机体的许多生理和病理过程中都会发生，如生长、发育、组织修复以及肿瘤生长5。基质金属蛋白酶（MMPs）家族，包括胶原酶、凝胶酶、基质溶解酶和模型金属蛋白酶类。在细胞外基质的降解过程中起重要作用6。MMP的活性通过蛋白酶的激活而被严格调控7，在此过程中有特殊的组织抑制因子的参与8，9。在MMPs中，两种凝胶酶（MMP-2凝胶酶A和MMP-9凝胶酶B）来自于独特的亚家族，具有改变位于基底膜上胶原（凝胶）和IV型胶原的底物特异性。这种IV型胶原溶解活性和小鼠黑色素瘤以及人结肠癌潜在转移性的增加密切相关10-12。最近研究显示，不仅肿瘤细胞表达MMP-2和MMP-9，肿瘤细胞周围的宿主细胞也同时表达MMP-2和MMP-913-16。提示宿主细胞分泌的凝胶酶对肿瘤生长也起一定作用。在本次实验中，龙葵总碱具有较强的抑制肿瘤组织MMP-9基因mRNA表达作用，显示其具有一定的抗肿瘤转移作用，这也可能是治疗恶性肿瘤的作用机理之一。（五）参考文献1丁岩，陈晓光/基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭和转移J.哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2002，18（4）：373-3782郭斌，韩冠英，李智。红鱼软骨多糖对Lewis肺癌MMP-9表达的影响J。中国中药杂志，2006，31（4）：325-3283Yang SF,Chu SC,Liu SJ, etc.Antimetastatic activities of Selaginella tamariscina (Beauv.)on lung cancer cells in vitro and in vivoJ.Journa