第16章 肝胆疾病的生物化学诊断课件

第十六章 肝胆疾病的生物化学诊断,南方医科大学 第一临床医学院 曾方银,全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）,2,教学目标与要求,掌握：肝脏的合成功能，黄疸的发生机理和鉴别诊断；蛋白质、胆汁酸和常用血清酶的应用价值及其方法学评价；不同类型肝胆疾病的实验室诊断要点。 熟悉：肝细胞损伤时蛋白质的变化特点；胆汁淤积、肠道病变时的胆汁酸代谢异常；肝功能实验的项目选择与组合原则及其结果评价。 了解：糖和脂类物质在肝细胞损伤时的代谢变化。,3,每年大约200万急性肝炎病例，其中甲肝50%、乙肝2025%、丙肝510%、戊肝10% 高达60%的大陆地区甲肝抗体阳性率大于80% 乙肝感染者9500万，农村城市，南方北方 丙肝和戊肝的相对高发区，总流行率分别为3.2%和17.2%(7%46%),中国肝病现状,4,目录,返回总目录,5,物质代谢中枢 分泌 排泄 生物转化 体液平衡 免疫吞噬,第一节 肝脏的生理功能与肝胆疾病代谢异常,肝脏的生理功能,6,合成与分泌90以上的血浆蛋白质 转化和分解氨基酸 合成尿素,一、蛋白质代谢变化,肝脏在蛋白质代谢中的作用主要包括：,7,急性肝损害时，血浆总蛋白与清蛋白浓度变化不大，而半衰期短的蛋白质下降明显，如前清蛋白 慢性肝病时 ，清蛋白与球蛋白（A/G）的比值降低，甚至倒置 连续检测可提供预后信息,1、血浆总蛋白与清蛋白,8,前清蛋白(Prealbumin),M=55.0KD，t1/2=1.9d，是甲状腺素结合蛋白，转运1520% T4，同时协助转运视黄醇结合蛋白（Rbp）。,临床意义： 早期肝损伤的灵敏指标 消化道恶性肿瘤及肺癌时降低 可作营养学指标（与Rbp 、Trf 、Alb同时检测）,9,急性时反应蛋白： CER 、 AAT等在慢性炎症性疾病中的变化 凝血因子：肝损害时，凝血因子II、VII、IX、X 等生成减少，血液凝固性降低，患者呈现出血倾向,2、其他蛋白的变化,10,原料供应不足：消化吸收障碍、低营养、术中丢失 合成异常：合成亢进或减少 分解亢进：甲亢、DM、恶性肿瘤、高热 排泄异常或漏出：创伤、出血、体腔/泌尿系统/肠管等异常漏出,血浆蛋白质浓度异常的原因,11,半衰期长短与合成机制决定了其在急慢性肝损伤中的诊断价值 常用的总蛋白、清蛋白主要用于检测慢性肝损害，可反映肝实质的储备功能 蛋白电泳可直观反应体内蛋白质代谢的情况，可作为多种疾病的过筛试验,蛋白质检查的意义,12,血清蛋白电泳,13,免疫固定电泳,14,轻度肝脏损害往往很少出现糖平衡紊乱 严重肝损害时，血糖难以维持正常水平，空腹易出现低血糖，进食后易出现血糖升高并可持续较长时间 半乳糖清除率测定肝血流,二、糖代谢的变化,15,三、脂类代谢变化,严重肝损害时HDL、LCAT与 LPL合成减少 血浆胆固醇酯含量减少 慢性肝内外胆汁淤积者可出现异常的脂蛋白-X（Lipoprotein-X，LP-X） 酒精性肝损伤时apoA-I的表达增加，HDL特别是HDL3可能升高,返回章目录,16,胆红素的来源： 衰老红细胞破坏、降解的血红蛋白（约80%） 无效造血的血红蛋白或血红素 肌红蛋白、细胞色素和过氧化物酶等的降解（约20%）,第二节 胆红素代谢及其紊乱,17,一、胆红素正常代谢,胆红素的生成 部位：肝、脾、骨髓等网状内皮系统 参加反应的酶：加单氧酶、NADPH、NADPH-细胞色素P450还原酶、胆绿素还原酶,18,胆红素生成过程,19,20,二、胆红素代谢紊乱与黄疸,（一）概 述,高胆红素血症（hyperbilirubinemia）：胆红素生成过多或肝细胞对胆红素的摄取、结合和排泄过程发生障碍，使血中胆红素增高。 黄疸（jaundice）：血中胆红素增多使皮肤、巩膜、粘膜以及其他组织和体液发生黄染。,21,黄疸的分类,按原因可分为： 溶血性黄疸 肝细胞性黄疸 梗阻性黄疸 按病变部位可分为： 肝前性黄疸 肝性黄疸 肝后性黄疸,22,黄疸的分类,按血中升高的胆红素的类型分为： 高未结合胆红素性黄疸 高结合胆红素性黄疸 按肉眼是否可见皮肤粘膜黄染分为： 隐性黄疸（参考范围以上到34.2 mol/L之间） 显性黄疸（胆红素浓度超过34.2 mol/L）,23,循环血液 红细胞,肠道,单核-巨噬细胞系统,溶 血 性 黄 疸 发 生 机 制,24,循环血液 红细胞,非结合胆红素,单核-巨噬细胞系统,肠道,粪胆原,肝 细 胞 性 黄 疸 发 生 机 制,25,非结合胆红素,单核-巨噬细胞系统,肠道,结合胆红素,梗 阻 性 黄 疸 发 生 机 制,26,形成过多 处理能力下降 排泄障碍,（二）黄疸的发生机制,27,临床意义,判断有无黄疸及其程度和演变 推断黄疸病因 判断黄疸类型,（三）黄疸的实验室鉴别诊断,28,1. 胆红素代谢实验,三种黄疸的实验室鉴别诊断,注：UCB：未结合胆红素；CB：结合胆红素；TBil(Total bilirubin)：总胆红素。,29,2. 血清酶学检查,丙氨酸氨基转移酶（ALT）：有助于鉴别肝细胞性黄疸与胆汁淤积性黄疸 ALP与GGT：ALP是判断胆汁淤积较为敏感的指标 ，GGT除骨骼疾病不升高外，多数情况下与ALP变化一致 凝血酶原时间：胆汁淤积性黄疸和肝细胞性黄疸时均延长，但前者给予维生素K可以纠正,30,3. 血脂分析,肝细胞性黄疸时，总胆固醇和胆固醇酯降低。 LP-X增加对于诊断胆汁淤积性黄疸有很高的灵敏度和特异性 。,4. 血液学检查,主要用于协助溶血性黄疸的诊断。,返回章目录,31,第三节 胆汁酸代谢及其代谢异常,肝细胞将胆固醇转化成胆汁酸(Total bile acids,TBA)，随胆汁分泌进入肠道，协助脂类物质的消化与吸收。肠道中约95%经肠肝循环被重吸收入肝。 血清TBA水平可反映肝细胞合成、摄取、分泌及胆道排泄功能，是一项敏感的肝功能试验。,32,胆汁酸的组成,初级胆汁酸：胆酸、鹅脱氧胆酸 次级胆汁酸：脱氧胆酸、石胆酸 结合胆汁酸：游离胆汁酸（初级、次级）分别与甘氨酸、牛磺酸结合,一、生理情况下的胆汁酸代谢,33,胆 汁 酸 肠 肝 循 环,34,二、胆汁酸代谢异常,1、肝实质性病变时 急性肝炎时，胆汁中的BA浓度降低，血清BA增加。 慢性活动性肝炎时，血清BA增高 。检测血清BA水平可作为提示慢性活动性肝炎病情好转或加重或复发的指标。 肝硬化时，由于门脉分流，血清BA升高并从尿中大量排出。,35,TBA与肝硬化,TBA对肝硬化的诊断具有特殊价值： TBA20mol/L时，考虑慢性活动性肝炎 TBA30mol/L时，肝硬化可能性很大 此外，在肝炎和肝硬化病人，胆酸（cholic acid，CA）的合成显著减低，引起胆酸和鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholic acid ，CDCA）的比率不正常，甚至出现倒置。 CA与CDCA的比率改变可被看作为肝细胞功能异常的一项诊断指标。,36,二、胆汁酸代谢异常,2、胆汁淤积时 由于胆道寄生虫、狭窄等致胆汁淤积时，病人可表现为 血清TBA浓度升高，尿中胆汁酸排出也增多。 胆道阻塞时，CA/CDCA1 肝实质细胞损伤时，CA/CDCA1 胆汁淤积时，血清中增高的主要是游离胆汁酸,37,高胆红素血症和胆汁淤积的鉴别诊断,TBA正常，胆红素高胆红素血症 TBA，胆红素正常胆汁淤积症 TBA，胆红素胆汁淤积性黄疸,38,二、胆汁酸代谢异常,3、肠道疾病时 因胆汁酸的肠肝循环受阻，胆汁酸回到肝脏的量减少，血清胆汁酸水平降低；同时，由于胆汁酸返回肝脏减少，反馈抑制减弱，致肝脏胆汁酸的合成加速，血清胆固醇浓度减低。 可见，血清胆汁酸水平降低是回肠功能紊乱的一个反映。,39,二、胆汁酸代谢异常,4、高脂蛋白血症时 各型高脂蛋白血症，其血浆胆固醇浓度均有不同程度的升高，而胆汁酸的形成是胆固醇代谢的主要通路，因此，高脂蛋白血症时的代谢紊乱必然涉及胆汁酸的代谢异常。,返回章目录,40,临床常用的血清酶： ALT AST ALP1-6 -GT1-3 GLDH AFU LDH1-5 MAO,第四节 肝胆疾病酶学指标测定,41,血清酶活性通常用动力学连续监测法测定 同工酶的测定：采用同工酶电泳法、免疫抑制法、热失活、酶蛋白定量等方法 巨酶：唯一可能确切检测巨酶的方法是检测分子量 注意：只有在同样的实验条件下测定的酶活性结果才有可比性,一、血清酶学测定方法概述,42,二、血清酶的代谢与临床应用,1）丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT） T1/247h，3000倍于血浆，主要分布于肝、肾。 急性肝损伤升高较为明显，对非酒精性、无症状者较特异。,1、氨基转移酶,43,ALT测定需注意的问题,RBC ALT比血浆高7倍，标本应避免溶血 血清2025 24h 稳定，28稳定7d，宜3d内测定，不推荐反复冰冻保存 IFCC 推荐ALT检测试剂中加入磷酸吡哆醛（P-5,-P）作为酶的辅基 肝素锂抗凝血浆可使测定结果偏低,44,2、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase，AST） T1/217h，7000倍于血浆，主要分布于肝、心、骨髓肌细胞。 肝硬化、肝脏药物毒性时升高较ALT明显。分为ASTs和ASTm，分别存在于细胞质和线粒体，ASTm可反映肝细胞受损程度。,1、氨基转移酶,45,RBC内AST为血清AST的10倍 剧烈运动可升高 试剂空白吸光度需大于1.2，空白测定值 5U/L AST活性稳定，冰箱内可保存数日,AST测定需注意的问题,46,2乳酸脱氢酶,乳酸脱氢酶（LDH）共有五种同工酶，其中 LD4和LD5主要存在于肝和骨骼肌，肝细胞内的LD4和LD5约为血浆的500倍，半衰期约4 6h。 所以，肝炎时LD的上升通常是一过性的，当出现临床症状时LD往往已恢复至正常。,47,不同类型的同工酶出现在肝脏、骨骼、肾脏、肠道以及胎盘中 肝脏ALP T1/23d，可反映胆道功能障碍 阻塞性疾病时升高达参考上限的2倍或更高，大致与血清胆红素的升高相平行 部分阻塞时与结合胆红素的升高不成比例 肝细胞性黄疸时常温和升高,3. 碱性磷酸酶 （ALP）,48,缓冲液分惰性型、抑制型、激活型三种，使用激活型缓冲液测定结果可比惰性型高26倍 血清置室温，ALP活性轻度升高 ALP活性与血清在反应液中所占体积分数有关 溶血易产生负干扰 宜用血清或肝素抗凝血浆测定，草酸盐、柠檬酸盐和EDTA-Na2能抑制ALP活性,ALP测定的注意事项,49,GGT T1/2 10d 主要用途在于鉴别升高ALP的来源： ALP升高且GGT相应升高，则升高的ALP最可能来自于胆道； ALP显著升高，通常超过参考上限的10倍，可能源自原发性胆汁性肝硬化或硬化性胆管炎。,4. -谷氨酰基转移酶 （GGT）,返回章目录,50,重氮法(改良J-G法) 胆红素氧化酶法 钒酸氧化法 亚硝酸盐氧化法 高效液相色谱法,第五节 总胆红素与直接胆红素的测定,51,改良J-G法测定原理,重氮试剂：亚硝酸钠+对氨基苯磺酸 加速剂（咖啡因+苯甲酸钠）：破坏游离胆红素分子内氢键，使之与重氮试剂反应生成偶氮胆红素 碱性酒石酸钠：使吸光度由530 598nm 叠氮钠（或抗坏血酸）：中止反应，防止游离胆红素缓慢反应,52,优点： 灵敏度高 精密度、准确度好 误差因素少 1037不受温度变化影响，呈色反应在2h内非常稳定 缺点：不适用于自动化分析，严重溶血可使结果偏低 ，易受脂血干扰,改良J-G法的优缺点,53,胆红素氧化酶（BOD）催化胆红素氧化生成胆绿素，并进一步将其氧化成淡紫色化合物；在460nm处吸光度值的下降与血清中胆红素浓度成正比。 BOD在碱性环境中可氧化所有胆红素成分；而在酸性条件下，未结合胆红素不被氧化。故可根据最适pH差别分别测定总/直接胆红素。,胆红素氧化酶法测定原理,54,优点： 特异性好 灵敏度高 重复性好，精密度较重氮反应法高 抗干扰能力优于重氮法 溶血干扰小 缺点：试剂较为昂贵,胆红素氧化酶法的优缺点,55,化学氧化法,钒酸盐胆红素氧化法 亚硝酸盐氧化法 综合氧化剂法,56,钒酸盐氧化法测定TBIL,黄疸样本,无色试剂,氧化成胆绿素,57,二、临床评价,1血清总胆红素和直接胆红素测定 血清总胆红素含量能准确地反映黄疸的程度，结合胆红素含量对鉴别3种黄疸类型有较大意义。,58,二、临床评价,2-胆红素（B）测定 -胆红素：与血清清蛋白共价结合的结合胆红素 -胆红素含量占总胆红素的20%30%，可与重氮试剂呈现直接反应 （1）-胆红素与急性肝炎的恢复期密切相关 （2）判断预后 ：B/TB持续或逐渐降低，提示病人预后不佳,返回章目录,59,气相色谱法 高效液相色谱法 免疫分析法 酶法,第六节 血清总胆汁酸测定,60,一测定方法概述及方法学评价,气相色谱法 ：测定前须对标本预处理，不宜作常规分析 高效液相色谱法 ：灵敏度受到检测器的影响，且设备昂贵 免疫分析法 ：技术复杂且仪器设备昂贵，不适合临床使用 循环酶法：简便、快捷，可手工操作，也能进行自动化分析，是目前临床推荐的分析方法。,61,二、总胆汁酸酶循环法测定,基本原理： 血清总胆汁酸在3羟基类固醇脱氢酶（3-HSD）的催化下生成3-酮类固醇，同时将硫代氧化型辅酶(Thio-NAD+) 特异性地氧化形成硫代还原型辅酶(Thio-NADH)。 3-酮类固醇在3-HSD 和还原型辅酶(NADH) 作用下，形成胆汁酸和氧化型辅酶(NAD+) 。样本中的胆汁酸在多次酶循环的过程中被放大，同时使生成的Thio-NADH 扩增。 测定Thio-NADH 在405 nm 处吸光度的变化,求得总胆汁酸的含量。,62,总胆汁酸酶循环法示意图,1,2,3,4,反应：1234，循环 ，最后在405nm处测硫代NADH,63,肝细胞损伤 胆道梗阻 门脉分流 生理性升高,胆汁酸测定的临床评价,64,血清胆汁酸异常的程度与肝胆疾病种类的关系,返回章目录,65,协助诊断肝病及肝损害程度、转归及预后 鉴别诊断黄疸 治疗药物肝毒性监测 评估手术耐受能力 其他：献血员筛选、疗效评价、健康体检,第七节 肝胆疾病的生化诊断,（一）肝脏功能检查的目的与应用,66,（二）肝功能检查指标的选择与组合原则,检查指标的选择应遵循如下原则： 应根据检查指标本身的应用价值，尽可能选用相对灵敏和特异的实验项目 根据肝脏疾病检查目的进行合理选择 常规检查应选用诊断价值高、操作简便、结果可靠、易于标化等功能的指标,67,肝脏贮备功能检查,吲哚菁绿（ ICG）清除试验（在体内不经代谢立即从肝脏迅速排出） 利多卡因、咖啡因、氨基比林清除试验（需经肝细胞微粒体内药物代谢酶作用而清除 ）,二、肝脏疾病的生物化学鉴别诊断,68,1. 血浆（清）酶水平 反映肝实质细胞损伤酶类：主要有ALT、AST和LDH 反映胆汁郁积为主的酶类：主要有ALP、GGT和5-NT 反映肝纤维化为主的酶类：主要是单胺氧化酶（MAO）,肝脏受损的实验室检查,69,2. 甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP） AFP常用作肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的诊断指标，90%的HCC病人AFP出现升高。AFP400ng/dl提示肿瘤已经扩散。,肝脏受损的实验室检查,70,3. 自身免疫标志物 原发性胆汁性肝硬化（PBC）标志物：抗线粒体M2抗体对PBC的特异性为100% 原发性硬化性胆管炎（PSC）标志物：抗中性粒细胞胞浆抗体 （ANCA）等,肝脏受损的实验室检查,71,4. 肝炎病毒感染标志物 80%90%的急、慢性肝炎均由病毒导致。 通过检测不同的血清学标志物如病毒抗原、IgG或IgM型抗体，也可采用PCR的方法直接检测病原体以帮助诊断。,肝脏受损的实验室检查,72,肝脏疾病实验室检查的特点可概括为： 肝炎：转氨酶明显升高 肝硬化：转氨酶正常或轻微升高的同时往往总蛋白和清蛋白降低 肝后胆管阻塞：胆红素和ALP升高 占位性损伤：ALP和GGT升高 暴发性肝衰竭：转氨酶升高的同时往往伴有总蛋白和清蛋白下降（合成功能下降）,肝脏疾病的实验室诊断,73,实验检查选择思路,贮备、代偿、再生能力强 防漏检 多项试验组合反映功能全貌 与病原学、病理学、影像学检查相结合 结合临床、全面分析、综合判断,74,A 60-year old woman had a rectal carcinoma removed surgically. There was no evidence of spread, and her LFTs at that time were normal. At follow up 3 years later however, the following results were noted : Bilirubin 20 mol/L AST 23 IU/L Alkaline phosphatase 820 IU/L,Clinical case,LFT（liver function test）：肝功能试验,75,Questions,1.How would you interpret these results? 2.What is the possible mechanism? 3.What is a possible cause? 4.What further investigations are needed?,76,Analysis,1、A markedly raised alkaline phosphatase, with normal or only slightly raised bilirubin and AST, constitutes dissociated LFTs and is suggestive of a space occupying lesion in the liver. 2、The mechanism is obstruction of a biliary radicle, causing secretion of liver alkaline phosphatase from the obstruction duct epithelium, but little or no hepatocellular damage or obstruction to outflow of bil