抗原抗体反应的应用

第七章 抗原抗体反应及应用,第三节 抗原抗体反应的应用,2019/3/25,第三节 抗原抗体反应的应用,一、免疫沉淀和免疫凝集 二、免疫标记 三、免疫定位分析 四、抗原抗体反应的其他应用,2019/3/25,一、免疫沉淀和免疫凝集,免疫沉淀和免疫凝集利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析，是最经典的血清学方法。 特点：特异、灵敏、快速。,2019/3/25,溶液中的沉淀反应 在体外可溶性抗原与相应抗体形成肉眼看见的沉淀物。 在液相中形成的沉淀不容易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于观察。,2019/3/25,环状沉淀实验示意图,2019/3/25,2、凝胶中沉淀反应 抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散，相遇形成沉淀。 以琼脂扩散实验较为常用。 单向免疫扩散：抗体混于琼脂中，小孔中加入抗原，抗原向周围均匀扩散，与抗体形成沉淀环。可用于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。 双向免疫扩散：抗原和抗体向周围扩散后可在两孔之间形成白色沉淀线，可用于抗原或抗体的定性检测。 缺点：时间长，灵敏度低。,2019/3/25,免疫双扩散,2019/3/25,3、电泳条件下的沉淀反应 a、免疫电泳： 是利用蛋白质在凝胶中迁移率不同1能被分离的特性与免疫扩散结合进行分析的方法，这种方法能提高分辨率和灵敏度。 实验分二步,先用电泳将抗原各成分依电泳速度不同分开,再进行双扩散,常用此法进行血清的蛋白种类分析,对于免疫球蛋减少或增多的疾病诊断或鉴别诊断有重要意义。,2019/3/25,2019/3/25,b、对流免疫电泳: 是一种将双向扩散和电泳技术相结合的检测方法。即在琼脂板上, 使抗原和抗体在电场作用下定向移动, 当抗原抗体相遇且二者浓度比例合适时, 即可出现白色沉淀线。,2019/3/25,c、火箭电泳： 单行免疫扩散与电泳结合的一种方法。在已混合有抗体的凝胶上，做一个小孔，加入抗原，电泳后，沿着电泳方向形成火箭型沉淀，沉淀线的高度与抗原量成正比。,2019/3/25,4、免疫凝集： 大的颗粒性抗原如细胞细菌等与相应的抗体结合后能使抗原颗粒发生凝集，形成肉眼可见的凝集小块，即为凝集反应。 最常见的凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。 免疫凝集反应虽然简便，但受反应灵敏度限制，在实际应用中越来越少。,2019/3/25,二、免疫标记,免疫标记技术：将已知抗体或抗原标记上易显示的物质（示踪物），通过检测标记物反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。 目前有四种方法： 放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最灵敏、可靠的免疫标记技术。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 荧光与发光免疫分析 亲和标记的免疫分析,2019/3/25,1、放射免疫分析 原理: 放射性同位素(131I, 或125I)标记Ag或Ab测定Ab或Ag,通过测定放射活性判断结果。该法常用于测定微量物质: 如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及lgE等。 检测方法： 液相体系用液体闪烁仪计数； 固相体系用X射线胶片显影。,2019/3/25,放射性同位素标记分析法,2019/3/25,2、酶联免疫吸附试验 (1)定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。 (2) 测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。,2019/3/25,(3)测试过程 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原抗体的形成） 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）,2019/3/25,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）,2019/3/25,常用标记的酶及其底物,2019/3/25,3、荧光与发光免疫分析 用于标记抗体的荧光化合物有异硫氰荧光素、罗丹明荧光素等，适用于抗原细胞与组织的定位分析。 时间分辨荧光免疫分析法： 原理：稀土铕离子Eu3+螯合物标记抗体后，抗体与 固相抗原结合，抗体上的Eu3+在紫外光（340nm）激发下，与增强液中的-二酮体重新形成一种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光（613nm），比未激发时增强了100万倍，可用时间分辩荧光计记录。,2019/3/25,2019/3/25,4、亲和标记的免疫分析 亲和标记物：金黄色葡萄球菌的A蛋白、生物素（维生素）、地高辛（小分子药物） 原理：金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgG的Fc有高度亲和力。用酶、同位素和荧光素等标记A蛋白，与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。,2019/3/25,三、免疫定位分析,1.免疫荧光定位分析 2.酶标记免疫定位 3.免疫电子显微镜技术,2019/3/25,1、免疫荧光定位分析 用不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学、免疫组织化学检测。 （荧光化合物+抗体）-生物大分子（抗原）在细胞或组织中的表达和定位 荧光素：异硫氰荧光素、异硫氰四甲基罗丹明 荧光显微镜观测 荧光激活细胞分拣器（流式细胞仪） 应用：CD4+、CD8+T细胞亚群计数 原理：流式细胞仪产生分析的电信号生要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分析和分选细胞。,2019/3/25,2、酶标记免疫定位 酶标记免疫定位的方法及原理与dot-ELISA相同，所用的酶底物在反应后必须形成不溶于水的有色产物。酶标记免疫定位主要用于免疫组织化学进行组织和细胞内的抗原定位，及在免疫印迹分析中代替同位素标记进行定位显色等。,2019/3/25,（1）酶标免疫组织化学 固相抗原为组织切片或细胞样品。 （2）免疫印迹 蛋白质经凝胶电泳后，形成不同的条带，转移至硝酸纤维膜上，用酶标记的抗体进行显色反应，可确定目的蛋白的有无，或分子量大小。 分三个阶段进行 : SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 转移硝酸纤维素膜 酶免疫定位,2019/3/25,免疫印迹法原理示意图,2019/3/25,3、免疫电子显微镜技术 电子显微镜技术与免疫反应相结合的一项技术。 优点：提高了电镜观察的特异性。 如形态相同，但结构和组成不同的生物粒子，细胞器或病毒粒子。 种类： 一类是先用抗体捕捉抗原，然后用磷钨酸负染色观察。 另一类是用金标记抗体进行抗原定位。胶体金与抗体Fc段结合。,2019/3/25,四、抗原抗体反应的其他应用,1、免疫亲和色谱 免疫亲和色谱是一种从多组分混合物中分离纯化单组份产物简便而有效的方法，比凝胶过滤和离子交换色谱或得的产物纯度更高。 原理：任何一对抗原-抗体的组分之一与固相基质交联后均可用于另一组分的纯化。广泛用于蛋白质抗原的分离纯化。 固相基质：琼脂糖、葡聚糖,2019/3/25,OD280检 测,凝胶电泳,免疫亲合色谱示意图,