生物制药

药物：预防、诊断、治疗疾病，改善生活质量和影响人体生物学进程的物质。包括：化学药物、中药、生物药物生物药物：利用生物体、生物组织或其成分、综合应用多门学科的原理和方法进行加工、制造而成的一大类药物的总称。包括：发酵工程制药、生化工程制药、基因工程制药、细胞工程制药、酶工程制药生物药物的分类：核酸类药物、基因重组多肽/蛋白、半合成生物药物、天然生化药物半合成生物药物：以天然生物药物为母体，经化学或生物方法进行结构修饰合成的药物；基因药物，即以DNA,RNA为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗，反义药物和核酶等生物药物的分类：天然生化药物、微生物药物、基因工程蛋白药物、核酸类药物、医学生物制品肝素是从猪粘膜中提取的一类多糖，肝素钙与小分子量肝素是肝素的系列药物，主要作为抗凝血药。微生物药物：由微生物代谢所产生的药物以及借助微生物转化产生的用化学方法难以合成的药物或中间体。主要包括抗生素类、氨基酸类、维生素类及酶等；抗生素：由生物（包括微生物、植物和动物）在其生命过程中所产生的一类在微量浓度下就能选择性抑制其它生物或细胞生长的生理活性物质。核酸类药物：这类药物是以基因物质（DNA或RNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段，反义RNA药物和核酶等。生物制药发展历程：1 传统生物制药发展阶段；2 近代生物制药发展阶段；3 现代生物制药发展阶段生物制药工艺学是一门综合性应用技术科学，其研究内容包括生化制药工艺、微生物制药工艺、生物技术制药工艺、生物制品及相关的生物医药产品的生产工艺等。生化制药：生化制药主要从动物、植物、微生物和海洋生物中提取、分离、纯化生物活性物质，加工制作成为生化药物。生物技术制药： 生物技术制药是利用现代生物技术（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等），生产多肽、蛋白质、酶和疫苗、抗体等。生物制药的研究发展趋势：1.基因组学成果促进生物技术新药的研发2.蛋白质工程药物的开发 3.新型疫苗的研制 4.新的高效表达系统的研究与应用5.生物技术药物新剂型6.生物资源的综合利用与扩大开发 7.抗生素和氨基酸的新型生产工艺8.中西结合创制新型生物药物第二章生物制药工艺技术基础生化制药技术工艺基础：1.生物原料与生物活性物质 2.生物活性物质的提取 3.生物活性物质的浓缩与干躁 4 .生化物质的分离纯化方法从植物中提取的生物活性物质是生化制药重要来源。4. 生物材料的选择、预处理与保存：1.选择:有效成分含量高,原料新鲜。2.预处理:去除无用组织、尽快处理，防止腐败变质。3.保存:（1）冷冻保存法；（2）有机溶剂脱水法；（3）防腐剂保鲜法；制药微生物菌种的保藏： 菌种经过多次传代，会发生遗传性状的变异，导致菌种退化，即生产能力降低甚至丧失； 菌种保藏大致原则：让菌体处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，如低温、干燥、缺氧和营养缺乏等。常用的保藏方法：1.斜面低温保藏法：固体斜面培养基，2-8保藏；2.液体石蜡保藏法：固体斜面，液体石蜡封存，冷藏；3.沙土管保藏法：孢子悬液与沙土混合后真空干燥；适用于产孢子的菌种，广泛用于抗生素工业生产；4.液氮冷冻保藏法：密封菌悬液，保护剂，液氮保藏；5.冷冻干燥保藏法：冻干菌粉，保护剂，真空，冷冻；微生物代谢产物的生物合成微生物的代谢产物有初级代谢产物与次级代谢产物之分。（1） 微生物初级代谢产物的生物合成 举例：发酵法生产赖氨酸（高丝氨酸缺陷型生产菌）图自己画发酵方式：1. 表面培养；2.深层培养法1. 表面培养法： 微生物在液体、半固体或固体的基质表面进行发酵培养的方式：经培养后，基质表面形成一层菌膜，菌体产生的代谢产物扩散到基质中或留在细胞内。2.深层培养法：也叫做液体深层培养，是把微生物接种于发酵罐，使菌体细胞悬浮在液体中并进行生长的一种发酵方式，深层液体培养一般需要通入空气并进行搅拌；是工业生产上普遍采用的一种培养方式。制药工业中，抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂等大多都是采用液体深层发酵方式进行生产。（1） 分批发酵（间歇发酵） 分批发酵是指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方法：即所有物料都一次性地加入发酵罐中进行发酵，中途不补充碳氮源等营养成分；微生物的生长遵循典型生长曲线规律。（2）补料分批发酵（流加发酵） 在分批发酵的基础上，间歇或连续地补充新鲜培养基（或某种营养成分）的发酵方式，以克服分批发酵由于养分不足而过早结束发酵的缺点。 思考：为什么不能将后来流加的营养成分在发酵前一次性加好？（3）连续发酵 连续发酵是指培养基料液连续输入发酵罐，同时放出含有产品的发酵液的过程，即发酵-分离过程偶联。补料分批发酵（流加发酵）的优点：（1）可避免由于营养过多造成的菌体过度生长现象；（2）流加方式可使底物浓度控制在较低水平，避免或解除底物抑制效应（如葡萄糖效应）；（3）可缓解培养液中碳氮源浓度的衰减，延长微生物细胞的对数生长期和稳定期，增加目的产物的合成；（4）可改善发酵培养液的流体性质，降低黏度，提高溶氧；连续发酵的优点：（1）连续发酵及时将产物分离出去，既避免了产物阻遏效应，也有效避免了堆积的产物的降解；（2）提高了设备的利用效率，参数易于自动化控制； 连续发酵技术尚未在工业生产中广泛应用，目前仅应用于啤酒、酒精、丙酮、丁醇等的生产；（发酵-渗透蒸发偶联)连续发酵的缺点：（1）发酵过程长；（2）染菌与菌种退化；（3）产物线分离困难；发酵的基本过程 发酵的基本过程包括：培养基的配置及灭菌、种子液的准备、发酵过程的控制与优化、产物的分离提取及发酵废液的处理等。1.菌种菌种是生产的源头，包括从自然界直接筛选得到的野生型菌、经诱变育种得到的高产菌或者基因工程改造的重组菌。菌种保藏过程容易出现菌种退化现象，需要采用合理的保藏方式并进行菌种复壮。2.孢子制备孢子制备是以孢子繁殖的菌种发酵过程的一个重要环节，其方法是将保藏的休眠状态的孢子转接到固体培养基斜面上，在一定温度下进行扩培。3.种子制备是指由保藏的菌种（或孢子）开始，经过逐级扩大培养，最后获得供生产发酵罐接种的足够数量的优质菌体（或孢子）。4. 培养基的配置不同的微生物、不同的目标产物、不同的培养工艺、不同的培养阶段对培养基组成有不同的要求。培养基的主要成分包括：碳源和氮源、无机盐（包括微量元素）及前体。（1）碳源： 构成菌体细胞和代谢产物碳骨架及提供能量；（2）氮源： 是菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、酶及核酸）及其他含氮代谢产物中氮的来源；（3）无机盐和微量元素：（4）前体： 在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。5. 发酵 发酵过程的目的是使微生物大量生产目的产物，为了达到该目的，需要对发酵过程进行控制。 控制参数包括：罐温、罐压、pH、通气量、搅拌速度、溶氧水平以及总糖、还原糖、铵态氮的浓度等；药用酶的修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶的分子修饰。修饰的目的是为了创造天然酶所不具备的某些优良特性，扩大酶的应用领域。（1）提高或改善酶的生物活性（如酶的催化活性、底物专一性等）；（2）增加酶对不良环境的耐受性（如耐热性、耐酸碱性及有机溶剂耐受性等）；酶的固定化及其在制药方面的应用 酶的固定化是指借助与物理或化学方法把酶束缚或限制在一定的空间内并保证其催化活性的技术。酶的固定化方法（1） 吸附法。（2）包埋法（3）交联法（4）共价结合法第3章 氨基酸类药物 氨基酸的特点：（1）两性电解质（酸性的-COOH和碱性的-NH2）；（2）光学活性物质（R = H，不对称碳原子，甘氨酸除外）；氨基的生产方法生产方法：主要有水解法、化学合成法、微生物发酵法和酶合成法，目前，除少数品种采用水解法提取外，大部分氨基酸都采用发微生物酵法生产，个别品种也采用酶法合成或化学合成。1、 水解法 水解法是以毛发、血粉及废蚕丝等富含蛋白质的原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，再经分离纯化获得各种氨基酸的工艺过程。 水解法的优点是原料较丰富，投产容易；缺点是产量低、成本高、污染大，因此目前工业上仅有少数几种发酵法难以生产的氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸等）还采用水解法生产。名称水解条件优点缺点注酸水解法用6-10ml/LHCl在110-120下，水解12-24h水解完全彻底，全部是L-氨基酸，不引起氨基酸消旋作用色氨酸全被破坏；丝氨酸部门被破坏；腐蚀设备；劳动条件差；产生大量废酸工业生产常采用碱水解法用6mol/LNaOH或在100水解6h水解完全，色氨酸不被破坏，不腐蚀设备氨基酸发生消旋作用；丝氨酸、精氨酸、胱氨酸等大部分被破坏一般很少采用酶水解法用胰酶、蛋白酶等，在适宜的PH、温度、一定的时间和酶浓度下水解蛋白质水解不彻底；中间产物多肽类较多；一般时间较长；易污染菌水解不彻底；中间产物多肽类较多；一般时间较长；易污染用于制造蛋白胨、水解蛋白、氨基酸生产较少用2、 发酵法 狭义：通过特定微生物在以碳源和氮源以及其它成分的培养基中生长，直接产生氨基酸的方法，也称为直接发酵法； 广义：除直接发酵法外，还包括添加前体发酵法及酶转化法合成氨基酸。流程：1.菌株选育；2.培养基配置灭菌；3.菌种扩大培养；4.接种发酵；5.产品提取；6.分离纯化3、 酶转化法 酶转化法是指在某些特定酶的作用下，使某些化合物转化为相应氨基酸的技术。其基本过程是以氨基酸前体为原料，通过酶催化反应制备氨基酸。4、 化学合成法 化学合成法是以某些化合物为原料，经化学反应合成相应氨基酸的方法。 对称合成法：产物为D型与L型氨基酸的混合物（外消旋体） 不对称合成法：产物为单一的D型或L型氨基酸；重要氨基酸药物的生产工艺1、 L-胱氨酸1.结构与性质L-胱氨酸在毛、发等角蛋白中含量最多，其分子由两分子半胱氨酸脱氢氧化而成在75水中溶解度为0.052（微溶于水），不溶于乙醇及其它有机溶剂，易溶于酸、碱溶液，在热碱液中易分解， 等电点为5.06 。提取法制备氨基酸主要从毛发、血粉、蚕丝等富含氨基酸的原理中提取。2. 酸水解法制备胱氨酸的生产工艺工业上目前主要采用酸水解法生产胱氨酸，以人发和猪毛为原料，利用强酸进行水解，分解成多种氨基酸，然后再将胱氨酸与其它氨基酸及杂质分离。（2） 工艺过程 水解 将角蛋白分解为胱氨酸，并溶于酸性溶液； 中和 将pH调至等电点附近，溶解度降低而析 脱色 将粗品复溶于盐酸，并加入活性炭脱色； 二次中和 再次中和，将pH调至等电点附近，析出； 精制 再次进行活性炭脱色除杂，并将pH调至4.0（第三次中和）使产物 析出，之后纯水洗涤、干燥制成精品胱氨酸。（3）工艺讨论 影响毛发蛋白水解的因素 毛发角蛋白由胱氨酸等十几种氨基酸组成，胱氨酸收率的高低主要取决于蛋白质 水解程度与胱氨酸破坏程度。2、 L-赖氨酸1.结构与性质 赖氨酸极易溶于水，不溶于乙醇与乙醚等有机溶剂，等电点为9.74,；由于赖氨酸易吸收空气中的二氧化碳，故制取结晶比较困难，一般商品都是赖氨酸盐酸盐形式。2.赖氨酸生物合成途径 赖氨酸生产菌主要为谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等；工业上采用高丝氨酸营养缺陷型兼AEC抗性突变株提高赖氨酸产量。 天冬氨酸激酶是关键的限速酶，受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈抑制。赖氨酸的发酵生产 （1）工艺流程 斜面菌种转接活化摇瓶种子培养种子罐扩大培养发酵罐预处理及固精制（废弃菌株）液分离澄清液提取精制Lys产品（2）工艺路线 （3）工艺过程 菌种培养 灭菌、发酵 发酵液处理及固液分离 提取：离子交换与结晶 精制：活性炭脱色、重结晶及干燥（4）工艺讨论 赖氨酸发酵分为两个阶段：菌体生长期与产酸期； 防止回复突变； 阶段控温：前期32，中后期30； 种子状态与接种量 溶氧的影响 培养基成分的影响（生物素、硫酸铵）L-天冬氨酸与L-丙氨酸1.结构与性质 L-天冬氨酸为酸性氨基酸，等电点为2.77，可溶（微溶）于水（25水中溶解度为5），较易溶于热水、酸与碱，不溶于乙醇、乙醚；L-丙氨酸为中性氨基酸，等电点为6，易溶于水（25水中溶解度为166.5） ，微溶于乙醇，不溶于丙酮与乙醚；2. 酶转化工艺酶转化工艺是在特定酶的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸的技术，基本过程是：培养产酶的微生物，然后将酶或细胞进行固定化处理，并装填与适当的反应器中，加入相应的底物合成特定的氨基酸，反应液经分离纯化得到相应氨基酸。酶转化法的特点：工艺简单、可连续操作、酶或细胞可重复使用、产物浓度高、副产物少、生产效率高。L-Asp和L-Ala的酶转化反应（自己画）工艺路线3. 工艺过程（1）菌种培养: E.coli AS1.881(含天冬氨酸酶）、德阿昆哈假单孢菌变异株（含L-Asp-脱羧酶）；（2）细胞固定：用戊二醛结合法；固定化类型？（3）制备生物反应器：将固定化细胞填充于柱子中，制成填充床式反应器。（4）细胞转化：将底物溶液流过填充床反应器，在固定细胞的作用下进行转化。（5）产品纯化与精制 转化液I：过滤澄清后，将pH调至2.8（等电点附近），低温下结晶，冷水洗涤后干燥得到天冬氨酸粗品；粗品用稀氨水溶解（pH5），活性炭脱色，低温结晶、干燥精制； 转化液II：过滤澄清后，减压浓缩，甲醇沉淀、洗涤并干燥；粗品溶解后，活性炭脱色，再次进行甲醇沉淀并干燥精制。思考：对转化液I和II为什么采用两种不同的沉淀方式？搅拌式反应器：传质快、酶与底物的接触效率高；机械剪切力大；填充床式反应器：传质较慢；反应温和，对酶及固定载体破坏小；酶法工艺的优点之一：产物浓度往往较高；L-苯丙氨酸1. 结构与性质 L-苯丙氨酸等电点为5.5，微溶于水（25水中溶解度为3），微溶于甲醇、乙醇，不溶于乙醚； L-苯丙氨酸是人体不能合成的必须氨基酸，广泛应用于医药（复配氨基酸输液原料）及食品（阿巴斯甜）。2. 酶法拆分DL-Phe的原理 (1) DL-Phe与醋酸酐生成Ac-DL-Phe； (2) L-氨基酰化酶专一性水解Ac-L-Phe生成L-Phe； （3）利用L-Phe与Ac-D-Phe在水中溶解度的差异进行分离； （4）Ac-D-Phe又可经消旋反应生成Ac-DL-Phe，再进行水解和分离；如此反复进行，可将DL-Phe全部转化为L-Phe。3.工艺路线4. 工艺过程(1) 固定化氨基酰化酶的制备(2) Ac-DL-Phe的制备(3) 酶的水解：将Ac-L-Phe水解为L-Phe；(4) 分离纯化：浓缩、低温结晶，溶解度低的L-Phe析出；(5) 精制：活性炭脱色、等电点配合乙醇沉淀、重结晶；(6) Ac-D-Phe的消旋：将Ac-D-Phe转变为Ac-DL-Phe；扩展内容：赖氨酸的酶拆分法生产酶拆分发利用化学合成得到的D/L混合型氨基酸作为拆分原料，一般先要引入一个水解基团，在专一性的水解酶的作用下仅将水解基团从L-型氨基酸上水解下来，得到L-型氨基酸；该工艺结合了化学合成法与酶拆分法的优点，是工业上生产L-型氨基酸的常用思路。扩展内容：D-天冬氨酸的制备氨基酸输液 多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液称氨基酸输液。一、氨基酸输液的一般要求（1）所有氨基酸均为L型；（2）含8种必需氨基酸与2种半必需氨基酸；（3）必需氨基酸与非必需氨基酸维持一定的比例；（4）补充辅料，提高营养或氨基酸利用率；三、氨基酸输液的制备 氨基酸的制备有两种方式：一种是取高纯度的L-型结晶氨基酸进行配制；另一种是以蛋白质为原料，经过彻底水解，得到氨基酸混合物，经纯化后，定量分析各种氨基酸，按配方补足并调整各种氨基酸的含量；四、氨基酸输液的质量要求五、氨基酸输液的种类与应用 1营养用氨基酸输液2肝病用氨基酸输液3婴幼儿用氨基酸输液4癌症用氨基酸输液5营养代血浆第四章 多肽与蛋白质类药物 多肽和蛋白质，从化学结构上看并没有本质的区别，它们都是由氨基酸通过酰胺键（肽键）连接而成的化合物。 一般将组成化合物的氨基酸数目在50个以下的，称为多肽；50个以上的称为蛋白质。1、 多肽类药物主要的多肽类药物1多肽激素 垂体多肽激素： 下丘脑激素： 甲状腺激素： 胰岛激素： 胃肠道激素： 胸腺激素：2多肽类细胞生长调节因子 表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素等。3含有多肽成分的其他生化药物 骨宁，血活素，氨肽素，蜂毒，蛇毒，胎盘提取物，花粉提取物，脾水解物，心脏激素等。 二、蛋白类药物 蛋白质生化药物除包括蛋白类激素和细胞生长因子外，还有像血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等其它生化药物品种； 利用基因工程技术制造重要的蛋白类药物，已实现产品工业化的有几十种，包括胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、促红细胞生成素等；蛋白类药物的分类1蛋白质激素（1）垂体蛋白质激素 生长素，催乳激素，促甲状腺激素等（2）促性腺激素 人绒毛膜促性腺激素（hCG），血清性促性腺激素（3）胰岛素及其他蛋白质激素 胰岛素，松弛素等 2血浆蛋白质 白蛋白，免疫丙种球蛋白,纤维蛋白原,抗凝血因子等。3蛋白质类细胞生长调节因子 干扰素，白细胞介素，神经生长因子，肿瘤坏死因子，促红细胞生长素，集落刺激因子等；4 黏蛋白 是一类主要由黏多糖组成的糖蛋白，常见于膝盖 滑膜液，如胃膜素,硫酸糖肽,内在因子等。5 胶原蛋白 多肽与蛋白类药物的主要生产方法(一) 蛋白质与多肽类药物的提取、分离与纯化 1.材料选择 原料来源包括动物、植物及微生物等。 原料的选择原则：有效成分含量高，新鲜； 原料来源丰富，产地较近 原料中杂质含量少 原料成本低等2.提取 提取是分离纯化的第一步，是将目的产物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中。 提取的总体要求是最大限度地把目标产物成分提取出来，其关键是溶剂的选择（目标产物的溶解度要大，并尽量减少其它杂质的溶解）。3.分离纯化分离纯化是将提取液中的目的蛋白与杂蛋白及其它杂质分离开的过程。（1）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白； 根据蛋白质分子形状和分子大小的不同来纯化蛋白质（2） 根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白； 主要包括盐析法、结晶法、和低温有机溶剂沉淀法； 盐析法：不同蛋白质进行盐析沉淀时所需要的中性盐的饱和度不同，因此可通过调节中性盐的浓度使各种蛋白分段沉淀。 结晶法：利用蛋白质在一定条件下能够形成晶体的原理来纯化蛋白质的手段； 结晶是制备纯物质的有效方法，一般用于产品的精制环节。通常只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有很好的选择性。 有机溶剂沉淀法：利用蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不用，从而使不同蛋白得到分离。但有机溶剂容易使蛋白变性，因此一般要在低温下进行。 （4）根据电离性质的不同来纯化蛋白； 蛋白质是两性物质，在不同的pH条件其电荷状态不同；因此可用离子交换层析对其进行分离。（5）根据蛋白质亲和性质的不同来纯化蛋白； 主要手段是亲和层析，即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。 基因工程的重组蛋白质大多在表达时会加上一个亲和标签（如His-tag），目的就是为了便于其分离纯化。（6） 根据蛋白质疏水性来纯化蛋白； 主要手段是疏水层析，即利用蛋白质上的疏水区与吸附载体上的疏水区结合，之后再将该蛋白质洗脱下来。（7） 根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质（8） 根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质 利用硅藻土、活性炭等吸附剂对蛋白质及其它杂质成分进行吸附分离； 例1：利用活性炭去除蛋白质溶液中的色素分子； 例2：利用氯代十六烷基吡啶（CPC）从脐带消化液中选择性吸附透明质酸，从而与其它杂蛋白分离； 例3：硅藻土吸附工艺从尿液中提取尿激酶； 例4：苯甲酸吸附孕妇尿液中的人促绒毛膜性腺激素； (二) 化学合成 (三) 微生物及重组微生物发酵法 重要多肽类药物的制备1、 胸腺激素 胸腺是一个激素分泌器官，通过其产生的一系列胸腺激素来对调节免疫。 1.胸腺素； 2.胸腺肽 1.胸腺素(1) 结构与性质 80热稳定的40-50种多肽组成的混合物，分子量在1000-15000，等电点在3.5-9.5之间。 (2) 生产工艺 生理盐水浸提：3倍体积生理盐水，匀浆浸提； 热变性除杂蛋白：80热处理15min，过滤沉淀； 低温有机溶剂沉淀：5倍体积-10的丙酮，沉淀干燥； 分级盐析沉淀：25%饱和度盐析（杂质），取上清；50%饱和度盐析（产物），取沉淀； 超滤：截留大分子杂质（如热稳定的杂蛋白）； 凝胶层析法脱盐：去除小分子化合物； 冷冻干燥 三、降钙素 1. 结构与性质 降钙素是由甲状腺分泌的一种调节血钙浓度的多肽激素，是由32个氨基酸组成的单链多肽，分子量为3500，含有一个二硫键。 降钙素可溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇等有机溶剂，酸性条件（pH3-3.5)下较稳定；25下避光保存可稳定两年，水溶液于2-8可保存7d，易被蛋白酶、H2O2氧化及光氧化破坏。降钙素广泛存在于多种动物体内，由鲑鱼中获得的降钙素活性比从其他哺乳类动物中分离的要高20-50倍。2.降钙素生产工艺 丙酮脱脂：丙酮脱脂制成猪甲状腺丙酮粉； 溶解：稀盐酸溶液，加热搅拌溶解产物； 沉淀：异戊醇-醋酸-水溶液，硅藻土助滤； 溶解及酸化：盐水溶解，酸化去除杂蛋白； 吸附：羧甲基纤维素吸附产物，之后解吸附； 直接冷冻干燥或盐析及脱盐后冷干燥3. 检验方法生物活性测定法： 大白鼠静脉注射，测定血清钙值，用标准品作对照。4. 作用与用途主要功能是降低血钙，用于骨质疏松及高血钙症等。重要蛋白类药物的制备（一）白蛋白（二）干扰素（IFN）（三）胰岛素（Insulin）（四）生长素（GH）（五）绒毛膜促性激素（HCG）（六）免疫球蛋白（Ig）（七）白细胞介素-2（IL-2）一、白蛋白1.结构与性质 白蛋白又称清蛋白，是血浆中含量最多的蛋白质，主要作用是维持血浆渗透压； 白蛋白为单链，由575个氨基酸组成，可溶于水，MW65000、PI为4.7，一般在饱和硫酸铵饱和浓度60%以上时析出沉淀，对酸较稳定，受热后可聚合变性，但比其它血浆蛋白耐热，加入NaCl能提高其热稳定性。白蛋白的两种制品：人血清白蛋白（从健康人血浆中分离的）。 胎盘血白蛋白（从健康产妇胎盘中分离的）。制剂状态：淡黄色略粘稠的液体或白色冻干固体。作用与用途：维持血浆胶体渗透压，用于失血性休克，严重烧伤， 低蛋白血症等的治疗。2.白蛋白生产工艺利凡诺吸附沉淀工艺 利凡诺吸附沉淀工艺是以利凡诺作为吸附剂，利用白蛋白与利凡诺形成难溶络合物的原理，选择性地将白蛋白沉淀下盐析分级沉淀工艺 利用各种血浆蛋白盐析曲线的差异，配合pI进行分级沉淀；低温乙醇分级沉淀工艺利用各种血浆蛋白在不同浓度乙醇溶液中溶解度的不同，配合pI进行分级沉淀；2. 白蛋白生产工艺 洛合：碱性条件下白蛋白与利凡诺洛合沉淀； 解离：弱酸性条件下将白蛋白与络合剂解离； 超滤浓缩：截留白蛋白，浓缩，去除小分子物质； 热处理：使热不稳定的杂蛋白变性失活并沉淀； 过滤除菌：截留菌体，产物白蛋白透过； 液体成品分装或冷冻干燥成固体成品工艺路线大致如下：（自己画）3、 胰岛素1. 结构与性质胰岛素的基本性质（1）胰岛素为白色六面体结晶粉末，分子量约为5700，等电点为 5.3-5.35；（2）在pH4.5-6.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液， 也易溶于80%以下的乙 醇或丙酮，在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶；高浓度锌存在时，pH6-8溶解度急剧下降；（3）胰岛素在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中稳定，碱性条件下热稳定性差；2.胰岛素提取工艺 酸醇法：酸：草酸，产物在酸性条件溶解度大，稳定； 醇：乙醇，胰岛素可溶于较高浓度乙醇溶液，杂蛋白不能，可与大部分杂蛋白分离 锌沉淀法：胰岛素与锌盐形成溶解度低的金属复合物； 酸醇法提取：草酸与乙醇溶液溶解胰岛素，去除杂蛋白； 碱化与酸化：碱化去除碱性杂蛋白、酸化去除酸性杂蛋白； 减压浓缩：浓缩同时回收乙醇； 脱脂与盐析：速热速冷法脱脂；氯化钠盐析胰岛素（粗品）； 除酸性杂蛋白：调酸性杂蛋白等电点，配合丙酮沉淀； 锌沉淀：形成胰岛素锌盐复合物，同时调至复合物的pI； 结晶5、 绒毛膜促性腺激素1. 结构与性质 绒毛膜促性腺激素（hCG）是受孕后由胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由-链与-链两个亚基组成 hCG制品为白色或类白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂，等电点为3.2-3.3，干品稳定，稀溶液不稳定。2. hCG 生产工艺粗制: hCG的粗制一般采用吸附沉淀工艺，常用的吸附剂是苯甲酸、高岭土或硅藻土，其 原理是利用吸附剂选择性地吸附目标产物，从而使目标产物富集在吸附剂上并随之一起沉淀下来；精制： hCG的精制一般采用色谱分离工艺，最常用的是离子交换色谱和吸附色谱，其原理是在电荷吸引或范德华力作用下，将目标产物吸附在树脂上，与其它杂质分离后，再将产物洗脱下来；产物吸附：苯甲酸吸附、沉淀；产物释放：乙醇溶解苯甲酸，从而将不溶的产物与其分离；离子交换色谱：羧甲基纤维素树脂吸附hCG，与其它杂蛋白分离后，洗脱hCG；吸附色谱：多孔的羟基磷灰石吸附hCG，之后再洗脱下来；离子交换：电荷引力物理吸附：范德华力2、 干扰素1. 结构与性质 干扰素是指在诱导剂的刺激下生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生的蛋白质，释放的干扰素可使其它同种生物细胞获得抗病毒和肿瘤等多方面的“免疫力”。 按照结构与来源，干扰素可分为-干扰素，-干扰素与-干扰素三种。（2） 基因工程干扰素制备工艺基因工程干扰素制备工艺 （2） 基因工程干扰素制备工艺基因工程干扰素制备工艺干扰素-2b的发酵工艺过程： 工作菌种库摇瓶培养种子罐培养发酵罐培养菌体收集干扰素-2b的分离工艺过程： 菌体裂解预处理离心初级分离 干扰素纯化工艺流程：1. 溶解粗干扰素；2. 沉淀与疏水层析3. 阴离子交换层析与浓缩4. 阳离子交换层析与浓缩5. 凝胶过滤层析6. 无菌过滤分装第五章 酶类药物酶：生物细胞产生的具有催化活性的是蛋白质。 酶类药物的分类：1. 促进消化酶类2.消炎酶类3. 溶血纤维蛋白酶类 4. 抗肿瘤酶5. 其它药用酶 酶类药物的要求（1）在生理pH（中性）下，具有高活性和稳定性；（2）对其作用的底物具有较高的亲和力（即Km值低）；（3）在血清中半衰期长；（4）纯度高，尤其是注射剂类药物；（5）免疫原性低或无免疫原性；（6）无需外源辅助因子的药用酶；酶类药物的一般制备方法(一) 酶类药物的原料来源1. 原料选择（提取法）2. 微生物酶制剂高产菌株的选育（微生物发酵法） 3. 微生物酶制剂生产的发酵技术(二) 酶类药物的提取与纯化1. 生物材料的预处理（提取法）（1）机械匀浆；（3）冻融、超声、酶解等；（2）制成丙酮粉：主要作用是脱水与脱脂，2. 酶类药物的提取（1）水溶液法：pH的选择原则：在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的pH；一般来说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性溶液提取；（2）有机溶剂法：最常用的有机溶剂是丁醇（3）表面活性剂法：表面活性剂具有亲水性和疏水性的功能基团，表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，可用于提取结合酶，但目前应用较少。3. 酶类药物的分离纯化盐析法、选择性变性法、层析法、超滤法等；纯化过程要特别注意酶的失活；评价一个纯化工艺的好坏，主要看两个指标：一个是酶比活力，二是总活力回收率；尿激酶尿激酶是一种碱性蛋白酶，主要存在于人及哺乳动物尿液中，临床上作为抗血栓药物广泛使用，其抗血栓的原理主要是激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。分子尿激酶的溶栓能力高于小分子尿激酶，大分子尿激酶是由两条肽链通过二硫键连接而成； 尿激酶pI为8-9，溶液状态不稳定。尿激酶制备方法：硅藻土吸附法尿激酶硅藻土吸附工艺过程粗制： 精制： 尿液的预处理：沉淀与酸化； 阴离子交换层析：吸附色素与热源； 硅藻土吸附工艺，从尿液中富集产物； 阳离子交换层析：吸附产物，浓缩作用； 硅藻土装柱洗脱，提高洗脱效率； 透析脱盐与冷冻干燥； 尿激酶树脂吸附工艺粗制： 精制： 尿液的预处理：沉淀与酸化； 重复粗制过程的阳离子交换层析与盐析； 阳离子交换层析：724树脂吸附产物； 阳离子交换层析： 724树脂吸附产物； 盐析：得到尿激酶粗品； 冷冻干燥； 硅藻土吸附工艺与树脂吸附工艺比较1、产物吸附富集：硅藻土吸附工艺利用硅藻土的物理吸附作用从尿液中富集尿激酶；而树脂吸附工艺则是利用树脂的离子交换作用（电荷吸附）来富集产物；2、产物精制：都采用了离子交换层析进行精制：硅藻土吸附工艺利用了阴/阳离子交换层析；而树脂吸附工艺则是阳离子交换层析配合盐析进行精制；溶菌酶具有杀菌作用的天然抗感染物质，能够切断细菌细胞壁肽聚糖中的-1,4-糖苷键，引起细菌裂解，因而具有杀菌、抗炎症等作用，目前主要从鸡蛋清中提取溶菌酶。溶菌酶易溶于水，不溶于丙酮、乙醚，在酸性溶液中十分稳定，水溶液遇碱易被破坏。2. 生产工艺关键点1. 树脂吸附：pH8.0左右时溶菌酶带正电荷，而中性或酸性蛋白带负电荷，724为阳离子交换树脂，可吸附溶菌酶，去除卵清蛋白等酸性杂蛋白；2. 洗涤与洗脱：低盐缓冲液洗涤，高盐溶液洗脱；3. 盐析沉淀：硫酸铵盐析沉淀溶菌酶；4. 透析：去除沉淀的溶菌酶中夹带的硫酸铵；5. 二次盐析：酸性条件下加入氯化钠进行盐析；6. 干燥：丙酮脱水；溶菌酶基因来源：人工合成；第七章 糖类药物多糖的分离纯化 多糖在细胞内以游离型与结合型两种方式存在。结合型多糖有与蛋白质结合在一起的蛋白多糖和与脂类结合在一起的脂多糖。提取多糖时，一般需先进行脱脂，以便多糖的释放：将材料粉碎后加入乙醇-乙醚或石油醚；动物材料可用丙酮脱脂及脱水。多糖的提取: （1）难溶于水，可溶于稀碱者 （2）易溶于热水，难溶于冷水和乙醇者 （3）黏多糖（常与蛋白结合形成蛋白多糖） 碱解法，多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。 酶解法，利用蛋白酶水解蛋白，释放多糖；多糖的纯化 :（1）乙醇沉淀法:乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段，乙醇的加入改变了溶液的极性，导致糖溶解度的下降。多糖与盐结合可降低多糖的溶解度，因此加入适量的醋酸盐能够提高乙醇沉淀的效率。乙醇沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥后可得疏松粉末状产品。(2)分级沉淀法 (3)季铵盐洛合法 :应用季铵盐洛合法沉淀多糖是分级分离复杂黏多糖或从稀溶液中回收黏多糖的最有用方法之一。(4)离子交换法 :黏多糖具有酸性基团如糖醛酸和各种硫酸基，在溶液中常以聚阴离子的形式存在，因此可用阴离子交换树脂进行交换吸附，洗脱时则可逐步提高盐溶液浓度如梯度洗脱或分级洗脱，达到分离不同黏多糖的目的。肝素 肝素或其钠盐易溶于，不溶于乙醇、丙酮等溶剂；肝素在酸性条件下易水解，碱性条件下较稳定；肝素在组织中与蛋白质结合形成复合物，因此肝素的制备过程包括复合物的提取-解离和肝素的分离纯化两个步骤；（1） 盐解-离子交换工艺 粗制： 精制1、提取：碱性食盐水提取并将肝素与蛋白分离； 1、氧化脱色：过氧化氢或高锰酸钾脱色；2、热处理除杂蛋白； 2、乙醇多次沉淀及丙酮脱水3、阴离子交换吸附：低盐洗涤、高盐洗脱； 3、真空干燥4、乙醇沉淀与丙酮脱水；脱色方法：吸附脱色法：活性炭、高岭土吸附色素分子；絮凝脱色法：高分子絮凝剂絮凝色素杂质；氧化脱色法：强氧化剂破坏色素的有色基团；（2）酶解-离子交换工艺 粗制 精制1、酶解：碱性食盐水提取、胰蛋白酶降解蛋白； 1、氧化处理2、热处理除杂蛋白； 2、乙醇沉淀及丙酮脱水3、阴离子交换吸附； 3、超滤及真空干燥4、乙醇沉淀与丙酮脱水；硫酸软骨素 硫酸软骨素是从动物软骨组织中得到的酸性黏多糖，软骨中的硫酸软骨素与蛋白结合以蛋白多糖的形式存在。 硫酸软骨素为白色粉末，吸水性强，易溶于水而形成黏度大的溶液，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂，其盐类对热较稳定，受热达80亦不被破坏，但酸性条件下易降解；一般采用酶解法提取硫酸软骨素：A、酶解-吸附除杂-醇沉工艺B、酶解-离子交换-醇沉工艺（1） 酶解-吸附除杂-醇沉工艺 粗制：1、提取：碱液提取（稀碱法和浓碱法）；2、酶解：将硫酸软骨素与蛋白分离；3、 吸附除杂：高岭土/活性炭吸附杂蛋白、色素及热源；4、 乙醇沉淀与脱水；精制：复溶、酶解、热处理、醇沉、脱水及干燥；（2）酶解-离子交换-醇沉工艺 粗制：1、提取；2、酶解；3、离子交换吸附； 4、乙醇沉淀与脱水；精制：1、复溶、酶解、热处理；2、离子交换层析纯化；3、活性炭脱色、及除热源；4、超滤膜浓缩及脱盐；5、乙醇沉淀、脱水与干燥；透明质酸 提取法：从鸡冠、牛眼玻璃体中提取； 微生物发酵法：透明质酸生产菌发酵制备； 提取法：CPC洛合工艺 丙酮脱脂氯仿或三氯乙酸沉淀杂蛋白蛋白酶酶解CPC洛合及解离（起到了离子交换层析的作用）醇沉、脱水及干燥微生物发酵法制备透明质酸 一种从微生物发酵液中制备透明质酸的方法 （1）将产透明质酸的微生物细胞进行培养，调发酵液的pH， 过滤； （2）配制聚乙二醇/苹果酸钠双水相萃取体系溶液； （3）利用双水相萃取体系进行透明质酸的分离和纯化，得到 含有透明质酸的苹果酸钠溶液； （4）超滤膜过滤浓缩，截留液真空干燥，制得透明质酸产品。第八章 脂类药物脂类药物：具有生理、药理效应的脂肪、类脂及其衍生物。脂类药物制备的一般方法 （一）直接抽提法 适用于游离形式脂类，卵磷脂、脑磷脂、前列腺素等；（二）水解法 适用于胆固醇；有些脂类药物与其它成分结合在一起构成复合物，因此需要先水解，使脂类药物与其它组份分离开，然后再进行分离纯化。（三）化学合成或半合成法 辅酶Q10的化学合成、熊去氧胆酸的半合成：（四）生物转化法 微生物转化法（发酵法）、酶转化法及动植物细胞培养法；微生物发酵法合成辅酶Q10； 酶转化法合成前列腺素；卵磷脂的提取卵磷脂为游离形式，可采用直接抽提法：利用其易溶于乙醇、乙醚，不溶于丙酮的性质，可将卵磷脂与其它脂类及杂质分离。卵磷脂：易溶于乙醇、不溶于丙酮；脑磷脂：微溶于乙醇，不溶于丙酮；胆固醇：易溶于丙酮；以脑干为原料de制备工艺工艺路线：卵磷脂