农药兽药与霉菌毒素残留量的测定ppt课件

第十四章 农药、兽药与霉菌毒素残留量的测定,主要内容,食品中农药残留量的常规测定方法 食品中农药残留的快速检测方法 食品中兽药残留检测方法 霉菌毒素残留分析,第一节.食品中农药残留量的常规测定方法,一、概述：农药残留是指由于存留在农产品、或食品药材等产品中的农药及其降解代谢产物, 还包括环境背景中存有的农药污染物或持久性农药的残留物再次在产品中形成的残留。一般来说, 农药残留量是指农药本体及其代谢物的残留量的总和, 表示单位为mg/kg。,1.色谱技术 1）薄层色谱法（TLC) 2）纸色谱 3）气相色谱法（GC） 4）高效液相色谱法（HPLC） 5）色质联用技术 2.电化学方法,二、食品中有机氯农药残留量的测定,一）气相色谱法（GB5009.19-2003） 操作方法 （1）提取 粮食：称取样品石油醚提取过滤到分液漏斗定至约100ml 蔬菜：称取样品捣碎取匀浆丙酮提取过滤到分液漏斗石油醚提取加硫酸钠溶液分离石油醚层过滤至分液漏斗定至约100ml 肉类及动物组织：称取绞碎样品加硫酸钠研磨加石油醚提取浓缩至约100ml,3）测定 样品测定,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,一、有机磷农药的结构与性质 有机磷农药是指在组成上含有磷的有机杀虫剂、杀菌剂等。主要类型有：磷酸酯型，如久效磷、磷胺等；二硫代磷酸酯型，如马拉硫磷、乐果、甲拌磷、亚胺硫磷等；硫酮磷酸酯型，如对硫磷、甲基对硫磷、内吸磷、杀螟松等；硫醇磷酸酯型，如氧化乐果、伏地松；磷酰胺型，如甲胺磷、乙酰甲胺磷；膦酸酯型，如敌百虫、苯脯磷,有机磷农药种类很多，按毒性分为高毒（剧毒）、中毒、低毒三类； 溶解性：多数难溶于水，可溶于有机溶剂 水解性：在碱性介质中易水解 氧化性：硫代磷酸酯类在溴、紫外线等作用下其中的S可被O取代。 酶抑制活性：可抑制羧酸酯酶、胆碱酯酶的活性,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 1.水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定方法 本标准规定了水果、蔬菜、谷类中敌敌畏、速灭磷、久效磷、甲拌磷、巴胺磷、二嗪农、乙嘧硫磷、甲基嘧啶硫磷、甲基对硫磷、稻瘟净、水胺硫磷、氧化喹硫磷、稻丰散、甲喹硫磷、克线磷、乙硫磷、乐果、喹硫磷、对硫磷、杀螟硫磷的残留量分析方法。 1.1原理 样品经提取、净化后注入气相色谱仪测定。 含有机磷的样品在富氢焰上燃烧，以HPO*碎片的形式，放射出波长526nm的特征光；这种光通过滤光片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号，经微电流放大器放大后被记录下来。样品的峰面积或峰高与标准品的峰面积或峰高进行比较定量。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 1.水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定方法 1.2 试剂、仪器 1.3试样的制备 取粮食样品经粉碎机粉碎，过20目筛制成粮食试样；取水果、蔬菜样品洗净，晾干，去掉非可食部分后制成待分析试样。 1.4 分析步骤 1.4.1提取 水果、蔬菜 称取50.00g试样，置于300mL烧杯中，加入50mL水和100mL丙酮(提取液总体积为150mL)，用组织捣碎机提取12min。匀浆液经铺有二层滤纸和约10gCelite545的布氏漏斗减压抽滤。从滤液中分取100mL移至500mL分液漏斗中。 谷物 称取25.00g试样，置于300mL烧杯中，加入50mL水和100mL丙酮，以下步骤同上。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 1.水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定方法 1.4 分析步骤 1.4.2净化 向滤液中加入1015g氯化钠使溶液处于饱和状态。猛烈振摇23min，静置10min，使丙酮从水相中盐析出来，水相用50mL二氯甲烷振摇2min，再静置分层。 将丙酮与二氯甲烷提取液合并，经装有2030g无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水滤入250mL圆底烧瓶中，再以约40mL二氯甲烷分数次洗涤容器和无水硫酸钠。洗涤液也并入烧瓶中，用旋转蒸发器浓缩至约2mL，浓缩液定量转移至525mL容量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 1.水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定方法 1.4 分析步骤 1.4.3 气相色谱测定 色谱参考条件 色谱柱: a.玻璃柱2.6m3mm(i.d)，填装涂有 4.5%(m/m)DC2002.5%(m/m)OV-17的 ChromosorbW/AW/DMCS(80100目)的担体。 b.玻璃柱2.6m3mm(i.d)，填装涂有1.5%(m/m)DCOE-1的ChromosorbW/AWDMCS(6080目)。 气体速度氮气(N2)50mL/min、氢气(H2)100mL/min、空气50mL/min。 温度：柱箱240、汽化室260、检测器270。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 1.水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定方法 1.4 分析步骤 1.4.4测定 吸取25L混合标准液及样品净化液注入色谱仪中，以保留时间定性。以试样的峰高或峰面积与标准比较定量。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 2.粮、菜、油中有机磷农药残留量测定方法 本标准规定了粮、菜、油等食品中敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲拌磷、稻瘟净、杀螟硫磷、倍硫磷、虫螨磷的测定方法。 原理、试剂、仪器同1.水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定方法 分析步骤 2.1 提取与净化 蔬菜：将蔬菜切碎混匀。称取10.00g混匀的样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30100g无水硫酸钠(根据蔬菜含水量)脱水，加0.20.8g活性炭(根据蔬菜色素含量)脱色。加70mL二氯甲烷，在振荡器上振摇0.5h，经滤纸过滤。量取35mL滤液，在通风柜中室温下自然挥至近干，用二氯甲烷少量多次研洗残渣，移入10mL(或5mL)具塞刻度试管中，并定容至2.0mL，备用。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 2.粮、菜、油中有机磷农药残留量测定方法 分析步骤 2.1 提取与净化,稻谷：脱壳、磨粉、过20目筛、混匀。称取10.00g，置于具塞锥形瓶中，加入0.5g中性氧化铝及20mL二氯甲烷，振摇0.5h，过滤，滤液直接进样。如农药残留量过低，则加30mL二氯甲烷，振摇过滤，量取15mL滤液浓缩并定容至2.0mL进样。 小麦、玉米：将样品磨碎过20目筛、混匀。称取10.00g置于具塞锥形瓶中，加入0.5g中性氧化铝、0.2g活性炭及20mL二氯甲烷，振摇0.5h，过滤，滤液直接进样。如农药残留量过低，则加30mL二氯甲烷，振摇过滤，量取15mL滤液浓缩，并定容至2mL进样。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 2.粮、菜、油中有机磷农药残留量测定方法 分析步骤 2.1 提取与净化,植物油,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 2.粮、菜、油中有机磷农药残留量测定方法 分析步骤,2.2气相色谱测定 色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长1.52.0m。 分离测定敌敌畏、乐果、马拉硫磷和对硫磷的色谱柱。a.内装涂以2.5%(m/m)SE-30和3%(m/m)QF-混合固定液的6080目Chromosorb W AW DMCS。b.内装涂以1.5%(m/m)OV-7和2%(m/m)QF-1混合固定液的6080目Chromosorb W AW DMCS。c.或内装涂以2%(m/m)OV-101和2%(m/m)QF-混合固定液的6080目Chromosorb W AW DMCS。 分离测定甲拌磷、虫螨磷、稻瘟净、倍硫磷和杀螟硫磷的色谱柱。a.内装涂以3%(m/m)PE-GA和5%(m/m)QF-1混合固定液的6080目ChromosorbWAWDMCS。b.内装涂以2%(m/m)NPGA和3% (m/m) QF-1混合固定液的6080目ChromosorbWAWDMCS。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 2.粮、菜、油中有机磷农药残留量测定方法 分析步骤,2.2气相色谱测定,气流速度：载气为氮气80mL/min；空气50mL/min；氢气180mL/min(氮气、空气和氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件)。 温度：进样口为220；检测器为240；柱温为180，(测定敌敌畏为130),第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 2.粮、菜、油中有机磷农药残留量测定方法 分析步骤,2. 2气相色谱测定,将混合农药标准使用液25L分别注入气相色谱仪中，可测得不同浓度有机磷标准溶液的峰高。分别绘制有机磷标准曲线。同时取样品溶液25L注入气相色谱仪中，测得的峰高从标准曲线图中查出相应的含量。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 3.肉类、鱼类中有机磷农药残留量的测定方法 本标准适用于肉类、鱼类中敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷农药的残留分析。敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷最低检出量为0.6，0.3，0.3，0.15ng，当进样量相当于0.002g时，最低检出浓度分别为0.03，0.015，0.015，0.008mg/kg。 原理、试剂、仪器 同前。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 3.肉类、鱼类中有机磷农药残留量的测定方法 分析步骤 提取净化：将有代表性的肉、鱼样品切碎混匀，称取20.00g于250mL具塞锥瓶中，加60mL丙酮，于振荡器上振摇0.5h，经滤纸过滤，取滤液30mL于125mL分液漏斗中，加60mL硫酸钠溶液(20g/L)和30mL二氯甲烷，振摇提取2min后，静置分层，将下层提取液放入另一个125mL分液漏斗中，再用20mL二氯甲烷于丙酮水溶液中同样提取后，合并二次提取液，在二氯甲烷提取液中加1g中性氧化铝(如为鱼肉加5.5g)，轻摇数次，加20g无水硫酸钠。振摇脱水，过滤于蒸发皿中，用20mL二氯甲烷分二次洗涤分液漏斗，倒入蒸发皿中，在55水浴上蒸发浓缩至1mL左右，用丙酮少量多次将残液洗入具塞刻度小试管中，定容至25mL，如溶液含少量水，可在蒸发皿中加少量无水硫酸钠后，再用丙酮洗入具塞刻度小试管中，定容。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 3.肉类、鱼类中有机磷农药残留量的测定方法 分析步骤 色谱条件 色谱柱：内径3.2mm，长1.6m玻璃柱，内装涂以OV-17(1.5%m/m)和QF-1(2%m/m)的混合固定液的80100目Chromosorb W A W DMCS。 流量：氮气60mL/min；氢气0.7kg/cm2；空气0.5kg/cm2。 温度：检测器250，进样口250，柱温220(测定敌敌畏时为190)。如同时测定四种农药可用程序升温。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （一）气相色谱法（GB5009.20-2003） 3.肉类、鱼类中有机磷农药残留量的测定方法 分析步骤 测定：将标准使用液或样品液进样13，以保留时间定性；测量峰高，与标准比较进行定量。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （二）气相色谱法【GB/T 5009.145-2003】食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定 本标准规定了粮食、蔬菜中敌敌畏、乙酰甲胺磷、甲基内吸磷、甲拌磷、久效磷、乐果、甲基对硫磷、马拉氧磷、毒死蜱、虫螨磷、倍硫磷、马拉硫磷、对硫磷、杀扑磷、克线磷、乙硫磷、速灭威、异丙威、仲丁威、甲萘威等农药残留量的测定方法。 1.原理 样品中有机磷和氨基甲酸酯农药用有机溶剂提取，再经液液分配、微型柱净化等步骤除去干扰物质，用氮磷检测器(FTD)检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （二）气相色谱法【GB/T 5009.145-2003】食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定 2.分析步骤 2.1试样的制备 取粮食样品以粉碎机粉碎，过20目筛制成粮食试样。蔬菜擦去表层泥水，取可食部分匀浆制成分析试样。 2.2提取 (1)蔬菜 方法一：称取10g试样于三角瓶中，加入与样品含水量之和为10g的水和20mL丙酮。振荡30min，抽滤，取20mL滤液于分液漏斗中。 方法二：称取5g试样(视样品中农药残留量而定)，置于50mL离心管中，加入与样品含水量之和为5g的水和10mL丙酮。置于超声波清洗器中，超声提取10min。在5000r/min离心转速下离心使蔬菜沉降，用移液管吸出上清液10mL至分液漏斗中。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （二）气相色谱法【GB/T 5009.145-2003】食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定 2.分析步骤 2.2提取 (2) 粮食 称取20g样品于三角瓶中，加入5g无水硫酸钠和100mL丙酮，振荡提取30min，过滤后取50mL滤液于分液漏斗中。 2.3净化 向方法一分液漏斗中分别加入40mL凝结液和1g助滤剂celite545，或方法二的分液漏斗中分别加入20mL凝结液和1g助滤剂celite 545，轻摇后放置5min，经两层滤纸的布氏漏斗抽滤，并用少量凝结液洗涤分液漏斗和布氏漏斗。将滤液转移至分液漏斗中，加入3g氯化钠，依次用50，50，30mL二氯甲烷提取，合并三次二氯甲烷提取液，经无水硫酸钠漏斗过滤至浓缩瓶中，在35水浴的旋转蒸发仪上浓缩至少量，用氮气吹干。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （二）气相色谱法【GB/T 5009.145-2003】食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定 2.分析步骤 2.2提取 2.3净化 取下浓缩瓶，加入少量正己烷。以少许棉花塞住5mL医用注射器出口，1g硅胶以正己烷湿法装柱，敲实，将浓缩瓶中液体倒入，再以少量正己烷：二氯甲烷(9+1)洗涤浓缩瓶，倒入柱中。依次以4mL正己烷：丙酮(7+3)，4mL乙酸乙酯，8mL丙酮：乙酸乙酯(1+1)，4mL丙酮:甲醇(1+1)洗柱，汇集全部滤液经旋转蒸发仪45水浴浓缩近干，定容至1mL。 向粮食提取的分液漏斗中加入50mL5%氯化钠溶液，再以50mL，50mL，30mL二氯甲烷提取三次，合并二氯甲烷层经无水硫酸钠过滤后，在旋转蒸发仪40水浴上浓缩近干，定容至1mL。,第四节 食品中有机磷农药残留量测定,二、测定方法 （二）气相色谱法【GB/T 5009.145-2003】食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定 2.分析步骤 2.4测定 (1)气相色谱参考条件 色谱柱：BP5或OV-101 25m0.32mm(内径)石英弹性毛细管柱。 气体流速：氮气50mL/min；尾吹气(氮气) 30mL/min；氢气 0.5kg/cm2；空气 0.3kg/cm2 温度：柱温采用程序升温方式 检测器：氮磷检测器(FTD)。 (2)色谱分析 量取1L混合标准溶液及样品净化液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标准比较定量。,2 有机磷农药残留量的测定,2.1 定性检验刚果红法和纸上斑点法 2.1.1 刚果红法 2.1.1.1 原理 利用样液中的有机磷农药经溴氧化后，与刚果红作用，生成蓝色化合物，来鉴别样品是否存在有有机磷农药。,2.1.1.2 操作步骤 取经粉碎的样品用苯浸泡、振摇，用滤纸过滤，取滤液于蒸发皿上，加入100gL甘油甲醇溶液1滴，沥干，加1mL水混匀。将样液滴于定性滤纸上，挥发干。将滤纸置于溴蒸气上熏5min，取出，在通气处将溴挥发尽。滴人5gL刚果红乙醇溶液，置于滤纸的点样处，如果滤纸显示出蓝紫色则表示样品中有有机磷存在。呈粉红色者则为溴的色泽。,2.1.2 纸上斑点法,2.1 .2.1原理 样液中的硫代磷酸酯类有机磷与2，6一二溴苯醌氯酰亚胺，在溴蒸气作用下，形成各种有颜色的化合物，用以鉴定是否存在有机磷及是哪一种有机磷。 2.1.2.2操作步骤 (1)2，6一二溴苯醌氯酰亚胺试纸 称取005g 2，6一二溴苯醌氯酰亚胺，溶于10mL95 %(体积分数)乙醇中，将定性滤纸浸湿，晾干备用。 (2)检验 吸取按刚果红法制备的样液滴，于2，6一二溴苯醌氯酰亚胺试纸上，稍干，置于溴蒸气上蒸熏片刻，呈现出不同颜色的斑点，根据所显示斑点的颜色鉴别属于哪种有机磷农药。试验时，为防止色素干扰，试纸要临时配制。有机磷农药呈色反应如表6-1所示。,表6一l 有机磷农药的呈色反应,2.2 有机磷农药残留量的定量检测,2.2.1原理 气相色谱法将样品的峰高或峰面积与标准品相比较做定量分析。本法适用于水果、蔬菜、谷类的检测。最低检出量为0.10.25ng, 2.2.2仪器和试剂 (1)仪器 组织捣碎机，粉碎机，旋转蒸发器，气相色谱仪：附有火焰光度检测器(FPD)。 (2)试剂 丙酮，二氯甲烷，助滤剂Celiee545， 农药标准品：敌敌畏99，速灭磷顺式60% ,久效磷99 %，甲拌磷98，巴胺磷99，二嗪农98.,2.2.3 操作步骤,(1)标准溶液的配制 分别准确称取标准品，用二氯甲烷为溶剂，分别配制成1.0mgmL的标准储备液，储于冰箱(4)中。使用时用二氯甲烷分别稀释成1.0ugmL的标准使用液。 (2)试样制备 取粮食样品粉碎，过20目筛制成粮食试样；取水果、蔬菜样品洗净，晾干，去掉非可食部分后制成待测试样。 (3)提取 称取50.00g水果、蔬菜试样，置于300mL烧杯中，加入50mL水和100mL丙酮(总体积150mL)。用组织捣碎机捣12min。匀浆液经铺有两层滤纸和约10g Cellte545的布氏漏斗，减压抽滤。从滤液中分取l00mL，移至500mL分液漏斗中。,称取25.00g谷物试样，置于300mL烧杯中，加入 50mL水和100mL丙酮，以下同上一步骤。 (4)净化 向以上两种滤液中，加人1015g氯化钠，使呈 饱和状态。猛烈振摇23min，静置10min，使丙酮从 水相中盐析出来，水相用50mL二氯甲烷振摇2min，再 静置分层。将丙酮与二氯甲烷提取液合并，并经装有 2030g无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水，滤人250mL圆底 烧瓶中。再以约40mL二氯甲烷分数次洗涤容器和无水 硫酸钠，洗涤液也并入烧瓶中。用旋转蒸发器浓缩至 约2mL，浓缩液定量转移至525mL容量瓶中，加二 氯甲烷定容至刻度。,测定有机磷农药 的残留量,气相色谱条件 色谱柱：a玻璃柱2.6m3mm，填装涂有4.5 %(质量分数)DC200+2.5(质量分数)OV-17的ChromosorbWAW DMCS(80100目)的担体。b玻璃柱2.6m3mm(id)，填装涂有1.5%(质量分数)DCOE-1的Chromosorb WAW I)MCS(6080目)。 气体速度：氮气(N2)50mLmin、氢气(H2)100mLmin、空气50mLmin。 温度：柱温240，汽化室260，检测器270。 测定：吸取25uL混合标准液及样品净化液，色谱仪中，以保留时间定性。以试样的峰高或峰面积与标准比较定量。,结 果 计 算,Xi=,式中 xi i组分有机磷农药的含量，mgkg Ai试样中i组分的峰面积，积分单位 Asi 混合标准液中i组分的峰面积，积分单位 V1 试样提取液的总体积，mL V2 净化用提取液的总体积，mL V3 浓缩后的定容体积，mL V4进样体积，mL Esi进入色谱仪中的i标准组分的质量，ng m样品的质量，g,2.食品中农药残留的快速检测方法,1.有机磷类、氨基甲酸酯类农药残留快速测定方法（速测卡法） 原理：胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。,仪器与试剂,天平；恒温装置；固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡） ；pH7.5缓冲溶液：分别取15.0g磷酸氢二钠 Na2HPO412H2O与1.59g无水磷酸二氢钾KH2 PO4 ，用500mL蒸馏水溶解。,测定,整体测定法 5.1.1选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，震摇50次，静置2min以上。 5.1.2取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。 5.1.3将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合反应。 5.1.4每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。 5.2表面测定法（粗筛法） 5.2.1擦去蔬菜表面泥土，滴23滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。 5.2.2 取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。 5.2.3 放置10min以上进行预反应，有条件时在37恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。 5.2.4 将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合反应。 5.2.5 每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。,氨基甲酸酯类、有机磷类农药残留快速测定方法,原理 在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。,试剂 pH8.0缓冲溶液：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。 显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4 C冰箱中保存。 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4冰箱中保存备用。保存期不超过两周。 乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3 min的吸光度变化D A0值应控制在0. 3以上。摇匀后置4冰箱中保存备用，保存期不超过四天。 可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的D A0值应控制在0. 3以上。 仪器 分光光度计或相应测定仪及常量天平。,测定步骤,样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡12min，倒出提取液，静置35min，待用。 对照溶液测试： 先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37 C放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度变化值DA0。 样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值DAt。,结果计算 检测结果按公式计算：抑制率(%)= (DA0-DAt)/ DA0100 式中：DA0 棗对照溶液反应3min吸光度的变化值； DAt 棗样品溶液反应3min吸光度的变化值； 结果判定 结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。当蔬菜样品提取液对酶的抑制率50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。对阳性结果的样品，可用其它方法进一步确定具体农药品种和含量。,3.食品中兽药残留检测方法,兽药残留的种类与危害 典型的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是, 随着集约化养殖生产的开展, 一些化学的、生物的药用成分被开发成具有某些功效的动物保健品或饲料添加剂, 也属于兽药的范畴。兽药的主要用途有防病治病、促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质等。兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。兽药最高残留限量（MRLVD）是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位 g/kg, 以鲜重计）。 兽药残留主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的,另外,休药期(是指自停止给药到动物获准屠宰或其动物性产品获准上市的间隔时间)过短, 是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。,抗生素类药物残留简介,在世界以及我国的农产品及食品进出口贸易中，涉及需检测的抗生素残留常常有以下六类： （1） -内酰胺类：青霉素、头孢霉素（先锋霉素）、头孢噻呋、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素（阿莫西林）、邻氨青霉素、苯唑青霉素等。 （2） 磺胺类：磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶等。 （3） 四环素类：四环素、金霉素、土霉素、强力霉素（脱氧土霉素）等。 （4） 氨基糖苷类：庆大霉素、新霉素、链霉素、二氢链霉素等。 （5） 大环内脂类：红霉素、泰乐霉素、林可霉素等。 （6） 氯霉素类：氯霉素、甲砜（氯）霉素、氟砜尼克（氟甲砜氯霉素）等。 1、内酰胺类（lactams）,内酰胺类抗生素族包括了种类繁多的天然和半合成化合物，所有的这些物质都含有基本的具有抗生素活性的内酰胺环。内酰胺类抗生素（青霉素和头孢菌素类）主要用于抗革揽氏阳性细菌感染。青霉素和头孢菌素类的结构在药理性书中都能查到。然而，这类药物中部分也能抑制革兰氏阴性菌。至今已有9类内酰胺类抗生素被人可。尽管仅有少数的这类化合物被用来治疗养殖动物，这就有可能以残留物形式出现在食品中。 在美国，批准使用在食用动物上的内酰胺类有：阿莫西林、氨苄青霉素、头孢噻呋、头孢吡硫、邻氯青霉素和青霉素G。许多其他的内酰胺类在别的国家使用。根据美国食品和药物管理局在1996年11月7日的联邦注册上颁布的新规定，1944动物医用药物使用说明法的条款下其他内酰胺类抗生素在标签范围外得失用也是可能的。青霉素G因其价廉和广谱，尽管它对革兰氏阳性菌有效，仍被广泛地用于治疗养殖动物，并频繁地超表示剂量使用。在牛养殖场青霉素G被频繁地用于牛的肌肉或皮下注射，有时使用的剂量超出推荐量的几倍。肌注治疗导致的残留物，可在注射部位残存很长时间（达到50天），在其他组织中的残留也要经过较长时间才不致被检出。青霉素G也可使用乳房内输注法治疗奶牛的乳房炎，可导致在治疗后几天内牛奶中都含有高浓度的残留物。 邻氯青霉素是一种内酰胺酶的半合成青霉素，在抗葡萄球菌方面比青霉素G更有效。氨苄青霉素和阿莫西林也是半合成青霉素，对很多细菌有广谱效应。 用作兽药的两种头孢均素是头孢吡硫和头孢噻呋。头孢噻呋是最新介绍的一种头孢菌素，被用来治疗牛的呼吸道感染，也用于肌注治疗乳房炎，据报道牛奶中几乎检不出其残留物。然而不适当的乳房输注会导致在牛奶中的大量残留。 内酰胺类药物本身对机体没有很强的毒性，但是青霉素类会使一些敏感个体产生十分剧烈的过敏反应。对于此类药物的最大残留量或允许值很多国家都有严格的规定（见EU和FDA的限定值表）。当食品中抗生素残留的总体发生率较低时，内酰胺类抗生素是牛奶和组织中捡出残留报道最多的典型。,2、氨基糖苷类（aminoglyconsides） 氨基糖苷类是一类在其糖苷结构中含有一个或一个以上氨基的碳水化合物。“氨基糖苷类抗生素”一词，通常是指半个氨基糖苷以一个糖苷键与一个氨基环多醇（一个氨基取代的羟基环己烷）相连接的一类化合物。链霉素、庆大霉素和新霉素是最常用于食用性动物的氨基糖苷类抗生素。链霉素是继青霉素之后推广使用的第二种抗生素，它对革兰氏阴性和阳性菌均有效，二氢链霉素是链霉素催化加氢产生的。氨基糖苷类抗生素有着相似的抗菌特性，它们抑制细菌30s核糖体亚基的蛋白质合成，它们是对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有毒性的广谱抗生素。氨基糖苷类抗生素不仅用于治疗牲畜的各种感染，并且以亚剂量给药方式预防疾病和提高饲料利用率。这些药物经口服在肠道不太吸收，大约有9597的口服药可在粪便中检出。口服给药方式用于治疗肠功能紊乱。经肌肉注射，它们很容易被吸收，排泄方式主要通过肾脏以母体化合物形式排出。药物在肾脏浓缩而不是在肝脏。 由于已发现氨基糖苷类抗生素损害颅神经，引起失聪和损害肝脏，因此在食品中的残留量异常引起关注。药品残留物对动物组织有很强的亲和力，给动物用药很多天后，其产品中仍可检出药物。因此给药后的动物在宰杀前应隔相当长一段停药时间和弃奶期。 氨基糖苷类是广谱抗菌药，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及耐酸菌都有效，历史上被用在水产养殖中，用于治疗鱼类疾病。卡那霉素就是初期的一个典型。像新霉素、链霉素及庆大霉素等氨基糖苷类也已被用于治疗鱼疾病。通常该类化学药物较难通过肠道吸收，因此其使用受到限制。,3、氯霉素类（amphenicols） 氯霉素是一类1苯基2氨基1丙醇的二乙酰胺衍生物。这类独特的抗生素通常由以下三种化合物组成：氯霉素（CAP），甲砜（氯）霉素（THA），氟甲砜（氯）霉素（FLR）.上述三种抗生素都具有共同的主链架，它们均被称为“苯醇类”。由于氯霉素在用于治疗人类疾病时，其众所周知的队人体的副作用（如再生障碍性贫血、再生不良性贫血症、粒性白血球减少、舌炎、口腔炎等），因此在美国和加拿大立法规定不允许将氯霉素用于食用动物和鱼类养殖中。在1996年，为治疗牛的呼吸系统疾病（BRD），批准了由有执照的兽医或按其医嘱对牛有限地使用FLR。一些国家允许它们使用，但仍保持严格控制。食用动物接触这些药物，无论是通过非法或不正确地使用非处方（OTC）药品，还是跨标签范围用药及/或不遵守适当的停药时间，都会导致在食品中存在超过最大残留水平（MRL）的残留物，这将影响到人类健康。关于动物性食品中CAP，THA和FLR的残留问题，导致必须加强对动物产品和水产养殖品的检测。,4、四环素（tetracylines） 四环素抗生素类，包括金霉素、土霉素和四环素等，广泛应用于食用动物和海洋生物的养殖中，土霉素和金霉素被添加到饲料中以促进生长、预防疾病及治疗某些疾病。用于口服治疗和注射的兽药制剂是相对较纯的物质。尽管饲料添加剂预混物有相当强的药效，但由于混合物中存在四环素产生菌（如曲霉属的菌种）生长，所以发酵过程可产生不只一种四环素，这些产品可含有少量的其他四环素类物质。 在家禽、猪、牛等主要品种的食用动物和绵羊、山羊等次要品种食用动物及水生动物的饲养中，四环素类用于提高产奶动物的产奶量及预防蜜蜂的感染性疾病。在过去30多年的时间里，四环素类一度是动物农业许多方面的主要支柱性药物。 四环素类是常用于水产养殖的一类广谱抗菌药。在20世纪50年代，人们就意识到土霉素（OTC）在治疗鱼类疾病中的益处。此后该药在水产品水产品养殖中广泛用于抗菌治疗。1970年，土霉素是第一种被FDA批准在美国用于有鳍鱼类水产品养殖的抗菌素，并已证明该药用于甲壳类水产养殖业也是有益的。在美国，土霉素被批准用在龙虾存贮场所中。某些其他四环素类药物也被用于治疗多种鱼类疾病。 在养峰业中使用土霉素是一种预防措施，借此控制由某种芽孢引起的美国箱腐病和由某种链球菌引起的欧洲箱腐病的传播，与其他检测不同，蜂蜜中含有自然生成的易被误认为是土霉素残留的抗生性物质，给四环素类在蜂蜜中的检测带来一定困扰。,5、大环内脂类（macrolides） 大环内脂类抗菌素是由联络一个或多个糖的多内脂环组成。一般是弱碱性，几乎是不溶于水。大环内脂类物质是从链霉菌中分离出来的，对革兰氏阳性菌及李斯特氏菌和支原体的某些菌株效果最好。红霉素（Er）和泰乐霉素（Ty）是最常用于食用性动物的大环内脂类抗菌素。红霉素用以控制几种食用动物中因易感细菌引起的感染。红霉素还可以作为注射用药，治疗牛呼吸道疾病；该药另一种治疗应用是治疗乳腺炎，并有针对非产奶期和产奶期的配方。红霉素的硫氰酸盐可添加在鸡、火鸡和猪的饲料中以增加质量和提高饲养效率。 大环内脂类和林可酰胺类药物对人体潜在的毒副作用同其他抗菌素相似。 6、磺胺类（sulfonamides） 磺胺类药物是磺胺的衍生物。1935年发现了一种含有发色团的磺胺类化合物即偶氮磺胺，它显示出具有抗菌活性。从首次发现起磺胺类药物就被广泛用于人类和动物。 磺胺类和二氨基嘧啶类药物均作为预防与治疗用药广泛地用于食用动物中，它们的用药方式是加药饲料、水添加剂、丸剂或针剂。磺胺类药物根据其应用情况可分为三类：即用于全身感染的磺胺药（如磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶）、用于肠道感染内服难吸收的磺胺药和用于局部的磺胺药（如磺胺醋酰）。在治疗慢性感染方面，历史上还曾将较低剂量的磺胺类药物预防性地使用以提高饲养效率。目前这方面的应用已受到限制。 磺胺类药物的副作用有过敏反应、尿和造血紊乱。磺胺二甲嘧啶还表现出可能使小鼠致癌。因此各国普遍反对将此类药物用于人和动物，且这是限制其在普通供给食物中残留的一个令人信服的原因。,4.霉菌毒素残留分析,概述 真菌毒素是毒性霉菌代谢产物，存在各种各样的五谷、饲料、食物和饮料中，一些化合物可引起人类和动物严重的健康问题。真菌毒素在生产，处理，运输或者存贮期间可侵入食物、饲料中。泰乐祺检测实验室能检测出超过20种的真菌毒素像黄曲霉毒素、伏马毒素，赫曲霉素和呕吐毒素等。,操作步骤 1从受污染区取样 测定霉菌或霉菌毒素污染，需要采用与正常情况不同的样品采集步骤。因为霉菌生长变异性大，所以，必须采集大量样品并取那些最可能受污染区域的样品。 2多点采样 样品量依赖于所测定霉菌毒素的水平。霉菌毒素水平越高，样品量越小。由于往往测定的是毒素，故此必须收集几份样品。 3做好采样记录 取样者必须熟悉样品加工工艺，采集具有代表性的样品。认识到取样影响测试结果的重要性。记录当时操作步骤，并附报告1份。 4注意变异 霉菌和霉菌毒素测定的最大问题之一是其变异性。霉菌孢子不是平均分布在谷物和饲料中，只要条件适合，将大量繁殖。例如，谷仓内渗水或漏雨，造成霉变的可能性变大。因此，必要时应多次、多点采样。 5留足分析样品 建议采集谷物样品必须使用探子或采样器，收集不同点的样品。样品必须全部通过084mm孔筛。使用沉降分离器或类似仪器来筛选小量样品，用于分析。样品必须保留， 以防再次分析。基于上述原因，全价饲料每批必须采集至少0.907kg。如果使用采集器收集样品，则必须将各批号样品混合，以便混合成一个具有代表全部批号的样品。 6添加防霉剂时的采样 防霉剂在谷物或饲料中的分布非常关键。因为，防霉剂必须与饲料颗粒接触才能发挥效应。所以，必须对每批谷物或饲料从不同位置采样10份，每份不少于0.45kg。 7采样点 采集大量样品的最佳办法是直接在装卸时取样，中间的样品可以用取样器或探子从仓库、进料车直接取样。无论何时，来源采集样品应该具有代表性，且探子形状必须随着容器的类型而变化。,霉菌毒素检测,一、 薄层层析法： TLC法是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。TLC法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，在展开时影响斑点的荧光强度。 二、色谱法： 色谱法，包括薄层色谱、气相色谱、