细胞传代和活性检测.ppt

细胞传代培养及培养细胞的活性鉴定,实验要求,掌握细胞传代培养过程中，细胞消化液的配制及细胞消化方法，对传代培养的细胞进行活性鉴定。,实验原理,细胞在培养瓶长成致密单层后，会产生接触抑制，为使细胞能继续生长，并将培养细胞数量扩大，就必须进行传代再培养。,传代培养 是一种将细胞保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 悬浮型细胞直接分瓶就可以; 贴壁细胞需经消化后才能分瓶。以单层细胞方式生长的细胞分泌细胞外基质和粘附蛋白以附着于生长表面。 经典的细胞传代和收集方法为采用胰蛋白酶处理细胞。胰蛋白酶是一种能够破坏基质和粘附蛋白的蛋白水解酶。对培养细胞进行传代时还可添加二价离子螯合剂如EDTA， 钙离子、镁离子的螯合可使细胞从基底层和细胞间分离开，多数细胞传代消化仍需要可用胰蛋白酶加入EDTA共同进行消化。 一般细胞系需要的胰蛋白酶浓度为0.25%+0.02%的EDTA,细胞活性测定 细胞活性测定的方法较多，如染料排斥法、FDA-PI双色荧光检测法和MTT检测法等都是常用的方法。 一、染料排斥法：是利用细胞损伤或死亡时，某些染料如台盼蓝、伊红Y、苯胺黑等可穿透变性的细胞膜，而活细胞的选择透性能阻止这类染料进入细胞。,二、FDA-PI双色荧光检测法：利用FDA(Fluorescein Diacetate，双醋酸荧光素)能被活体细胞所吸收，掺入活细胞后，在细胞内醋酸酯酶等作用下，释放出荧光素，在蓝色光激发下发射出黄绿色的荧光来，细胞活性越高，则酶活性越高，黄绿色荧光越强；PI(Propidiumlodide，碘化丙啶)只能进入有缺损的膜或固定的死亡细胞，在蓝色光激发下发射出桔红色的荧光。,三、MTT法：是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能使外源性噻唑蓝(MTT)还原为水不溶性的蓝紫色结晶一甲臢(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。甲臢经二甲基亚砜(DMSO)溶解后，在波长490nm处测定其光吸收值，其值可间接反映细胞的活性状态以及活性细胞的数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。,实验器材及试剂,1实验试剂：0.25胰酶、Tc-199或1640培养基（含10小牛血清），。 消化液配制方法：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1:250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液溶解，滤器过滤除菌，短期使用可在4保存，也可小瓶分装后冻存以备用，用前可在37下回温。胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02，0.4台盼蓝染,0.4台盼蓝染液：台盼蓝0.4g，溶于100ml Hanks液中。,FDA-PI配制： （1）0.65mol/L 甘露醇配制：称 1.1841g 甘露醇加入 10mL 蒸馏水。 （2）5mg/mL FDA 配制：称 25mgFDA 加入 1mL 丙酮溶解，再加 入 4mL 甘露醇，摇匀，避光 4保存。,3）2mg/mL PI 配制：称 2mgPI 加入 1mL 甘露醇，摇匀，4保存。 2仪器和器材：倒置及正置显微镜，荧光显微镜、培养箱、培养瓶、微量取液器、吸管、废液缸等,实验材料 体外培养细胞,实验方法 细胞传代方法： 1吸去培养单层细胞的细胞培养瓶或培养皿中的培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 2加人0.25%胰蛋白酶工作液(25ml细胞培养瓶加入1ml)，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3快速地前后旋转细胞培养瓶45次以使瓶内所有细胞能接触到胰蛋白酶。将细胞培养瓶盖松松拧上后置37培养箱中消化25分钟。 4用手轻拍细胞培养瓶使得瓶内的少量液体能够带下已经要脱离瓶壁的细胞，放在倒置镜下观察细胞检查细胞脱落情况。 5若无细胞脱落将细胞培养瓶再放回37培养箱中孵育数分钟。继续轻拍细胞培养瓶直至细胞完全脱落，重悬细胞于细胞培养液内以终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化，吸除胰酶细胞消化液，根据细胞消化状态也可用D-Hanks液清洗一遍。,6加入含血清的完全细胞培养液，轻轻吹打细胞使得团状细胞分散，可进行细胞计数，以需要的细胞密度进行细胞传代培养。 7用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外2-3瓶中，旋好培养瓶盖，置37下继续培养。 细胞活性检测 8.将培养细胞制成单细胞悬液，取9滴细胞悬液移入离心管中，加一滴0.4台盼蓝染液，混匀，在3分钟内，滴加细胞染色液于洁净载片，加上盖片显微观察，计算细胞存活率。其中活细胞拒染色，而死细胞被染成淡蓝色，细胞存活率() = 活细胞总数/死活细胞总数。 9另吸取500l 细胞悬液于离心管中，分别各加入100lPI 和FDA并混匀，染色2-3分钟后，吸取染色细胞液于载片，加上盖片，打开荧光显微镜，蓝光激发下，观察细胞产生荧光现象。,FDA-PI 混合染色后，显示绿色的活细胞及桔红色的死细胞,死细胞,活细胞,实验注意事项： 1在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被污染。 2胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加或减少胰酶用量。不同的细胞消化时间有所不同，否则细胞贴壁生长状况会较差。 3. 如