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PCR方法简介,王媛媛,PCR概念,PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），是利用单链寡核苷酸引物对特定DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。,PCR原理,PCR反应类似于DNA的天然复制过程，由三个循环的步骤构成： 模板DNA的变性 模板DNA与引物的退火(复性) 引物的延伸,PCR原理图解,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变性,引物退火,DNA 延伸,PCR反应体系,DNA模板 Primer 1 Primer 2 DNA聚合酶 dNTPs PCR buffer ddH2O,PCR体系对反应物的要求,引物 引物设计的一般原则 长度：一般2030nt，应大于16nt。 碱基分布：随机或均匀分布，避免嘌呤或嘧啶的连续排列。 碱基组成：GC含量在45%55%之间。 二级结构：应避免引物二聚体和发夹结构。 碱基配对：引物与模配对，3端完全配对，5端可不配对，故可设计酶切位点或其他需引进的序列。 3端碱基：最好不用A。,PCR体系对反应物的要求,引物浓度 引物浓度 引物浓度过高会增加扩增结果的非特异性，并且会形成二聚体 上下游引物的终浓度应该一致,PCR体系对反应物的要求,DNA聚合酶 常用的为从嗜热水生菌（Thermas aquaticus L.）中提取的DNA聚合酶，称Taq DNA聚合酶 95可保持活性 7075条件下可表现出最佳的生物活性，延伸速率在70时，6070nt/秒，每分钟大于3.5kb 具体使用时，作为一个普遍规律，每扩增1kb，可用1分钟延伸时间 碱基错配率达210-4 7.210-5 酶浓度范围一般为14U/100l 酶量过多会导致非特异产物的增加,PCR体系对反应物的要求,PCR反应的缓冲液 Taq酶标准缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 50mmol/L KCl 1.5mmol/L MgCl2,PCR体系对反应物的要求,PCR反应的缓冲液 Mg2+ 浓度影响反应特异性和PCR产率。 Mg2+最佳反应浓度相当低（1.5mmol/L），浓度变化范围为110mM 模板制备过程中带来的螯合剂（如EDTA）和负电荷离子基团（如磷酸根（dNTP）会影响Mg2+的有效浓度。必要时，对Mg2+浓度进行优化。,PCR体系对反应物的要求,dNTPs 高浓度的dNTP会抑制聚合酶活性，而且会增加错误dNTP的掺入几率；浓度过低则会影响产物产量 四种dNTP的浓度应该一致,PCR反应条件的选择,94 4min 94 30s Tm-5 30s 72 1min/1kb 72 10min Tm=4(G+C) + 2(A+T),30cycles,RT-PCR,原理 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction: RT-PCR 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因,RT-PCR,原理图解,RT-PCR,反转录酶的选择 Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶，有强的聚合酶活性，最适作用温度为37 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性，最适作用温度为42,RT-PCR,合成cDNA引物的选择 Oligo(dT) 与mRNA分子3端的poly(A)互补 特异性强,仅mRNA可被转录 Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,此种引物合成的cDNA在数量和复杂性方面要小 难以得到3kb cDNA ,对某些RNA二级结构难以克服。,RT-PCR,合成cDNA引物的选择 随机六聚体的核苷酸 特异性差 克服反转录酶终止反应的序列。 通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA,RT-PCR,合成cDNA引物的选择 特异性寡核苷酸引物 特异性强,RACE,cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA ends ),3RACE原理,反转录：利用mRNA 的3末端天然的poly(A) 尾巴作为引物结合位点，以Oligo (dT) 和一个接头组成的接头引物(adaptor primer ,AP) 来反转录总RNA 得到加接头的cDNA 第一链。 第一PCR：然后用一个基因特异引物GSP1 (gene specific primer ， GSP) 和接头引物AP进行PCR反应。从而扩增位于已知序列区和poly(A) 尾之间的未知的3端mRNA 序列。 第二次PCR：防止非特异带的产生,可以用GSP2和AP为引物进行第二轮扩增(巢式PCR),5RACE原理,反转录：与3RACE原理类似，用一个反向的基因特异引物（GSP-RT)在反转录酶(reverse transcriptase ,RT) 作用下反转录得到cDNA第一链 加尾：再用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT) 给cDNA 的3末端进行同聚物加尾反应,从而在未知的cDNA 的5端加上一个poly(A)接头 PCR引物：然后再用基因特异引物GSP1和5端带有接头的接头引物AP-oligo(dT)进行第一轮PCR 反应 巢式PCR：再以基因特异引物GSP2和接头引物AP进行巢式PCR,从而扩增出mRNA未知的5端,RACE 技术的局限性,在5RACE 中有3 个连续的酶反应(反转录,TdT 加尾和PCR 扩增) ,每一步都可能导致失败; 即使酶反应顺利,也常产生大量的非特异或截短的产物背景,RACE的改进,SMART RACE Switching mechanism at 5 end of RNA transcript RACE,原理,SMART 5-RACE的原理是先是利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30 MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。 然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal Primer）作为上游引物，用一个基因特异引物2（Gene Specific