生物学]2DNA克隆技术.ppt

第二章 DNA克隆技术,1、克隆： 无性繁殖 一种无性繁殖技术。指由一个细菌和细胞，通过分裂繁殖所产生的一系列遗传结构完全相同的群体。,前言,一、定义：,克隆羊： 个体水平 细胞克隆： 细胞水平 DNA克隆： 分子水平 单克隆抗体： 分子水平,2、DNA重组/ 基因重组,利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。,3、DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克隆,将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。,4、基因工程,基因工程(genetic engineering) 有目的的通过基因克隆技术，人为的操作改造基因，以改变生物的遗传性状的系列过程。,遗传学角度：一项遗传学技术,将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，创造生物新品种或新物种的遗传学技术 无性繁殖：称之为“克隆” 行使正常功能：称之为“表达”,生物化学角度：重组载体的操作,在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。 DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的 载体DNA ：病毒、细菌质粒或噬菌体,二、应用：,1、获得大量DNA拷贝 2、体外生成蛋白质 3、基因治疗,第一节 概论,一、历史 1944 肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质 1953 DNA双螺旋模型 DNA复制的机制 1960s 遗传密码 中心法则 1970 反转录酶 cDNA的合成 1946- 质粒 重组载体 1968-70 限制酶 工具酶 1972 Berg重组DNA分子 1973 Cohen重组DNA的转化筛选,The transforming principle is DNA.,DNA is the genetic material,History of DNA cloning,Francis H. Crick James D. Watson,History of DNA cloning,History of DNA cloning,中 心 法 则,History of DNA cloning,质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒都是环状构形。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。,限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。,History of DNA cloning,Berg P., the 1st DNA cloning,Recombinant DNA Technology Boyer and Cohen, 1973,History of DNA cloning,二、基因克隆的特点和技术路线,1、特点： 分子水平上操作，细胞水平上表达 2、技术路线： 分：分离制备目的DNA片段和载体 切：目的DNA与载体的剪切 接：目的DNA与载体的连接 转：重组DNA分子转化宿主细胞 筛：筛选阳性克隆，大量扩增,基因克隆技术路线,3、基本原理,第二节 工具酶,工具酶： 基因克隆研究工作中，用以切割、连接和修饰DNA或RNA的一类酶，是克隆的基本工具。包括核酸限制性内切酶、连接酶、聚合酶、反转录酶等。,重组DNA技术中常用的工具酶,2、命名 酶的来源 Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系 酶的名称 Hind 特异性甲基化酶 GTPy PuAC A AGCTT,流感嗜血杆菌d株,3、分类 DNA底物 双链DNA 双链DNA 双链DNA 辅因子 Mg2+ ATP SAM Mg2+ Mg2+ ATP 识别序列 特异 特异 特异 切割位点 非特定 特定 特定 识别序列前后 之中 之后25bp27bp 100-1000bp 修饰作用 有 无 有,4、特点 型限制酶： 48个核苷酸 切口概率 星号活力 回文结构 平端切口 粘性末端,如EcoRI切割后产生5末端突出的粘性末端； 5GAATT C3 5G-OH p-AATTC3 3C TTAAG5 3CTTAA G5 PstI切割后产生3末端突出的粘性末端： 5C TGCAG3 5CTGCA-OH p-G3 3GACGT C5 3G ACGTC5 还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（blunt end）如SmaI: 5CCCGGG3 5CCC GGG3 3GGGCCC5 3GGG CCC5,同裂酶（isoschizomers) 来源不同，但能识别和切割同一位点 这些酶称同功异源酶（异源同功酶）。 但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 Eg: 限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶 Hpa不能切割甲基化位点 Msp可以切割甲基化位点,CCG G G GCC,5、几种特殊酶,+,Bam H,+,Bst,（识别序列相同，但切割位点可以相同或不同）,同尾酶（isocaudamer） 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T,7、限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。 分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。,二、聚合酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶（全酶） 2、大肠杆菌DNA聚合酶 大片段 Klenow 3、T4噬菌体DNA聚合酶 4、Taq DNA聚合酶,5 3 外切活性,5、反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）,催化以RNA为模板反转录生成 DNA。 最初禽类成髓细胞中分离。 主要用于反转录mRNA生成cDNA。,RNA指导的DNA合成反应； RNA的水解反应； DNA指导的DNA合成反应。,AMV：42 PH 8.3 MLV： 37 PH 7.6, 分类, 作用, 活性,反转录酶具有RNaseH活性,四、连接酶,1、作用 双链DNA 相邻的3-OH 和5-P 在NAD+ or ATP供能 形成磷酸二酯键,只能连接nick 不能连接gap,2、连接酶的来源 1）DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码 粘末端连接 NAD+供能,2）T4 DNA ligase： 大肠杆菌T4噬菌体DNA编码 可连接粘性末端 可连接平末端 （已知唯一可连接平末端的DNA连接酶） 最适pH：7.2 - 7.8 需要ATP参加反应,五、T4多核苷酸激酶,催化ATP的P 一个一个依次加到DNA的3 末端。,ATP,六、末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）,催化dNTP一个一个依次加到DNA的3 末端。小牛胸腺分离。,七、碱性磷酸酶,催化DNA、RNA、NTP、dNTP的5磷酸基团 。 小牛小肠、细菌中分离。,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,第三节 目的基因与载体,因子两端正好有两个酶切位点BamH和EcoR，切割后得到1500bp的片段。 适用于基因结构简单的原核生物中的多拷贝基因。,一、目的基因,1、染色体DNA的限制性内切酶酶切片段,2、通过mRNA反转录合成 cDNA,基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,3、从基因组DNA文库获取目的基因,4、从cDNA文库获取目的基因,8、最常用的方法：？,5、PCR扩增目的基因,6、人工体外合成基因片段 1.20RMB/bp,7、根据蛋白质序列推导,索取,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,二、载体 （一）定义： 能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子 （二）特性： 复制起点 (ori) 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 筛选标志： Amp+ Kan+ Neo+ 分子量不宜过大 ： 否则易断裂、转化效率低 表达载体：还要有P、E、前导序列、加尾信号、信号肽、核定位序列等,（三）载体种类,1、功能 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把基因插入到染色体组中 报告载体： 携带报告基因,2、来源： 质粒载体 噬菌体载体 病毒载体 细菌和酵母染色体,（四）质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常有1 3个抗药 性基因，以利于 筛选。, 存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 310 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息,1、特性, 15 kb 一般310 Kb 左右,2、接受的DNA片段长度,3、常用质粒,pBR 322 4361 bp Tetr Ampr pUC 18/19 2686 bp Ampr LacZ pGEM-3Z 2743 bp Ampr LacZ pUC 118/119 3162 bp Ampr LacZ,主要用于外源基因的克隆和保存，是一种比较原始的克隆载体。pBR322：B, bacteria; R, Resistance.,以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。,pBR322,pUC18/19,主要用于外源基因的克隆和保存，由美国UC科学家于1993年构建是一种比较好的克隆载体，目前还广为应用。,lacZ,pBK-CMV,pEGSH,pSG5,pUC118/119,pWE15,pBC KS +/-,pPROTet.E,（五）噬菌体（bacteriophage ）,感染细菌的病毒,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,M13噬菌体DNA改造系统： M13mp系列 pUC系列,特点： 约50kb，容纳1822kb片段 线性双链，天然粘性末端 感染宿主细胞能力强 容易筛选、贮存, 线形双链DNA分子， 50kb左右 两端12碱基互补的单链，天然黏性末端，cos位点。 由壳蛋白包装,1、特性,噬菌体, phage,48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends),溶菌阶段 (复制和释放),溶源阶段 (整合到寄主 染色体上),DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,Long (left) arm,short (right) arm,Exogenous DNA (20-23 kb), phage,12bp, 可接纳较长片段：1822kb 壳蛋白包装，具有感染宿主细胞的能力，片段为载体的70105（1525kb）均可成熟。 易筛选，易贮存。,2、接受的DNA片段长度,根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选,3、常用噬菌体载体,EMBL charon gt,M13单链DNA噬菌体的生命周期,M13噬菌体,M13克隆载体分子结构图,（六）病毒载体,1. 逆转录病毒载体 2. 慢病毒载体 3. 腺病毒载体 4. 腺相关病毒载体 6. 单纯疱疹病毒载体,病毒载体的构建原则,重组病毒一般是用于基因治疗，因此病毒载体多为减毒的，即复制缺陷性的，在正常细胞中不能复制，只能表达所携带的基因。 由于病毒载体基因组比较庞大，难以直接将目的基因酶切插入病毒基因组。 一般是先构建穿梭质粒，然后与亲本病毒共转染包装细胞，获得复制缺陷性病毒，分离纯化。 病毒载体的大量制备必须要包装细胞(packaging cells).,1）逆转录病毒（retrovirus,RV） RV是目前基因转移中应用最为广泛的一类病毒。是一类RNA病毒。由于缺失了自身包装所必需的蛋白（结构蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其复制需依赖辅助细胞系。逆转录病毒转染效率高，理论上可高达100%。,病毒载体的特点,Retrovirus,逆转录病毒,（1）两端各有一长末端重复序列LTR。,逆转录病毒前病毒的结构特点,（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。,（3）病毒有三个结构基因,（4）5端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。,（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。,(1)在U3内有增强子和启动子； (2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； (3)在R内还有poly(A)加尾信号。,(1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； (2)pol基因，编码逆转录酶； (3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,逆转录病毒介导的基因转移系统 由两部分组成：,(1) 逆转录病毒载体,(2) 辅助细胞株(如PA317),Retroviral packaging system,包装细胞（pakaging cell） 包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。,逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程： 1）目的基因克隆到逆转录病毒载体上； 2）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如 磷酸钙介导或电穿孔法导入已选定的包装细胞； 3）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞； 4）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；,5）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达到目的。 6）如采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果； 7）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。,逆 转 录 病 毒 载 体 的 特 点,感染宿主范围广：逆转录病毒表面的糖蛋白能被很多哺乳动物细胞膜上的特异性受体所识别，因而可以高效率地将基因转移到被 感染的细胞内。 表达时效长：被转移的外来基因能整合进被感染细胞的基因组中而不丢失，有利于被转移基因的永久保存。,优点,缺点,特异性差 只能感染正在分裂的细胞。 载样量小：最大可以装载 8 - 10 kb 大小的外来基因。 随机整合，具有一定的致癌性。,2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,生活周期,腺 病 毒 载 体 的 优 点,1. 对人类安全。美国长期应用腺病毒进行免疫疫苗接种无导 致严重疾病的记录。 2. 腺病毒特异性受体较普遍地存在于哺乳动物细胞膜上，宿 主范围广泛。腺病毒既感染分裂的细胞，也感染不分裂的 细胞，基因治疗应用范围大，而且感染效率很高，最高可达100%。 3. 被转移的遗传物质不整合进被感染细胞的基因组内，无激活癌基因或灭活抑癌基因的危险。,腺 病 毒 载 体 的 优 点,4. 由于腺病毒能感染呼吸道和消化道，所以可通过吸入或口服的方式进行基因转移。 5. 易于制备和纯化，很容易获得高滴度的重组腺病毒，有利于直接活体基因治疗。 6. 腺病毒载体最大可装载 7 - 8 kb 左右大小的外来基因。,腺 病 毒 载 体 的 缺 点,1. 表达时效短：由于腺病毒载体转移基因不整合进细胞的基因组中，随着 细胞的分裂，细胞内的转移基因逐渐丢失。 2. 包膜有免疫原性：虽然由腺病毒诱发的免疫反应有利于开展肿瘤免疫方面的基因治疗，但它引起的免疫排斥反应不利于反复治疗。 3. 特异性差：宿主范围广泛是腺病毒载体的一个优点，但同时特异性差 又是它一个缺点。很难以腺病毒载体针对某一特定组织进行基因治疗。 4.构建载体复杂,3)腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV） AAV属于微小病毒家族成员，是一类小的单链DNA病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒（常为AV）存在时才能复制。AAV可感染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。,Structure of AAV Virus Genomic DNA,REP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因,AAV的特点, 以潜伏感染为主； 病毒基因组与细胞共存； 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态； 若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制； 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。,AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。,AAV载体的缺陷：,4）单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV） HSV是一些双链DNA病毒（基因组约150kb），具有嗜神经细胞的特性，能在神经细胞内形成“终生隐性感染”。将外源基因导入并使之长久存在于中枢神经系统是该类病毒载体的一大特点。,缺点： （1）构建复杂 （2）对人体有致病性，危险性高，需慎重。,优点： （1）可感染分裂或非分裂期细胞 （2）载样量大 （4）不整合，但可长期稳定表达,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的切割,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,第四节 切,目的基因与载体的剪切 同种酶 1、目的 2、限制性内切酶的选择 A、目的基因两端存在的位点 B、载体的多克隆位点,3、策略 粘性末端： 5突出末端 3突出末端,粘改平 ： 5凹端削平（核酸酶S2）， 3凹端补齐（DNA多聚酶）,平端切口： 难于连接，效率低，无方向性,平改粘 ：人工接头(linker) 衔接子(adaptor) 同聚物加尾法,策略 粘性末端 平端切口 粘改平 平改粘,目的 连接,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,（一）平末端连接 产生：酶切 补齐法 削平法 优点：解决无法解决的问题 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入 效率低，酶用量高,第五节 接,（二）同源粘末端连接 形成：同一种酶 同尾酶 优点：效率高 一种酶 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入 对策：载体DNA片断的脱磷酸化处理 限制酶鉴定,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,粘性末端DNA片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连。 载体的5末端处理：碱性磷酸酶脱磷酸基团 外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。,酶切鉴定DNA片断的插入方向,粘性末端连接的双向插入,（三）定向克隆（最常用） 定义：使目的基因片段定向插入 载体分子中的方案 方法：双酶切 由平末端改造 优点：防止载体自身环化 正向插入 单拷贝插入 连接效率高,同聚物加尾法 衔接子(adaptor) 接头(linker),1、同聚物加尾法,用5 核酸外切酶处理DNA片断,在A和B分别中加入dATP和dTTP,同聚物尾巴1040个碱基,2、人工接头(linker)连接,3、衔接子连接法,衔接子连接法,双衔接物连接法的基本程序,cDNA链的合成,通过DNA聚合酶合成第二链,加入Sal I衔接物,S I核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I,可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。,双衔接物,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,第六节 转,导入方式 转化（transformation ）：质粒或以其为载体的重组子导入细菌并得到表达的过程。 转染（transfection ）：重组噬菌体或病毒导入宿主细胞的过程。 转导（transduction ）：重组DNA经过外壳蛋白包装后转入宿主细胞的过程。,1、转化作用(transformation)：质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌并得到表达的过程。,2、转染 (transfection)：重组噬菌体或病毒导入宿主细胞的过程。,3、转导作用(transduction)：以噬菌体为媒介，重组DNA经过外壳蛋白包装后转入宿主细胞的过程。,一、宿主细胞,受体细胞 原核：大肠杆菌（DH5、JM系列、HB101、SSD） 枯草杆菌 真核：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞 受体菌条件 安全宿主菌 处于感受态易获得外源DNA的状态 限制酶和重组酶缺陷 对重组子的复制和扩增没有严格的限制,二、转化的原理和过程,（一）氯化钙法 1、原理： 细菌在低温和低渗环境，通透性增加，膨胀成球形，此时转化混合物中的DNA形成羟基钙磷酸混合物黏附于细胞表面，经短暂热休克，促进细胞吸收重组子。,2、过程： 对数期细菌置于冷Cacl2、Mgcl2中感受态 加入重组质粒，冰浴30分钟，不要震荡 42水浴6090S，热休克 马上冰浴 3、特点： 转化效率低，1%的转化效率 105106转化子/gDNA,（二）电穿孔法 1、原理： 对数生长中期细菌，冷却离心，用低盐缓冲液充分洗涤，降低细胞悬液的离子强度，用10甘油重悬细胞，使其浓度为31010个/ml，即可用于电穿孔法转化。04 操作，室温转化效率低。 2、特点： 优点：细菌制备较氯化钙法容易 转化效率较高 缺点：需要特殊仪器 条件不易掌握 细胞杀伤率高,（三）转染试剂法 1、阳离子型脂质体 1）转染试剂： 单价：lipofectin 、 lipofectACT TM 、 dostap 多价：dosper 、infect Amine TM 等 2）特点： 转化效率高 细胞毒性低 转化细胞类型广 操作简单易行 价格昂贵,2、DEAE葡聚糖 1）转染试剂： 二乙胺四乙基葡聚糖高分子多聚阴离子试剂 促进哺乳动物细胞捕获外源DNA 2）操作： 重组子试剂复合物处理细胞 试剂处理细胞重组子转染 3）特点： 用于克隆基因地瞬时表达，不易形成稳定细胞系 一定的细胞毒性 用于传染小量DNA,（四）显微注射 DNA准确注入细胞最可靠的方法。借助电脑更为精确。 特点： 昂贵 每次注射细胞数量有限,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,第七节 筛,抗药性筛选：ampr tetr kanr 插入表达筛选 蓝白斑筛选 测序 菌落或噬菌斑杂交筛选 酶切鉴定：插入否？插入方向？,1、抗生素平板筛选,2、插入表达筛选,3、蓝白斑筛选,原 位 杂 交,4、杂交筛选,5、酶切鉴定DNA片断的插入方向,6、测序,准确，但成本高。,重组DNA技术操作过程可形象归纳为:,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,第八节 实验技术,煮沸法 碱裂解法 SDS法 原理：,强碱性环境、SDS,细菌染色体DNA变性,质粒仍呈天然状态,中性 高盐 离心,蛋白变性沉淀,沉淀：染色体DNA、蛋白质,上清：质粒,一、质粒的提取及纯化,细菌培养物，5000rpm离心5分钟，收集沉淀 弃上清加入100l预冷sol I振荡1015 加200l新鲜配制sol II颠倒数次混匀，冰浴5分钟 加150l预冷的sol III , 颠倒数次混匀，冰浴,10分钟 12000rpm离心10分钟 上清转移至一新1.5ml管中,加等体积的酚:氯仿:异戊醇 剧烈振荡混匀(抽提)20秒，12000rpm离心10分钟 上清转移至一新1.5ml管中,加22.5倍体积的 无水乙醇混匀 冰浴 10 min 12000rpm离心10分钟 弃上清,用75%的乙醇洗涤沉淀一次 12000rpm离心5分钟 弃上清,沉淀 用20l TE溶解沉淀,酶切体系 DNA样品 1l EcoR 1l 10bf 1l 水 7l 10l 活力单位(IU): 一般 5 IU/l 取1l的酶可以消化5M的DNA,二、限制酶切割,bp 1350 974 750 550 370 250,载体质粒,目的 基因,重组质粒,酶切,注意： 低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，避免反复冻融。 酶量不能超过反应体积的1/10。 无菌新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。 DNA样品：一定纯度，不能混有酚 氯仿 EDTA SDS 过多盐类等 反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供 温度和时间：37 1-2h 终止反应：EDTA SDS 加热 -20,低熔点琼脂糖凝胶回收法 羟乙基修饰 凝固温度30 溶化温度65 胶回收,三、核酸片段的回收与纯化,浓度： 1 OD260 = 50g/ml 双链DNA = 40g/ml 单链DNA/RNA = 20g/ml 寡核苷酸 纯度： DNA纯品 OD260/OD280=1.8 RNA纯品 OD260/OD280=2.0,四、核酸定量,常用：T4DNA连接酶 反应体系：越小越好 10 15 20l 目的基因(300bp,200ng/l) 5 l 载体 (3000bp,1g/l) 1 l 酶 1.5 l 10bf 1.5 l 水 6 l 15 l 16 24-48h 目的基因与载体等摩尔， 片段数之比为5:1 或10:1,五、DNA分子的连接,六、