豆粕品质的检测方法.doc

豆粕品质的检测方法一、 评定指标1、 1：抗胰蛋白酶的活性：Trypsin Inhibitor Activity TIA 大豆粕在0。01mol/LnaOH浸泡1h过滤,滤液用PBPA水解.测胰蛋白酶活性TIU.1、 2：尿酶活性（Urease Activity UA） 国际标准法（ISO）、PH增值法（PH法）、扩散法、酚红法。CHINA规定PH0。4 在0.02-0.2之间是优质豆粕.UA与TAI几乎同步失活.在加热过度以前,TIA以全部失活.1、 3:蛋白质溶解度:(Protein Solubility)美国乔治大学:Dale & Araba (1987)以检测豆粕是否加热过度.一定量的豆粕与0.2%NaOH溶液混合离心过滤,滤液凯氏测氮.PS70%,则加热过度,70-80%为适宜,测时其灵敏度不够,粒度影响,当粒度在60-80目时方稳定.1、 4：有效赖氨酸:赖与精氨酸属热敏性AA,高温时Lys与还原糖发生Maillard反应.测定法有:A染料结合法(DBL):二硝基氟苯(FDNB),三硝基磺酸(TNBS),酸性橙-12,茚三酮发生特异性呈色反应.B 高效液相色谱法(HPLC)1、 5：蛋白质的水溶解度和氮的水溶解度：蛋的质的水溶解度（PDI）与氮的水溶解度（NSI），二者只是与水混合后的搅拌强度不一样。PDI是8500r/min的速度搅拌10min，NDI是120r/min搅拌30min。PDI测定豆粕的加热程度比UA和PS（NaOH）灵敏，NSI在7-27.8%是可以接受。NSI低于10%则为加热过度。Balloun & Hgymard(1959):加热时间延长，NSI降低，加热过度，则大大降低，鸡的增重与饲料报酬降低。1、 6考马氏亮蓝法：Kratzer(1989): 考马氏亮蓝对蛋白质考马氏亮蓝考马氏亮蓝显色对AA不显色并与PS相关度好但考法测的实际值大大低于凯氏法测的蛋白质溶解度。这可能与凯氏法将全部AA包括在蛋白质内的缘故。但考法较PS法测的时间短的多，故考法更适合评价经受不同热处理时间后饲料中可溶性蛋白质的含量。1、 7：其它方法：橙黄G染色法（只能有限鉴定过分加热处理的大豆粕）、甲醛滴定法、甲酚红染色法(每克豆粕吸收甲酚红的毫克数2-3mg为生豆粕,3.3-3.7mg为加工不足,3.8-4mg为适当,4.3mg为加热过度)、颜色亨特色值。（Smith1981：颜色与蛋白质有较高的相关性）二、 豆粕质量与生产性能 熱處理對大豆粕中可代謝能量之影響生大豆粕中的可代謝能量要比經熱處理的大豆粕來得低（Hill 及 REnner , 1960 ., 1963）。一般認定，含 48 %粗蛋白的大豆粕，每公斤約含有 2,440 仟卡的可代謝能量（NRC）。含有 10 個單位胰蛋白酶抑制因子的大豆粕樣品，其每公斤應有 2,575 仟卡的可代謝能量，但要是檢測出來的胰蛋白酶抑制因子大約在個單位時，其可代謝能量可增至 2,740 仟卡（Mian 及 Garlich，1987）。 Parson 等人曾做觀察，發現去穀大豆添餵燒烤用肉雞及火雞時，其真正斤提供之可代謝能量，分別為 3,003 及 3,292 仟卡。在 107 溫度下經 10 13 分鐘熱處理之大豆薄片，其每公斤可代謝總能量為 3,130仟卡，但是熱處理過度（即在 121 的溫度下，經 121 分鐘的熱處理）的大豆薄片，其每公斤的可代謝總能則會降至 2,700 仟卡（Sibbald,， 1980）。 熱處理對大豆粕中蛋白質之影響過去幾年來，曾有多種方法被用來檢測大豆粕是否加熱過度而影響其飼養價值。這些方法當中，包括有藉由甲醛滴定、甲酚紅染色法，以及橘色染劑染色法（orange - G dye binding），來測出其游離功能基（free functional group）的方法；及藉由凱氏法或 Coomassie 藍色染劑染色法，來檢測其加熱後所產生具有螢光的衍生物，以及蛋白質的溶解度。 甲醛滴定法Almquist 及 Maurer （1953）曾建議採用甲醛滴定法來評鑑大頭粕是否熱處理過度，其檢測結果之資料詳列如表。經蒸煮過之大豆蛋白，其功能基會降低。 甲酚紅染色法本染色法曾由 Olomucki 及 Bornstein（1960）作過詳細的描述。其檢測步驟為，採取 400 毫克的樣品，先經 1 mm 網目之篩網篩濾後，再置於 10 公撮之甲醛紅溶液中，然後一齊加以振動一個 時。本檢測法所用之甲醛染色液，係以 1 公撮含有 0.2 公克溶於 100 公撮（0.2%）酒精及 9 公撮（0.1 N）鹽酸混合液之甲醛紅溶液稀釋調製而成。上述稀釋液經離心處理後，其上層部份再到入一裝有 9 公撮（0.2 N）的氫氧化鈉溶液中，並測量其顏色的濃度。如果大豆粕被染劑所吸收的量（mg），而在最適當濃度所吸收的染劑量（mmg）讀取。那麼2.00( 10 XA )。甲醛紅染色法與大豆粕熱處理間的相關性詳列如表。 表.以甲醛滴定作為大豆粕熱處理法的檢測指標高壓蒸煮時間（分鐘）以申醛滴定時，欲使 pH 值調至 9.0 時所需 0.05N 氫氧化鈉作用量（ML）07.9556.90156.50306.10455.70605.501204.70資料來源：Almquist 及 Maurer , 1953表.大豆粕熱處理程度與紅染色法間的關係加熱程度每公克大豆粕被甲醛紅吸收之重量（mg）生大豆粕2.0 3.0熱處理不夠3.3 3.7適度熱處理3.8 4.3熱處理過度4.3 以上資料來源：Olomucki 及 Bornstein , 1960橘色染劑染色法Moran 等人（1963）曾就橘色染劑染色法的檢測程序加以述說。大豆粕經高 壓蒸煮後，其橘色染色值會隨之降低，但由他們研究所獲得之數字（詳如表）顯示，此一檢測方法靈敏度並不很高。 螢光測定法徐等人（1949）曾經提述過一種利用螢組檢測熱處理大豆粕抽出物的方法，人旦他們對於此項檢測方法的細節並未加說明。惟按 Ewing （1963）所引述的檢測步驟，是將採得之雙份經細磨之大豆粕樣品（每份樣品為 0.01公克），倒入裝有 25 公撮 0.01 M 濃度氫氧化鉀磷酸鹽溶液的 50 公撮加蓋 Er-lenmeyer 三角餅中，在 pH 值 4.8 的狀況下，以機械方式振盪 15 分鐘與予萃取。再用 42 號 Whatman 濾紙上述萃取液加以過濾，然後將過濾後之溶液，置於 Coleman-12 型的螢光測定儀下，檢測並讀出其螢光值。在檢測螢光值前，螢光測定儀必需先予標準化校正，即在以每公撮 0.10 mg 奎寧之標準受測液作校正測試時，其螢光值讀取數標準應為 100。最後在作檢測時，需將萃取液適當地稀釋成幾種不同的濃度，並置於磷酸鹽的緩衝液中，再進行檢讀結果，而其檢測結果，係以相當於每公古大豆粕中所含奎寧硫化物微克量的螢光值來表示。 Balloum 等人（1953）曾採用此種方法來檢測經高壓（磅平方英吋）蒸煮過的大豆粕，並與使用尿素酶活性的檢測方法作過比較。尿素酶活性是用每以克加有尿素大豆粕所釋放出來氨的百萬分當量來測定；而螢光值則是以每公克大豆粕中所含奎寧硫化物的微克量來表示。由他們所測得而列於表 10 的數字顯示，當大豆粕經過壓蒸煮至 60 至 90 分鐘時，其螢光值會有顯著的增加，也就是說大豆粕加熱處理時延長，會有引起雞隻生長減緩的情形。 表.大豆粕加熱處理對其橘色染色法反應能力之影響在 120下高壓蒸煮時間（分鐘）每公克大豆粕吸附之染劑量（mg）由染色浾所測得之蛋白質量（%）070.843.85683541.63068.441.54568.541.66063.837.29063.236.612061.234.7資料來源：Mpran 等人，1963。 表大豆粕高壓蒸煮時間對其尿素酶含量、螢光值及蛋白質溶解度之影響高壓蒸煮時間（分鐘）雞隻之反應增重（以克）尿素酶值螢光量值水溶性氮佔總氮量之百分率02235.0225.376.032284.7025.553.252293.6125.543.5102402.2226.024.1202990.2628.27.7602770.1437.57.41202420.1251.87.5資料來源：徐等人，1949蛋白質溶解度凱氏法利用凱氏法來檢測蛋白質溶解度的這種方法，過去在考慮大豆粕的熱處理是否足夠時，曾被用來檢測可溶性蛋白質的部份（Araba 及 Dale，1990a）。由表 11 的資料可以看出，大豆粕中蛋白質的溶解度隨高壓蒸煮時間的延長而降低，與雞隻生長的減緩有著極密切的關係，因為那些未經熱處理的樣品，事實上在商業化的加工過程中都已將其中的生長抑制因與予破壞。 表12. 大豆薄片經高壓蒸煮處理後對其一些用化學方法所測得指數的影響高壓蒸煮在0.2%氫氧化鉀溶液中蛋白質的溶解度凱氏蛋白質（%）每100mg粗蛋白吸附Comassie之量（mg）每g大豆粕之胰蛋白酶抑制因子活性單位數尿素酶活性 pH變化值每g大豆粕吸附橘色-染劑量（mg）094.667.636,74001.3040.8768.950.2700034.11564.645.6180034.12147.733.70030.03047.925.70028.04635.819.20026.66034.117.20023.2資料來源：Kratzer 等人，1990a表13.不同高壓蒸煮處理時間之大豆粕及離胺酸之添加對出生後21天齡雞隻增重及飼料效率之影響高壓蒸煮時間（分）隻日增重（公克）飼料換肉率1.2% 離胺酸1.4 % 離胺酸1.2% 離胺酸1.4% 離胺酸種禽飼糧29.9bc1.65021.0d25.9d1.671.65731.2ab33.5a1.371.35528.7c33.9a1.361.362129.6bc31.7ab1.381.383029.6bc32.6a1.441.384526.2d32.9a1.481.416021.3c30.0bc1.591.381.表欄中數字右上角註有不同標示者，係表示其差異顯著（P0.05）2. 資料來源：Kratzer 等人，1990b。 表14. 大豆薄片經不同時間高壓蒸煮處理後對其一些用化學方法所測指數的影響高壓蒸煮時間在0.2%氫氧化鉀溶液中蛋白質的溶解度凱氏蛋白質(%)每100mg 粗蛋白吸 Coomassie之量(mg)尿素酶活性pH變化值每g 大豆粕之胰蛋白酶抑制因子活性單位數福爾馬林(ml0.05N NaOH / 2g)每g大豆粕吸附橘色- 染劑量(mg)090.967.31,9539,0008.847.81554.144.70.104807.140.23044.632.90.10o6.638.94530.027.40.0706.035.36028.922.90.0505.534.412015.711.9005.333.518012.67.7005.229.1Coomassie - 藍染色法Coomassie - 藍”這種染劑會使蛋白質呈現顏色，人旦對胺基酸則無是項作業。用”Coomassie - 藍染色法”來檢測蛋白質的這種方法，是由 Bradford （1976）所倡議的。為測定溶於 0.2 % 氫氧化鉀溶液中的蛋白質，並與已知溶菌酵素（lysozyme）含量的方法（Kratzer 等人，1990）作色值強度的比較，此一檢測法已經過修改。在檢測過程中最重要的是，其所用經細磨的 40 mg 大豆粕樣品（大約含有 20 mg 的蛋白質），需先倒入 10 公撮 0.2 % 的氫氧化鉀（KOH）溶液中，再一齊旋轉 3 4 次。在經過 10 分鐘後，再將其上層液用號濾紙加以過濾，並取出公撮的過濾液，用含有氯化鈉磷酸鹽的緩衝液將其稀釋成公撮。經稀釋過的濾液，再與 9.5 公撮的Coomassie - 藍染劑溶液（即以 50 公撮的染劑溶於 50 公撮 16 M的 H3PO4，以及以 46.7 公撮量用非離子化水稀釋成 1 公升乙醇的方式調配而成）混合。以每平方英吋 15 磅高壓蒸煮過之大豆粕，其在 0.2 % 氫化鉀溶液內停留不同時間下的溶解度詳列表如表 11。由Coomassie - 藍染色法及凱氏法斤測得之蛋白質溶解度會隨高壓蒸煮時間的增長而降低。由染色法及凱氏法所測得之蛋白質溶解度實際數值，可能由於用凱氏法檢測時亦將胺基酸部份計算在蛋白質內，所以雖然遠比凱氏法所測者來得低，但由兩種方法所測出之溶解度數值仍極為一致。 表11. 大豆粕高壓蒸煮時間對 0 18 日齡雞隻飼養業績及蛋白質溶解度、尿素酶活性及橘色- 染色之吸附能力反應高壓蒸煮處理時間（分鐘）增重（公克雞隻）飼料換肉率蛋白質溶解度（%）尿素酶活性（pH變化單位）橘色- 染劑（mg / g 大豆粕）0450a1.79c86.00.0379.65445a1.8776.30.0278.810424a1.83bc74.00.0078.220393b1.89b65.40.0076.6403166c2.04b48.10.0076.680219d2.55a40.80.0075.21.上表欄中數字右上角註有不同標示者，係表示其統計學上差異顯著（P 0.05）。 2. 資料來源：Araba 及 Dale，1990b。 這些大豆薄片樣品，係以 32%的用量，並分別按含有 1.2 %及 1.4 %離胺酸量作為裡仔雞飼糧時，加以測定的（詳附表 13）。由表中可以看出，餵飼含有經分鐘高壓蒸煮處理大豆粕飼糧之雞隻，其生長有初步的改善，但隨高壓蒸煮時間的加長，如飼糧中的離胺酸含量仍設定在 1.2 及 1.4%時，則其生長減緩的情形就變得很明顯。基本上離胺酸是對熱最不穩定的胺基酸之一，所以在采用 熱處理過度大豆粕調配飼糧時，其中離胺酸含量的底限就變得相當重要。 在一項採用各種不同高壓蒸煮時間處理大豆粕的單純研究中，曾用了好幾種方法加以比較。這些由上述研究所測得的資料詳列如附表14。由Coomassie 藍染色法所崱得的蛋白質溶解度，和由凱氏法所測得的結果有相同的趨勢。由甲醛滴定法及橘色-染色法所測得的溶解度，亦隨高壓蒸煮時間的增加而降低。大豆粕的高壓蒸煮時間超過 15 分鐘時，其尿素酶及胰蛋白酶抑制因子的活性，實際上已完全消失。另由其他的資料指出，每公克大豆粕中胰蛋白酶抑制因子的活性，如在 5000 單位左右，被認為是已經充分熱處理的滿意標準。 附表12中所提述經熱處理過的大豆薄片，係以 30.07 % 的用量，並以含有 1.2% 離胺酸的量，用來餵飼裡仔雛雞。大豆薄片在經 15 分鐘的高壓蒸煮後，因其中的生長抑制因子都已被破壞，故其生長有改善的情形。由凱氏法就大豆薄紗所測得的 54%蛋白質溶解度，和由 Comassie 藍染色法所測得的每100mg蛋白質中出現 44.7 mg 的參考蛋白質當量（reference protein equiplent, 簡稱為RPE），以及低的尿素酶和胰蛋白酶抑制因子活性，顯示在這些情況下經 15 分鐘的高壓蒸煮處理，可能已經熱處理過度。至於雞隻胰臟的重量方面，則以餵飼未經熱處理大豆粕薄片佁糧的雞隻為最高，而餵飼經高壓蒸菾過大豆粕薄片者，則有減低的情形。此外，其當中還呈現有一種趨勢，即胰臟重量的增加表示與蛋白質因遭受到損失而引起體重成長嚴重的滯礙有 關。 從經熱處理大豆粕所測得各種指數所作的統計學比較，顯示 Comassie 染色法和由橘色-染色法之間；由凱氏測得的蛋白質溶解度與福爾馬林滴定法所測得的結果之間；橘色-染色法與由凱氏法所測得蛋白質溶解度之間；福爾馬森滴定法和由凱氏法所測得蛋白質溶解度之間，都有很密切的相關性。由 Comassie 藍染色法所測得每 100 mg 蛋白質的”參考蛋白質當量（RPE）”如果超過65mg 時，則因熱處理已不足以破壞生長抑制因子，則其生長率就會呈現較低的情形。品質好的大豆 粕，共作裡仔雞用飼糧的原料時，如其離胺酸含量採用 1.2% 的標準，則其 Comassie 藍染色法所測得的數值應應不能低於35；如採用 1.4 %的標準時，則其數值應不能低於 25。 由於過去曾針對在試驗室內加工處理大豆薄片的標準作過研究，所以在要將這些標準應用到其他一些大豆粕樣品時，總會覺得很有趣。中國大陸為騰做試驗研究，曾在其實驗室內加工產製出四種大豆粕樣品，這四種樣器並予分析其Coomassie 藍染色值、尿素酶及胰蛋白酶抑制因子活性。由其分析結果（詳附表 16）顯示，生大豆粕樣品中的尿素酶及胰蛋白酶抑制因子活性很高，其中只有兩個樣品的活性稍低，但就整體來說還是很高，而這些大豆粕樣品的加熱處理都未曾過度。 而由美國所採得 16 個商業化生產之大豆粕樣品，經以視覺依其顏色加以排名，並採用Coomassie 藍的檢測法分析其胰蛋白酶抑制因子活性，以及蛋白質溶解度（詳附表 17）。 由上述檢測結果（表 17）顯示，16種大豆粕樣品胰蛋白酶抑制因子活性的變化，約在 580 至4,460單位之間，且其活性會有隨顏色的變深而降低的趨勢。根據我們建議的標準來衡量時，上述這 16 種大豆粕樣品都可接受作為飼料原料之用。因為Coomassie 染色值檢測的時間要比凱氏含氮檢測法縮短很多，因此這種檢測方法經證實在評鑑經熱處理飼料成份的可溶性蛋白質方面，是相當管用的。 表15.不 同高壓蒸煮處理時間對大豆粕營養價值的影響高壓蒸煮時間（分鐘）隻日增重（公克日）飼料換肉率胰臟重量（g每100g體重 2）種禽飼糧31.3g1.610.31a019.6c1.680.62c1527.4cf1.390.35a3025.6g1.510.33a4524.3de1.440.35a1208.6b1.940.37ab1803.5a2.830.45b36021.5cd1.440.35a平均20.11.740.39bc1. 上述計列含有要 1.2 %離胺酸之飼糧，係供飼養21 天齡雞隻之用。 2.表中欄內右上角註有標記者，係代表統計學上差異顯著，重複組每組所飼之雞隻為6 隻。 3. 資料來源：Kratzer 等人，1990a。 表16. 產自中國大陸某些大豆餅樣品之檢測結果樣品別粗蛋白含量（%）脂肪含量（%）Coomassie（mgRPE100 mg 蛋白質）尿素酶活性（pH變化值）每公克T1 活性單位數生大豆40.359.9565.82.4544,620正常43.585.7064.12.2014,500