课件：革兰阴性菌产酶测定.ppt

细菌灭活酶测定,卫生部北京医院 陈东科,2019,-,1,革兰阴性菌产酶耐药株的出现给临床抗菌治疗带来了极大的困难。因此，临床微生物检验技术人员对其应有充分的认识，掌握其耐药特性，建立适当的检测和报告方式，及时、准确地检测出产酶菌株和其他具有临床意义的耐药菌株及其耐药机制，对指导临床合理使用抗生素、延缓细菌耐药性的产生、控制耐药菌株的播散和流行，制定感染控制的政策、措施和具体方案，具有十分重要的意义。,2019,-,2,一、革兰阴性菌产酶概述,1.革兰阴性菌对-内酰胺类抗生素的耐药机制 （1）产生-内酰胺酶水解灭活药物； （2）细菌外膜通透性下降； （3）主动泵出药物。 其中产生-内酰胺酶是革兰阴性菌对-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。目前文献报道的-内酰胺酶已达200多种。,2019,-,3,2. -内酰胺酶分类 （1）Ambler的A到的D分子分类法； （2）Bush-Jacoby-Medeiros分类法（简称Bush法） 它将-内酰胺酶分为4类： 类头孢菌素酶：分子分型为C类； 类主要为质粒介导的酶：由分8个亚类，除2d亚类分子分型为D类外，其他7个亚类(2a、2b、2be、2br、2c、2e、2f)均为A类； 类B类金属酶； 类洋葱博克霍尔德菌产生的染色体介导的青霉素酶：此酶耐克拉维酸，分子分类不明。,2019,-,4,3.临床上重要的-内酰胺酶 (1)超广谱-内酰胺酶（ESBL）： 包括经典的ESBL （由TEM和SHV突变而来），以及Kl-like、PER和OXM型ESBL，属于A类酶，由质粒介导。这类酶可有效水解青霉素类、第一、第二、第三代头孢菌素和单酰胺类抗生素，部分可水解第四代头孢菌素，但对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感。通常对酶抑制剂敏感（克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦）。,2019,-,5,(2)耐酶抑制剂的-内酰胺酶（IRTs）： 有许多A类酶对酶抑制剂复合抗生素耐药，原因之一是原本对酶抑制剂敏感的酶大量产生，另一机制是产生了耐酶抑制剂的-内酰胺酶（IRTs）。 IRTs典型特征为对酶抑制剂复合药物的敏感性下降，而对第一代头孢菌素敏感，这一点可用于区分是ESBL的大量产生还是产IRTs。K-B法表型检测为对阿莫西林/克拉维酸和替卡西林/克拉维酸中介或耐药，而对头孢菌素敏感。,2019,-,6,(3)AmpC -内酰胺酶： AmpC -内酰胺酶可分染色体介导和质粒介导，通常具有可诱导性质，一旦形成去阻遏表达则可持续高产此种-内酰胺酶。1989年Bauernfeid等首次报道在汉城发现的一株革兰阴性菌的1 型-内酰胺酶基因位于可转移的质粒上(质粒AmpC),这种新的耐药表型因其较快的传播速度和较强的耐药性,开始逐渐引起人们的关注，在以每年发现12个新酶的速度持续增加。同时在临床常规药敏检测中发现,质粒AmpC对-内酰胺类药物的表型有时并不一定耐药。所以,对于质粒介导AmpC酶的实验室检测显得尤为重要。,2019,-,7,质粒介导的AmpC -内酰胺酶(CMY-1)。根据遗传学关系将AmpC 酶分为5族：枸橼酸杆菌起源的LAT族；未知起源的FOX族；阴沟场杆菌起源的Entb族(MIR-1、ACT-1)；摩根摩根菌起源的Morg族(DHA-1)；蜂房哈夫尼菌起源的Haf族(ACC-1)。 AmpC 酶表现为对第一、第二、第三代头孢菌素和单酰胺类、头霉烯类、氨基糖甙类及抗假单胞菌青霉素均耐药，但对碳青霉烯类、第四代头孢菌素和氟奎诺酮类敏感。 AmpC 酶对酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦耐药，但对邻氯西林和氟氯西林敏感。,2019,-,8,(4)水解碳青霉烯类的-内酰胺酶： 主要有B类金属酶(Metallo-lactamase, MBL)等。金属酶几乎可以水解所有-内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类），但对EDTA(乙二胺四乙酸)敏感。,2019,-,9,表1 AmpC酶及ESBL阳性菌对内酰胺类抗生素的敏感性,_ 抗生素 持续高产 质粒介导的 ESBL 染色体介导 的AmpC酶 的AmpC酶 _ 第三代头孢菌素 耐药 耐药/中介/敏感 耐药/中介/敏感 第四代头孢菌素 敏感 敏感 耐药/中介/敏感 头霉素类 耐药 耐药 敏感 碳青霉烯类 敏感 敏感 敏感 氯唑西林抑制试验 阳性 阳性 阴性 克拉维酸抑制试验 阴性 阴性 阳性 _,2019,-,10,二、 -内酰胺酶检测,2019,-,11,试剂配制,(1) 克拉维酸溶液：分子量199.161，含量 91.3%。 2m mol/L：50mg+1.15ml H2O = 200m mol/L(储存液) (相当于40g/ul) ，1:100稀释（2m mol/L） 2 g/ul：50mg+2.3ml H2O = 20g/ul(储存液)，1:10稀释（2g/ul） 10g/片：5 l/片 = 10g/片,2019,-,12,(2) 邻氯西林溶液：分子量457.87，含量 90.9%。 2mmol/L：200mg+1.99ml H2O =200m mol/L(储存液) (相当于100g/ul) ，1:100稀释（2m mol/L） 20g/ul：200mg+0.9ml H2O = 200g/l(储存液) ，1:10稀释（20g/ul） 200g/片：10l/片 = 200g/片,2019,-,13,2019,-,14,（3） EDTA-Na2溶液（100 m mol/L）： 分子量372.24 100m mol/L： 3.72g+10ml H2O = 1m mol/L(储存液) ，1:10稀释（100m mol/L）(相当于37g/ul) ， 5 l/片 = 186g/片,2019,-,15,（4）头孢硝基噻吩（Nitrocefin）纸片 12.5 g/片,2019,-,16,1.纸片法-内酰胺酶测定,头孢硝基噻吩（Nitrocefin）纸片法: 用无菌蒸馏水将Nitrocefin纸片浸湿，挑取待检菌落涂抹在Nitrocefin纸片上，10min内变红者为阳性。,2019,-,17,2019,-,18,2.超广谱-内酰胺酶（ESBL）测定,(1) 单纸片扩散法（初筛试验） 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴 头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、 头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、 头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、 氨曲南(Aztreonam,ATM)、 头孢泊肟(Cefprozil,CPD)纸片， 置35过夜培养，若抑菌环直径CAZ22mm、CTX27mm、CRO25mm、ATM27mm、CPD22mm时可疑为产ESBLs菌株。,2019,-,19,2019,-,20,(2). 双纸片协同法（初筛试验）,将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含10g/片克拉维酸纸片（Clavulanic Acid，CLA）贴于MH平板中央，于克拉维酸纸片周围分别贴上头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟纸片（纸片中心距离为2024mm），置35过夜培养，观察有无协同现象，CLA与任何一种ESC（超广谱-内酰胺类抗生素）有协同现象者可疑为产ESBL菌株。,2019,-,21,2019,-,22,2019,-,23,(3).双纸片增效法（确认试验）,将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上分别贴头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸、头孢曲松/克拉维酸、氨曲南/克拉维酸、头孢泊肟/克拉维酸纸片，置35过夜培养后量取抑菌环直径，与单纸片平皿对照，若加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径5mm，即为ESBL阳性。,2019,-,24,2019,-,25,2019,-,26,2019,-,27,(4)稀释法（确认试验）,琼脂稀释法： 肉汤稀释法： Etest法： 稀释法判断标准：加克拉维酸MIC值较未加克拉维酸MIC值小8倍以上（即3个稀释度），即为ESBLs阳性。,2019,-,28,2019,-,29,2019,-,30,2019,-,31,（5）三维纸片法（初筛试验）,方法： 将0.5麦氏单位的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，贴一片三代头孢菌素纸片（为待检菌耐药）于MH平板中央，用无菌纸片沾取待检菌贴在距抗生素纸片5mm处，置35过夜培养。 出现失状菌苔者为阳性。,2019,-,32,2019,-,33,3. AmpC -内酰胺酶测定,2019,-,34,(1). 单纸片扩散法（初筛试验） 将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、头孢噻肟（Cefotaxime,CTX)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、头孢泊肟(Cefprozil,CPD)、头孢西丁（Cefoxitin,FOX）纸片，置35过夜培养。 若抑菌环直径CAZ14mm、CTX14mm、CRO13mm、ATM15mm、CPD14mm、 FOX 14mm 且克拉维酸协同或增效试验阴性时可疑为产AmpC酶菌株。,2019,-,35,2019,-,36,克拉维酸协同、增效试验阴性是可疑为产AmpC 酶。,2019,-,37,2019,-,38,2019,-,39,2019,-,40,(2). 双纸片协同法（初筛试验）,将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含200g/片邻氯西林（又名氯唑西林）（Cloxacillin, CLO）纸片贴于MH平板中央，于邻氯西林纸片周围分别贴上头孢西丁、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟、头孢哌酮（CFP）纸片（纸片中心距离为1520mm），置35过夜培养，观察有无协同现象， CLO与任何一种超广谱-内酰胺类抗生素（ESC）有协同现象者可疑为产AmpC酶菌株。,2019,-,41,2019,-,42,2019,-,43,(3). 双纸片增效法,将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢西丁/邻氯西林、头孢他啶/邻氯西林、头孢噻肟/邻氯西林、头孢曲松/邻氯西林、氨曲南/邻氯西林、头孢泊肟/邻氯西林、头孢哌酮/邻氯西林纸片，置35过夜培养。与单纸片平皿对照，若加邻氯西林纸片较未加邻氯西林纸片抑菌环直径5mm，且对上述超广谱-内酰胺类抗生素（ESC）耐药，即为AmpC酶阳性。,2019,-,44,2019,-,45,（4）三维纸片法（初筛试验）,方法： 将0.5麦氏单位的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，贴一片头孢西丁(FOX)纸片（为待检菌耐药）于MH平板中央，用无菌纸片沾取待检菌贴在距抗生素纸片5mm处，置35过夜培养。 出现失状菌苔者为阳性。,2019,-,46,2019,-,47,(5). 三维沟槽法,三维实验是目前公认的测定质粒型或去阻遏（持续高产型）AmpC -内酰胺酶的经典方法，是唯一能够鉴别AmpC酶和其它头霉素耐药机理（如外膜通透性降低）的方法。,2019,-,48,a.三维试验法原理,标准大肠杆菌ATCC 25922对头孢西丁是敏感的，平皿上会出现2328mm的抑菌环，AmpC酶对照液加到槽中后，由于AmpC酶扩散到周围琼脂中破坏了头孢西丁(FOX)，因此槽周围会长出细菌，抑菌环缺损，形成一指向FOX的矢状菌苔，即AmpC酶阳性；而头孢西丁（头霉素）不会被ESBL水解，因此ESBL对照槽周围抑菌环是完整的，即AmpC酶阴性；如果待检菌沟槽处出现抑菌环的缺损，即为去遏制AmpC酶阳性，反之阴性。,2019,-,49,三维试验法原理,2019,-,50,2019,-,51,b.粗提酶制备,1）肉汤振摇培养、超声破碎、低温高速离心 （简称超声破碎法） 将1ml 0.5Mu的待检菌液接种于50ml MH肉汤中，36振摇培养24h后，于4条件，6000r/min离心30min，弃上清，用0.1mol/L pH7.0的PBS洗沉淀菌体2次，再用2ml PBS重新悬浮菌体细胞，在冰浴条件下用超声细胞破碎仪破碎菌体细胞（200W, 1min, 间歇1.5min, 共15次），再以 4条件，20000r/min离心60min，上清液即为待检菌的粗提酶液。取1滴粗提酶液接种于MH琼脂平板上，35培养24h后，以无菌生长为合格的粗提酶液。,2019,-,52,2）平皿(琼脂)增菌、冻融裂解、低速离心过滤法 （简称冻融裂解法） 将新分离的待检菌密涂于1/4 MH琼脂平板（=90mm）上，35培养24h后，用灭菌棉棒取下全部菌苔于1ml 灭菌生理盐水中（用1.5ml离心管），置-35低温冰箱冻融5次（要冻2h以上，再取出融化）， 在4条件下10000r/min离心15min，抽取上清液，用0.2m过滤器过滤，取1滴粗提酶液接种于MH琼脂平板上，35培养24h后，以无菌生长为合格的粗提酶液。,2019,-,53,2019,-,54,表2. 不同增菌方法及不同裂解方法结果比较,_ SHV-7 TEM-10 TEM-28 CTX-M-5 ACT-1 029M SHV-18 029 1194E _ 肉汤增菌 超声法 + + + + + + + 冻融法 + + + + + + + 琼脂增菌 超声法 + + + + + + + 冻融法 + + + + + + + _,2019,-,55,工 具,2019,-,56,2019,-,57,2019,-,58,2019,-,59,c.三维沟槽试验方法,将0.5麦氏单位的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含30g/片头孢西丁纸片（Cefoxitin,FOX）贴于MH平板中央，分别在距头孢西丁纸片5mm处，挖三个110mm的槽，槽内分别加入40l AmpC阳性对照菌、ESBLs阳性对照菌及待检菌的粗提酶液（超声裂解或冻融的菌液），置35过夜培养。,2019,-,60,2019,-,61,2019,-,62,2019,-,63,d.产酶结果判断,矢状菌苔超出槽外记为+; 矢状菌苔与槽平齐记为+; 矢状菌苔未到槽端记为+; 矢状菌苔不明显者记为; 无矢状菌苔者记为阴性。,2019,-,64,2019,-,65,e.持续型AmpC -内酰胺酶的确认,菌株对超广谱-内酰胺类抗生素（ESC）耐药；邻氯西林协同法和增效法阳性，或三维法阳性。可判定该菌为持续高产AmpC -内酰胺酶株。,2019,-,66,f.酶型检测,以阴沟肠杆菌029M为AmpC阳性对照，以肺炎克雷伯菌ATCC 700603为ESBLs阳性对照。方法：用灭菌棉棒沾取0.5Mu的大肠埃希菌ATCC 25922菌液均匀涂抹MH琼脂平板，10分钟后于平板中央贴一片30gCRO纸片，距纸片边缘5mm处垂直打4个1mm宽10mm长的槽，分别于槽内加40l粗提酶液、粗提酶液(36 l)+ CLO(4 l) 、粗提酶液(36 l)+CLA(4 l)及粗提酶液(36 l)+ CLO(4 l) + CLA(4 l) 后，置35培养24h。,2019,-,67,酶型判断,CLA单独加入时抑酶试验为阳性，即该菌ESBLs检测阳性。 CLO单独加入时抑酶试验为阳性，即该菌AmpC酶检测阳性。 CLO或CLA单独加入不能抑制酶活性（抑酶试验阴性），同时加入CLO和CLA时抑酶试验为阳性，说明该菌同时产生AmpC和ESBLs两种酶, 即SSBL检测阳性。当同时加入CLO和CLA时抑酶试验仍为阴性，该菌可能产生耐抑制剂广谱酶, 若被EDTA等抑制即为Metallo 内酰胺酶(MBL)。,2019,-,68,2019,-,69,表3. 三维试验结果与酶型判断,_ 水 解 抑制试验 酶 型 FOX CRO IPM CLA CLO CLA+CLO EDTA _ _ + _ + _ + _ ESBLs + + v _ + + _ MUT-AmpC + + v _ _ + _ MUT+ESBLs _ _ _ _ _ _ _ HYP-AmpC _ _ _ _ _ _ _ WT + + + _ _ _ + MBL v + v _ _ _ _ IRT _ *_:阴性. +:阳性. v:不定. MUT:持续高产AmpC. HYP:高诱导AmpC. WT:野生株. IRT:耐抑制剂.,2019,-,70,g. 三维试验法的影响因素:,(1)冻融菌量以1012cfu/ml(相当于1/4平皿菌量); (2)菌龄(24h96h)及冻融温度(-10 -80)对检 验结果无影响; (3)不同冻融液的冻融效果依次为NS、PBS和WS; (4)冻融次数以59次为好, 粗提酶液的加样量在 30 50 ul之间对检验结果无影响; (5) 粗提酶液中的残余活菌量106 cfu/ml时对检 验结果有影响。 (6)抗生素纸片与加样槽之间的距离以5mm为好; (7) CLO浓度在1.04.0 m mol/L 之间、 CLO与 酶作用时间在090之间对检验结果无影 响。,2019,-,71,（5）三维纸片法 （初筛试验）,2019,-,72,方法： 将0.5麦氏单位的标准大肠杆菌ATCC 25922菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，贴一片头孢西丁纸片（Cefoxitin,FOX）纸片于MH平板中央，用无菌纸片沾取待检菌贴在距抗生素纸片5mm处，置35过夜培养。 出现失状菌苔者为阳性。,2019,-,73,持续高产酶-O29M,2019,-,74,4. SSBL (Super-Spectrum Beta Lactermbses)测定,SSBL=ESBL+AmpC (1).在双纸片协同试验中,如CLA与CAZ、CTX、CRO、CPD、ATM不协同,而与FEP协同,该模式的细菌应为SSBL。 (2).在三维法试验中,以1:10比例将2000molL-1的酶抑制剂(邻氯西林或克拉维酸)与待检菌的粗提酶液混匀（不超过10分钟）后加入槽内,根据不同的反应模式判断细菌产酶的类型。,2019,-,75,2019,-,76,5. Metallo-内酰胺酶(MBL)测定,定义:活性部位带金属离子的酶类称金属-内酰胺酶(Metallo-lactamase, MBL), 这类酶不仅能水解碳青霉烯类而且能够水解其他广谱内酰胺类抗生素。,2019,-,77,(1)双纸片协同法:,将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，把含10g/片亚胺培南纸片（Imipenem,IPM）贴于MH平板中央，于亚胺培南纸片周围分别贴上CuCl2、HgCl2、FeCl2、EDTA-Na2(K2)（100mmol/L,5l）及巯基化合物（5l）纸片（纸片中心距离为24mm），置35过夜培养，观察有无协同现象，有协同现象者为Metallo -