分子生物学课件1幻灯片

第二章 染色体与DNA,主要内容：,染色体 DNA的结构 DNA的复制 原核生物和真核生物DNA复制的特点 DNA的修复 DNA的转座,二、真核细胞与原核生细胞染色体,真核细胞染色体：染色体存在于细胞核内，是极细微的线性构造，控制生命遗传，有“生命之线”之称。一般在细胞有丝分裂过程中才能被观察到，平时以较细且松散的染色质形式存在于细胞核中。,（一）真核细胞染色体,除性细胞外，真核生物体细胞染色体都是二倍体，在二倍体阶段，每个基因都有两个拷贝，其中的一个拷贝会通过配子（性细胞）从亲本传到子代，精、卵细胞结合形成合子（受精卵）,作为遗传物质，染色体具有特征： 分子结构相对稳定 能够自我复制，使亲子代之间保持连续性 能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程 能够产生可遗传的变异。,真核染色体,蛋白质,DNA,组蛋白 非组蛋白,蛋白质与DNA完全融合在一起，其蛋白质与相应DNA的质量比约为2比1,1、蛋白质,组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。 组蛋白所具有的特性： 进化上极端保守 无组织特异性 肽链上氨基酸分布不对称 具有甲基化、异己化、磷酸化及ADP核糖基化等修饰作用 富含赖氨酸的组蛋白H5还富含丙氨酸、丝氨酸及精氨酸,除大约与DNA等量的组蛋白外，还含有大量非组蛋白。非组蛋白占总组蛋白总量的60%-70%，种类很多，约20-100种。非组蛋白包含酶类，收缩蛋白、骨架蛋白、核孔蛋白等,2、基因组DNA,特点：含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。 重要概念： C值：一种生物单倍体基因组DNA的总量 （C值一般随生物进化而增加，高等生物C值低等生物） C值谬误：C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却具有很大的C值。,真核细胞DNA序列,不重复序列：一般只有一个或几个拷贝，占DNA总量40-80%。 中度重复序列：重复次数在10-104，占总DNA的10-40%。 高度重复序列：卫星DNA，只在真核生物中发现，占基因组的10-60%，由6-100个碱基组成，在DNA链上串联重复成千上万次。,3、染色质与核小体,由DNA和组蛋白组成的染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。,核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bp的DNA组成的，核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一个阶段。,真核生物基因组的结构特点： 真核基因组庞大，一般远远大于原核生物基因组 存在大量的重复序列 大部分为非编码序列占整个基因组序列的90%以上 转录产物为单顺反子 真核基因是断裂基因，含有内含子结构 存在大量的顺式作用原件（包含启动子、增强子、沉默子等） 存在大量的DNA多态性。 具有端粒结构。,（二）原核细胞染色体,原核生物没有真正的细胞核，DNA一般位于一个类似“核”的结构类核体上。细菌DNA是一条相对分子量在109左右的共价、闭合双链分子，通常也称为染色体。,原核生物的基因组很小，大多只有一条染色体，且DNA含量少。 原核细胞DNA特点： 结构简练 存在转录单元 有重叠基因,第二节 DNA结构,一、DNA一级结构,DNA一级结构：是指4种核苷酸（A、T、C、G）的连接及排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。,DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的空间结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，基本特点： DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成 DNA分子分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。 两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，组成有一定的规律。,二、DNA的二级结构,二级结构是指两条脱氧核苷酸反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。（1953年watson和crick发现的）,主链(backbone)： 由脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接而成。主链有二条,它们似“麻花状绕一共同轴心以右手方向盘旋, 相互平行而走向相反形成双螺旋构型。主链处于螺旋的外则,这正好解释了由糖和磷酸构成的主链的亲水性。 所谓双螺旋就是针对二条主链的形状而言的。 碱基对(base pair) ：碱基位于螺旋的内则,它们以垂直于螺旋轴的取向通过糖苷键与主链糖基相连。同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对。配对碱基总是A与T和G与C。碱基对以氢键维系，A与T 间形成两个氢键。,大沟和小沟： 大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。 在大沟和小沟内的碱基对中的N 和O 原子朝向分子表面。 结构参数 ：螺旋直径2nm；螺旋周期包含10对碱基；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。,三、DNA的高级结构,DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋和负超螺旋,双螺旋DNA拧紧则导致正超螺旋， 而双螺旋DNA的松开导致负超螺旋。 超螺旋DNA分子比松散分子能量高。对于负超螺旋，这一能量会使DNA螺旋易于局部解旋，负超螺旋有利于需要解旋过程的进行，如转录起始和复制起始。,第三节 DNA的复制,1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。,一、DNA的半保留复制（semi-conservative replication）,2、实验证据（1958 Meselson 和Stahl ）：,Matthew Messelson Franklin Stahl,3、DNA半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。,二、与DNA复制有关的物质,1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP) 2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA 3、RNA引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物 4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。,5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶 (1)都以dNTP为底物。 (2)都需要Mg2+激活。 (3)聚合时必须有模板链和具有3-OH末端的引物链。 (4)链的延伸都方向为53。,DNA 复制的主要 聚合酶，还具有3-5外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,修复DNA损伤,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,（中）,（很低）,（很高）,真核生物DNA聚合酶,DNA聚合酶是负责DNA复制主要的酶，参与先导链和滞后链的合成。 而DNA聚合酶的功能是补全去掉RNA引物后的缺口。,6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用,7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)： 主要功能是消除DNA解链过程中所 产生的扭曲力。,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。 例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶,8、DNA 解链酶（DNA helicase) 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解链酶，还有解链酶I、II、III。,rep蛋白沿前导链模板3 5移动， 解链酶I、II、III沿滞后链模板5 3移动。,9、单链结合蛋白(SSB蛋白)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,三、DNA的复制过程（大肠杆菌为例）,双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段,1、双链的解开,DNA的复制有固定的起始点，叫做复制原点。 ori(或o）、富含A、T的区段。,基本概念：,从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子,复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉,复制起点固定,1 原核一个复制子, 真核多个复制子 2. 一个复制子, (一般)两个复制叉; 3.前导链, 滞后链相对 4.在一个复制周期中, 真核为一次; 原核可同时进行多次复制, 形成多个复制叉,双链解开、复制起始,2、RNA引物的合成,DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。 引物长度约为几个至10个核苷酸，,DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication),DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。,在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。,3、DNA链的延伸,在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。,冈崎片段 1000bp2000bp (大 肠杆菌), 100200bp (真核生物),4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 （复制终止）,在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链,复制的终止,大肠杆菌,1 双链环状DNA 2. DNA复制形式为型 3. 定点(ori) 开始双向等速复制 4. 两个复制叉在距起始点1800处会合(Ter-Tus复合物阻止复制叉的移动)。 5. 只有一个复制单元，但可有多个复制叉。,双链环状、型复制、双向等速,DNA复制动画: /video/2008/2410.htm,四、复制的几种主要方式,1.线性DNA双链的复制 单一起点的单向复制。 (如腺病毒),多个起始点的双向复制（如真核生物）,单一起点的双向复制（如T7噬菌体）,2 环状DNA双链的复制,型复制（如大肠杆菌）-单一起点的双向等速复制, D-环型复制(单向)-线粒体, 滚环型复制 (单向)X174,滚环型： 单向复制的特殊方式 如：174的双链环状DNA复制型（RF）,（1）不需RNA引物，在正链3OH上延伸 （2）只有一个复制叉;,D环复制,单向复制的特殊方式 如：动物线粒体DNA,五、真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子 2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 3、真核生物有多种DNA聚合酶。,真核生物DNA聚合酶,DNA聚合酶是负责DNA复制主要的酶，参与先导链和滞后链的合成。 而DNA聚合酶的功能是补全去掉RNA引物后的缺口。,1.新链同时合成方向5 3 2. 前导链, 滞后链冈崎片段 1000bp2000bp (大 肠杆菌), 100200bp (真核生物) 3. RNA引物 的合成; DNA链的延伸; 引物的切除, 缺口补平, 连接.,半不连续复制,第四节 DNA的修复,1、错配修复,Dam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺甘酸甲基化 甲基化紧随在DNA复制之后进行 根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基,根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图,发现错配碱基,在水解ATP的作用下，MutS， MutL与碱基错配点的DNA双链结合,MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链,甲基化指导的错配修复示意图,错配碱基位于切口3下游端，,错配碱基位于切口5上游端，,2、碱基切除修复,一些碱基在自发或悠变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对,胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶,如果复制发生就会产生一个突变,.糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。,由AP磷酸内切酶将受损核甘酸的糖甘-磷酸键切开,。 DNA连接酶连接,利用DNA聚合酶I切除损伤部位，补上核苷酸,3、核苷酸切除修复,1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位 2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸 3） DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链 4）DNA连接酶将切口补平,识别损伤部位,损伤的两边切除几个核苷酸,DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链,DNA连接酶将切口补平,4 、DNA的直接修复,在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体,甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对,第五节 DNA的转座,（一）基本概念：,DNA的转座：由可移位因子介导的遗传物质重排现象。,转座子（transposon）：存在与染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。,1983. Barbara McClintock,DNA transposable elememt,冷泉港实验室,1983年，Mc