课件：肿瘤继承性免疫治疗.ppt

肿瘤生物免疫治疗,2009-12-19,2019,-,1,全球癌症趋势,今后20 年全球 新患人数每年1000万1500万 死亡人数每年600万1000 万 18th International Congress on Anti- Treatment ,Paris,2007,2019,-,2,中国癌症趋势,2000年 发病约180-200万 死亡140-150万 064岁人口中，1/4死于癌症 中国癌症预防与控制规划纲要（2004-2010）,2019,-,3,癌症的三大常规治疗,手术-破冰船,历史悠久 手术本身的两面性： 消除（降低）肿瘤负荷 促进转移的倾向 难以清除肿瘤微小转移灶 很多患者就诊时已失去手术最佳时机,2019,-,4,癌症的三大常规治疗,化疗-轰炸机,肿瘤内科治疗的基石 对肿瘤细胞的杀伤缺乏选择性 损伤正常组织 Goldie-Coldman假说及“一级动力学”理论：化疗对数杀灭细胞，不可能彻底清除肿瘤细胞,2019,-,5,癌症的三大常规治疗,1898 年发现镭 镭用于治疗肿瘤 放疗有效破坏或消灭癌细胞，甚至可以治愈部分肿瘤 放疗损伤机体正常细胞，降低机体免疫力,3放疗-太阳能,2019,-,6,肿瘤治疗的 现状,靶向药物,靶向药物,肿瘤生物治疗 是进一步提高疗效的 很有前景的方法,2019,-,7,目前癌症疗效的总体评估,“近20年来，我国癌症死亡率上升了29%，癌症治愈率(5年生存率)仍徘徊 在 20%-30%左右。其中肺癌仅10%，肝癌3%左右”。 -卫生部2006年中国慢性病报告 “近30年来，晚期转移肿瘤5年生存率基本上没有改变。这主要是由我们目前肿瘤治疗不当和过度治疗造成的。” -程书钧 院士,2019,-,8,癌症治疗的误区,注重肿瘤本身，想尽办法杀死肿瘤细胞 体内正常细胞被错杀 为什么要长肿瘤？,2019,-,9,癌症认识的误区,只有确切了解癌症，才可能找到治愈的方法 重大突破通常来源于认识上的巨大转变 细菌与感染的联系得到证实后，才意识到要治愈此类疾病便必须除去细菌。结果是促使抗生素的诞生，从而控制一系列的传染病,2019,-,10,癌症治疗的困境与未来,术后1 年复发率达60% 死于肿瘤复发和转移的人超过80% 彻底消灭癌细胞及体内不再产生癌细胞的“根治”任务很可能落在生物治疗身上,2019,-,11,癌症治疗的生物疗法,肿瘤生物免疫疗法成为最令人瞩目、最鼓舞人心的焦点，将成为21世纪人类攻克癌症具有战略意义的一个重要方面. 37-39届美国临床肿瘤学会（ASCO） 第7届中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会（CSCO）,2019,-,12,Strength (优势) 细胞免疫技术发展给成功的临床治疗带来可能性。 科学家和临床专家全力发展此技术 卫生部医政处也大力支持。己批准此临床技术,并核准收费标准,Opportunity (机会) 目前各研究所及医科大学各自为政地，并且各机构只有少量临床病例报道，因此给产业化，系统化发展带来可能。,肿瘤生物治疗现状,Weakness (劣势) 部分各科临床医师对此技术认知程度偏低 广大病人对此知识一无所知,Threat (威胁) 各单位技术力量大小不一，并参差不齐，易造成混乱，阻滞此技术的临床健康发展。,2019,-,13,政府全力支持 -卫生部文件,国家发展改革委、卫生部、国家中医药管理局关于印发全国医疗服务价格项目规范新增和修订项目（2007年）的通知 发改价格20072193号 新增项目 修订项目 第56条 310800024 细胞因子活化杀伤（CIK）细胞输注治疗 含药物加无血清培养基、体外细胞培养； 包括树突状细胞治疗(DC) 次 LAK细胞治疗酌情加收,2019,-,14,政府全力支持 -卫生部文件,医疗技术临床应用管理办法 卫生部明确国家建立医疗技术临床应用准入和管理制度，对医疗技术实行分类、分级管理。 医疗技术分三类管理 卫医政发(2009) 18号,2019,-,15,癌症治疗的生物疗法,肿瘤免疫的概念起源于本世纪初 1909年Ehrlich首先提出，免疫系统不仅负责防御微生物侵犯，而且清除机体内改变了的宿主成分 肿瘤生物免疫疗法已成为肿瘤治疗基础和临床研究的重要领域,2019,-,16,癌症生物治疗的分类-操作模式,非细胞治疗 抗体、多肽/蛋白质疫苗、基因疫苗、体内基因治疗等 可以规模化生产 有严格、均一的产品质量标准 主要由制药公司开发,细胞治疗 采集患者自体细胞进行制备，再回输给患者 无法规模化生产 更适于在医疗机构开展，完成从采集、制备到回输的全过程,2019,-,17,正常机体免疫系统识别和清除突变细胞：免疫监视 免疫逃逸的机理还不很清楚，但主要的机制与CD8+T细胞不能有效地清除肿瘤细胞有关,2019,-,18,肿瘤免疫治疗的三种新途径-针对肿瘤免疫逃逸,增强免疫应答,间接作用 如抑制血管生成,直接抑制肿瘤生长,毒素 放射性核素 药物,细胞介导免疫治疗 过继性免疫细胞治疗 供体淋巴细胞输注 肿瘤疫苗,2019,-,19,限制肿瘤免疫应答的因素,2019,-,20,免疫均衡与免疫逃逸,淋巴细胞因素,肿瘤细胞因素,2019,-,21,肿瘤过继性免疫治疗,体外分离细胞,离体培养、扩增、活化,自体或(同种异体)回输,诱发机体特异性抗肿瘤免疫,2019,-,22,淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 树突状细胞（DC） 共培养免疫细胞 (DC-CIK) 自然杀伤细胞型的淋巴细胞(NKT),肿瘤过继性免疫治疗,2019,-,23,淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 树状突细胞（DC） 双克隆免疫细胞 (DC-CIK),肿瘤过继性免疫治疗,2019,-,24,淋巴因子激活的杀伤细胞 lymphokine-activated killer cells, LAK,1980年，Rosenberg实验室首报荷瘤小鼠的脾脏淋巴细胞和肿瘤患者外周血淋巴细胞在含有IL-2的条件下，短期培养后可诱导出一种非特异性的杀伤细胞，能杀伤新鲜分离的实体瘤细胞和体外培养的多种肿瘤细胞 目前尚未发现LAK细胞特有的表面标志 LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。,2019,-,25,LAK的临床应用 1984年Rosenberg研究组首次应用IL-2与LAK协同治疗25例肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、肝癌/结肠癌等患者 LAK细胞0.618.41010 IL-2 2.81053.3106U/kg 11例肿瘤缩小超过50，1例黑色素瘤完全消退,2019,-,26,LAK的临床应用 1988年用IL-2与LAK细胞协同治疗222例 16例转移灶完全消退 26例肿瘤消退50以上 对转移性肾细胞癌、黑色素瘤、肝癌、结肠癌和非霍奇金淋巴瘤疗效较显著,2019,-,27,LAK的临床应用 乳腺癌、膀胱癌局部联用IL-2也获得明显疗效 由于IL-2用量大，一些病例出现较大毒副反应,2019,-,28,异体LAK： 采用抗原性较弱的5个月以内胎儿的脾细胞、肝细胞和胸腺细胞 体外诱导培养后具有很强的LAK细胞活性 出现早而持久，不易引起移植排斥反应 骨髓细胞用rhIL-2培养后有很强的LAK活性，比外周血来源者强而持久； 胎儿脐血细胞经IL-2诱导后，LAK活性也明显强于成人。,2019,-,29,淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 树状突细胞（DC） 双克隆免疫细胞 (DC-CIK),肿瘤继承性免疫治疗,2019,-,30,肿瘤浸润淋巴细胞 tumor infiltrating lymphocyte, TIL,1986年Rosenberg研究组首先报道 从肿瘤局部分离出TIL，加入高剂量IL-2体外培养，残存的肿瘤细胞713天全部死亡。 从手术切下的肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中获得淋巴细胞，加IL-2培养后，其生长、扩增能力强于LAK细胞 14例转移性肺癌等晚期肿瘤患者,其中4例肿瘤缩小50以上，副作用明显低于IL-2/LAK疗法。,2019,-,31,肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗转移性黑色素瘤,2002. Science,2019,-,32,2007年，法国热那亚大学细胞与基因治疗中心对用TIL+IL-2治疗过的期黑色素瘤进行了长期随访，发现经治疗过的只有一个淋巴结转移的患者其复发率明显低于对照组，总生存期也明显长于只用IL-2治疗的患者。,肿瘤侵润性淋巴细胞,2019,-,33,2007年南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤中心刘宝瑞等用快速制备自体肿瘤浸润淋巴细胞方法联合白细胞介素2胸腔输注治疗癌性胸腔积液、2001年江西省萍乡市人民医院肿瘤科用TIL/ LAK治疗恶性浆膜腔积液38 例等报道，他们发现经过TIL治疗后，患者生活质量明显提高,体力状况得到恢复，有效患者随访中治疗侧胸腔未再出现胸腔积液或胸腔积液量增加,治疗后除少数病例短时间内出现可耐受的低热及胸痛外,无一例出现其他不良反应。,肿瘤侵润性淋巴细胞,2019,-,34,淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 树状突细胞（DC） 双克隆免疫细胞 (DC-CIK),肿瘤继承性免疫治疗,2019,-,35,细胞因子诱导的杀伤细胞 Cytokine-induced killer cell, CIK,由-IFN、TNFa 、CD3单抗、IL-1、IL-2等在体外诱导并大量扩增的具有杀伤肿瘤活性的细胞 1991年斯坦福骨髓移植中心首先报道 1994年Schmidt-wolf报道了体外大量增殖CIK细胞的方法。 是目前国际上广泛应用的肿瘤免疫治疗手段,2019,-,36,细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK),2019,-,37,分2-3次静脉回输体内,采集病人外周血单个核细胞,加入多种细胞因子培养,扩增、活化、诱导成为CIK细胞,发挥抗肿瘤作用,到达病变部位直接清除残存肿瘤细胞 调节和增强全身免疫机能 防止肿瘤复发及转移,2019,-,38,CIK细胞的特点 1）高增殖活性：培养第18-22天达顶峰； CD3+CD56+细胞增加1000-6000倍； 28-30天达平台期，细胞毒活性亦达峰值 2）高细胞毒力 CIK细胞的肿瘤细胞抑制指数为1.5-3.5， LAK细胞为0.5-1.5； 3）杀瘤谱广泛：非MHC限制性,2019,-,39,4）细胞来源丰富 正常或患者的骨髓单个核细胞或外周血单个核细胞、干细胞均可诱导获得CIK细胞； 5）对多耐药性肿瘤细胞同样敏感 6）不受免疫抑制剂CSA、FK506影响 7）抵抗肿瘤细胞诱发的效应细胞Fas-FasL凋亡， 细胞内表达抗凋亡基因和保护基因 8）对正常骨髓前体细胞毒性很小,2019,-,40,256例各种中晚期肿瘤患者（乳腺癌、肺癌、肠癌、肝癌、胃癌、淋巴瘤等）1-4疗程CIK治疗 部分缓解和轻度缓解为207例（80.86%） 1年生存期为96.06% 2年生存期为92.96% 3年生存期为88.38% 生存质量卡氏评分提高率为88.28% 无心、肝、肾不良反应，仅数例有一过性发热，24小时即正常,国内2003年报道,2019,-,41,CIK细胞治疗癌性胸、腹水,136例癌性胸水 61例完全消失 57例显著减少 有效率86.8%,83例癌性腹水 26例完全消失 44例显著减少 有效率84.3%,2019,-,42,1999年，德国柏林Freie大学Schmidtwolf等人报告用自身CIK细胞治疗10例肿瘤肿瘤患者，结果1例完全缓解，3例稳定。2005年，美国斯坦福大学医学中心Leembuis T等人用自身CIK（1109-1010）治疗9例霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，结果2例部分缓解，2例稳定，5例无反应，无严重毒副作用。2007年，意大利卡利亚里骨髓移植中心用供者CIK细胞治疗11例恶性血液疾病，结果病人能够耐受治疗，有助于控制疾病复发。,CIK细胞治疗,2019,-,43,淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 树突状细胞（DC） 双克隆免疫细胞 (DC-CIK),肿瘤过继性免疫治疗,2019,-,44,树突状细胞（dendritic cell, DC）,应用负载肿瘤抗原的树突状细胞 激发机体产生肿瘤特异性CTL 有效地杀伤肿瘤细胞 建立持久的抗肿瘤的特异性免疫应答,2019,-,45,DC研究历史,美国学者Steinman及Cohn于1973年发现 1992年Steinman建立了应用GM-CSF从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法 此后建立并完善了多种培养扩增DC的方法 DC的研究得以深入,2019,-,46,2009年，英国伯明翰英国癌症研究临床试验组的Palmer等人用肝癌细胞株溶胞产物致敏DC治疗35例晚期肝癌病人 部分缓解和病情稳定者10例 4例AFP明显下降 7例T细胞对AFP有免疫反应,DC细胞 - 近期研究,2019,-,47,DC细胞的基本特征,体内功能最强的抗原提呈细胞 显著刺激初始型T细胞增殖 机体免疫反应的始动者 在免疫应答的诱导中具有独特的地位,2019,-,48,DC对抗原的加工处理与提呈,DC与T细胞接触 表面的MHC-肽复合物被T细胞识别 将抗原信息传递给T细胞抗原提呈,2019,-,49,树突状细胞与T细胞的作用,2019,-,50,脑以外的全身各脏器 皮肤、肝、脾、骨髓、淋巴器官和外周血中 仅占人外周血单个核细胞的1左右 外周血中有很多DC前体细胞，在体外诱导成DC,DC的组织分布,2019,-,51,2019,-,52,2019,-,53,肿瘤抗原致敏患者自身的树突状细胞 制备成瘤苗(或细胞悬浮液)回输患者,DC细胞治疗肿瘤的方案和途径,2019,-,54,树突状细胞（DC）治疗流程图,收集患者外周血单个模细胞PBMC,抗原致敏的DC,体外细胞因子刺激,回输给 同一患者,相关多肽致敏,2019,-,55,机理,2019,-,56,淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 树状突细胞（DC） 共培养免疫细胞 (DC-CIK),肿瘤继承性免疫治疗,2019,-,57,共培养免疫细胞 (DC-CIK),共培养免疫细胞 (DC-CIK) 树突状细胞 (DC) +细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) DC 和 CIK 是肿瘤免疫治疗的两部分 DC 识别病原, 激活获得性免疫系统 CIK通过发挥自身细胞毒性与分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞 二者联合确保有效和谐的免疫反应之完成,2019,-,58,共培养免疫细胞 (DC-CIK) 大容量体外CIK细胞扩增技术诱导CIK细胞 按一定比例与DC细胞混合培养 得到一种新的抗肿瘤免疫活性细胞群 DC-CIK疗法拥有更强的增殖能力及特异性识别杀伤肿瘤细胞之特性,共培养免疫细胞 (DC-CIK),2019,-,59,2008年中国科学院生物物理研究所邓笑伟等用不同来源的CIK和DC联合治疗21例中晚期肺癌，结果CR 2例, PR 7例,SD5例, PD 7例, 有效率为42.9% ,临床获益率( CR + PR + SD ) 为66.7%，细胞回输后主要不良反应为一过性发热。,CIK-DC共培养细胞治疗,2019,-,60,Barry等（匹兹堡大学肿瘤研究所2003年） 15例转移性乳腺癌回输NK细胞 4例完全缓解，耐受性良好，无毒副作用,NK细胞,2019,-,61,Koehl等（德国法兰克福大学医院2004年） 3例ALL干细胞移植病人NK细胞+IL-2治疗 患儿能充分耐受,NK细胞,2019,-,62,Miller等（明尼阿波利大学肿瘤中心2005年） NK细胞联合CTX+Fludarabine治疗19例AML 5例血液学完全缓解,NK细胞,2019,-,63,Arai等（芝加哥Risb大学医学中心2008年） 同种异基因细胞系NK-92治疗12例晚期肾癌和黑色素瘤病人 1例完全缓解，1例稳定，1例为混合反应,NK细胞,2019,-,64,Kobayashi等（东京女子医学大学2007年） 自身T细胞治疗7例进展期肺癌 治疗后患者T细胞明显增多 无明显毒副作用。,T 细胞,2019,-,65,Bennouna等（2008年，法国） 自身T细胞（8109）+IL-2 10例转移性肾癌患者 6例患者治疗后25.7周内病情稳定 仅出现感冒样症状,T 细胞,2019,-,66,Okai等（澳大利亚昆土兰州医学研究所2002年） 半乳糖神经酰胺（-galcer）荷载DC 4例癌转移患者 治疗后病人NKT细胞明显增多 患者未出现不良反应,NKT 细胞,2019,-,67,Shikawa等（神奈川县千叶大学医院2005年） -galcer荷载DC 9例复发性非小细胞肺癌 治疗后5例病情稳定 未出现不良反应,NKT 细胞,2019,-,68,2008年，千叶大学医院 -galcer荷载DC 9例头部肿瘤 1例部分缓解 4例稳定,NKT 细胞,2019,-,69,DC-CIK免疫治疗联合常规治疗方法,2019,-,70,DC-CIK 治疗与常规治疗方法比较,2019,-,71,CD3AK细胞：免疫原性较强的肿瘤（具有T细胞受体（TCR）除外） CIK细胞：各种肿瘤，对低表达MHC分子更有效 T细胞：各种肿瘤，对呼吸系统、消化系统和生殖系统以及部分血液恶性疾病疗效好 树突状细胞：成熟DC可与各种细胞联合应用，增强抗肿瘤免疫效果 树突状细胞疫苗：可以预防和治疗相应的各种肿瘤 NKT细胞：对消化系统尤其是肝癌和呼吸系统肿瘤以及头颈部肿瘤效果好 NK细胞：对不表达MHC分子的肿瘤效果好 巨噬细胞：型M具有一定的抗肿瘤作用，可一其他免疫细胞联合应用,免疫细胞和细胞群抗癌谱,2019,-,72,免疫联合治疗,CIK细胞 DC-CIK共培养细胞 DC联合CIK细胞 CD3AK细胞 DC疫苗联合CIK、CD3AK细胞 共刺激T细胞 巨噬细胞联合CIK细胞 肿瘤特异性T细胞联合NK、T细胞、NKT细胞 ,2019,-,73,细胞培养实验场所,细胞培养场所条件: 符合GMP要求 按照品质管理架构之模式管理。,GTP细胞培养/治疗流程 实验室管理流程 生物安全实验流程 消毒程序与周期流程 维护和性能验证程序,设备3Q品质验证 设备清洁和维护保养 试剂、耗材的外购品质检测流程,最终细胞产品检测流程: 用常规方法进行细菌和真菌培养试验 用鲎试剂法进行内毒素检测 用功能性杀瘤实验法进行杀伤活性检测 用流式细胞仪进行表面标记检测 用常规方法检测细胞总数、细胞存活率、特定生物活性效价,2019,-,74,各种细胞回输方法,2019,-,75,CIK细胞制备培养,2019,-,76,第10天培养瓶内DC细胞收集、离心、洗涤和回输,第3天补充含半量细胞因子的培养基，并加肿瘤抗原,第6天补充培养基，加TNF-，抽样送检（细菌培养和表型分析）,75cm2培养瓶1640培养液,2000g15min， 20,留血浆50ML备用,分离出6ml富含白细胞的血液,淋巴细胞分离液,PMNC层,用血液保养袋采集200ML外周血,细胞贴壁120min,贴壁细胞进行 DC细胞培养方案,悬浮细胞 进行CIK培养方案,树突状细胞制备流程,2019,-,77,癌症生物治疗的优点,1）应用范围广几乎可以应用于所有肿瘤患者。 2）对原发肿瘤转移肿瘤均有明显疗效 3） 对于手术后的恶性肿瘤患者的残存肿瘤细胞的清除预防肿瘤 的复发有着比化疗更明显的作用。 4）副作用小，目前仅发现有发烧类似感冒的副作用。 5）不损伤正常组织并能提高机体免疫力和改善身体状况的作用。生物治疗具有无创伤无痛苦安全无副作用等特点，是未来肿瘤治疗的重要发展方向。 特异性强 适应症广 延长生命性强 抗复发性强 安全性好 (副作用低 几乎没有) 合适的费用,2019,-,78,适应症,主要用于恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、各种肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发； 也可以用于多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤缓解期进一步预防复发；还可以用于上述实体瘤缓解期进一步巩固治疗或上述晚期肿瘤配合放化疗、介入治疗、热疗等方法，达到延长生存期、提高生活质量和控制肿瘤进展的目的。,2019,-,79,适应症,A、适合免疫治疗者：年龄大于16岁；病理组织学或细胞学确诊为肿瘤患者生活自理，卡氏体力状况评分标准60分以上；预计生存期至少大于6个月；签署知情同意书；放化疗结束一个月以上的；如若可以接受手术治疗或其它方式能够获得一定数量的肿瘤组织件或细胞的患者最佳。,2019,-,80,不适合症,不适合免疫治疗者：怀孕或哺乳期妇女；器官功能衰竭者：心脏：IV级以上；肝脏：达到国内肝功能分级C级以上；肾脏：肾功能衰竭及尿毒症期以上；肺：出现严重的呼吸衰竭症状，并累及到其他脏器，如肝、肾功能；脑：脑转移并伴意识障碍者；脏器移植者；长期使用免疫抑制药物或正在使用的自身免疫性疾病患者；精神疾病者，发生急性肝炎或其他急性感染病活动期；对本治疗中所用生物试剂过敏者。 治疗者中途撤出者：病情恶化；患者产生无法忍受的副作用; 患者要求退出治疗。,2019,-,81,禁忌症:,病人生命体征己出现衰竭的现象 病人处于怀孕期和哺乳期 病人明确诊断肉瘤(除恶性黑色素瘤) 病人明确诊断软骨瘤 病人明确诊断原发性颅内肿瘤,2019,-,82,肿瘤临床分期及治疗原则:,2019,-,83,肿瘤临床分期及治疗原则:,2019,-,84,肿瘤临床分期及治疗原则:,2019,-,85,（一）常规检查评估 影像学检查（磁共振、CT、petCT、彩色多普勒等根据实体瘤疗效评价标准进行评价 肿瘤志物检测 病人体力状况（WHO、五分法、KPS、百分法） 参考实体肿瘤疗效评估标准（REIST1.1 版标准）,免疫治疗后的疗效评估,2019,-,86,免疫治疗后的疗效评估,（二）细胞免疫功能监测 1、细胞免疫功能检查百分数和绝对值： CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+（绝对值为百分数 乘以淋巴细胞绝对数，血常规均有淋巴细胞绝对数） 2、NK细胞亚群百分数和绝对值： CD3+CD16+CD56+；CD3-CD16+CD56+； CD3+CD16+CD56-