il-1对椎间盘退变影响课件

白细胞介素-1对椎间盘退变 的影响,幸泽艇 南昌大学一附院疼痛科,白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1),退变椎间盘:主要由软骨细胞合成分泌， 突出椎间盘:由巨噬细胞、成纤维细胞、内 皮细胞等合成分泌。,软骨细胞,巨噬细胞,单核-巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞、以及组织内的巨噬细胞(M)。 单核-巨噬细胞是自体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用。,成纤维细胞,成纤维细胞及周围的胶原纤维,分成纤维细胞和纤维细胞成纤维细胞是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小色深，核仁不明显，胞质少。二型细胞可互相转化。,IL-1的结构,IL-1因子家族: 包含11个蛋白，由11个不同基因编码 （人IL-1, IL-1,IL-1Ra, IL-18,和IL-1F5至IL-1F11, 大鼠IL-1A至IL-1f11）E. Dunn 2001Y 、T. T. Pizarro 2007Y、J. E. Sims 2001Y 。 人和小鼠IL-1基因定位于2号染色体(2q13-21)，均含7个外显子。 Dongli Wang 2010Y、 Axel Weber 2010Y,John E. Sims, Martin J.H. Nicklin, J. A new nomenclature for IL-1-family genes. TRENDS in Immunology Vol.22 No.10 October 2001,IL-1基因家族成员,IL-1基因家庭主要成员： IL-1（IL-1、IL-1）、IL-1受体（IL-1R、IL-1R）和IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra、IL-1Ra）。 IL-1的受体辅助蛋白为IL-1RacP及其抑制剂sIL-1RacP； IL-1两型与IL-1R 两型均可相互作用并激活9。,Theresa T. Pizarro and Fabio Cominelli.Cloning IL-1 and the Birth of a New Era in ytokine Biology. J Immunol.2007;178;5411-5412,抑制IL-1步骤,在IL-1Ra完全抑制IL-1的过程分两个互补的步骤。 IL-1Ra捕获IL-1与IL-1R结合而抑制IL-1的； IL-1Ra隔离IL-1RacP而抑制IL-1形成IL-1-IL-1R-IL-1RAcP，属于竞争性抑制10-14。 IL-1Ra不诱发细胞内的反应，仅作为IL-1的活性抑制剂15 。,IL-1空间结构,2010年Dongli Wang等8研究发现了IL-1与其受体IL-1R和IL-1RacP所组成的三元复合物的晶体结构，通过生化分析，揭示了IL-1结合并激活其受体的结构机理。IL-1R和IL-1RacP均有三个域（D1、D2、D3），其复合物按照左手结构与IL-1发挥作用。IL-1和IL-1作用位点均位于Asp145，IL-1R和IL-1R均位于D2和D3域之间，且与IL-1（IL-1、IL-1、IL-1Ra）作用，引起信号通路反应，按照左手规则形成三元复合晶体结构IL-1-IL-1R-IL-1RacP复合物，并激活后刺激细胞炎性反应8。家族中其他白细胞介素也有类似作用区域，可能结合位点、化学键及构象稍有不同。,IL-1、IL-1、IL-1R、IL-1Ra结构,Axel Weber,Wasiliew P,Kracht M, Michael KrachtInterleukin-1 (IL-1) Pathway. Science Signaling,2010,3(105):cm1.,Axel Weber,Wasiliew P,Kracht M, Michael KrachtInterleukin-1 (IL-1) Pathway. Science Signaling,2010,3(105):cm1.,Axel Weber,Wasiliew P,Kracht M, Michael KrachtInterleukin-1 (IL-1) Pathway. Science Signaling,2010,3(105):cm1.,类风湿性关节炎中IL-1,在类风湿性关节炎（RA）的关节内可出现多种多样的细胞因子，其中很重要的一个是IL-1,它由A型滑膜细胞或其他单核细胞所分泌。 它的作用是多方面的，其中主要的有： 促使前列腺素代谢 造成局部炎症趋化 促进胶原酶产生造成关节破坏，骨和软骨的吸收 使肝细胞合成急性期蛋白，导致发热 同时也促进其他细胞分泌某些细胞因子如IL-6等以加重RA的炎症和关节的破坏。,退变椎间盘中IL-1分子生物机制,IL-1在炎性反应开始和发展阶段中其起着重要的作用8。 早在1996年Hiroshi等17 已经证实了髓核组织中有IL-1和IL-1表达 而Ozaktay等18证实IL-1在椎间盘退变过程中扮演着重要角色。 8、Dongli Wang, Senyan Zhang，Xinquan Wang，et al.Structural insights into the assembly and activation of IL-1b with its receptors.Nature Immunology,2010,11(10):905-911. 17、Hiroshi T,Toru S,Yikikazu O,et alInflammatory cytokines in the ruptured intervertebral disc ofthe lumbarspineJSpine，1996，21(2)：218-224. 18、Ozaktay AC,Cavanau JM,Asik I,et a1.Dorsal root sensitivity to interleukin-1 beta、 intervertebral-6 and tumor necrosis factor in ratJ.Eur Spine，2002，11(5)：467-475.,IL-1分子生物机制 基质蛋白的基因表达,2005年Le Maitre等19研究发现 人椎间盘退变过程中产生了IL-1，以及局部细胞因子诱导退变椎间盘，其细胞和基质发生了改变。 用IL-1激动剂刺激正常和退变椎间盘细胞，产生了IL-1及其抗体、活性受体和IL-1变构酶。 除外IL-1Ra，这些蛋白的免疫活性随着退变程度增加而上升。 结果：人退变椎间盘细胞产生的IL-1导致基质金属蛋白酶（MMP-3、MMP-13和ADAMTS-4）基因表达增加，以及基质（明胶、型胶原、型胶原和SOX6）的基因表达减少，而且导致分解和合成代谢不平衡，从而促进退变反应。,基质会属蛋白酶(MMPs)及抑制剂（TIMPs）,基质会属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)为Zn2+、Ca2+金属离子依赖的蛋白水解酶类，是自然界高度保守的一类酶，可降解除蛋白多糖以外细胞外基质的所有成分，并激活其他MMPs产生连锁放大效应，是调节细胞外基质动态平衡最为重要的酶。MMPs以酶原的形式分泌，水解掉N端的半胱氨酸后被激活，使催化性Zn2+结合位点暴露。 基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)是MMPs活性调节的重要途径，是MMPs的特异性抑制剂。已知TIMPs家族有四个成员，其中研究较多的是TIMP-l和TlMP-2。 【22胡有谷腰椎问盘突出症【M】第三版北京：人民卫生出版社，2004，84-179】。,IL-1分子生物机制 IL-1与Sox9和型胶原表达的关系,椎间盘退变最显着的生物变化是软骨细胞特定基因和Sox9、型胶原蛋白质的表达减少。正常椎间盘组织IL-1不表达，但在退变椎间盘组织表达增加。这提示IL-1参与调控Sox9和型胶原的表达。 YU ZG等20研究证明了 IL-1以前未知的作用：通过IL-1刺激椎间盘细胞可下调Sox9和型胶原的mRNA水平及蛋白表达，呈剂量依赖性，且这种下调作用可以被一种有效的NF-B活性抑制剂姜黄素减弱。 因此姜黄素能维持椎间盘内适当的基质成分及含量，有望用于抑制椎间盘退变。,Sox9基因,近年研究还发现39遗传因素在椎间盘退变中也具有一定的影响作用。众所周知，蛋白质的产生是由编码该蛋白质的特定基因决定的，同样椎间盘蛋白质及蛋白多糖的产生也受某些基因的调控。年龄的增加、外伤、细胞因子紊乱等会影响这些基因的表达，从而引起椎间盘基质的改变。 目前研究较多的是SOX9，Gmber等40研究发现，随年龄增加和退变的加重，SOX9基因在人椎间盘纤维环细胞中的表达也逐渐递减。这提示SOX9基因可能在椎间盘退变过程中发挥重要作用。这些研究为基因治疗椎间盘退变性疾病提供了一种极有潜力的候选目的基因。 39.谭平先，李健遗传因素在退变性椎间盘疾病中的研究现状J中国矫形外科杂,2006,14(5):387-389. 40.Gruber HE，Noeton HJ，IngramJ A，et al.The SOX9 transcription factor in the human decreased immunolocalization with age and disc degenerationJSpine，2005，30(6)：625-630,IL-1分子生物机制 IL-1和TNF表达之间的关系,2007年Le Maitre等21 研究发现在IL-1的基因表达率:椎间盘内:肿瘤坏死因子=79:59）。基因表达水平:退变椎间盘为1300 copies/100ngcDNA) TNF-为250 copies of TNF/100 ng cDNA， IL-1受体基因表达:退变椎间盘:正常组=10倍，同时病变椎间盘组内两种细胞因子均较正常组水平高。 另外，80%退变椎间盘细胞显示IL-1受体有免疫活性，而正常椎间盘仅有30%。在退变或突出椎间盘内观察，没有发现肿瘤坏死因子受体I型基因增加和蛋白质表达增多。 Millward-Sadler等22 研究发现，IL-1比TNF-上调MMP-3和MMP-9基因表达水平更高，而MMP-13被每个因子上调到一个相似的程度。TNF-和TNF-R2的表达均被TNF-和IL-1上调，而无论哪个细胞因子对TNF-R1的表达均无明显影响。而IL-1和IL-1Ra的表达也被TNF-显著上调，但IL-1和IL-1R1的不变。 结果:TNF-不如IL-1诱导MMPs表达程度高，但它确实采取行动上调IL-1以及TNF-和TNF-R2的表达，这样将增加炎症环境和基质加速退化。这些研究结果均支持这一假设：TNF-在基质退变中是一个很重要的始动因子，而IL-1在椎间盘病理性退变发展过程中起着更大的作用。,IL-1和TNF表达之间的关系,原位酶谱（ISZ）用于研究IL-1和TNF在基质降解中的作用，用此来描述有症状的椎间盘退变。Hoyland等23首次研究发现，虽然IL-1将刺激、IL-1Ra将抑制人体完整椎间盘组织中的基质降解，但均不能测量到TNF-、抗TNF对这些基质降解作用。因此介导椎间盘基质降解的IL-1起着关键的作用。,IL-1分子生物机制,由此可见，炎性因子IL -1、TNF、NF B均参与椎间盘退变的发病机制， 但IL-1对细胞外基质的降解影响更大，因此其导致椎间盘病理退化作用更重要。,IL-1在椎间盘退变中宏观作用 IL-1对基质代谢的影响,合适有活性的型胶原和蛋白多糖的含量对维持椎间盘的生物学功能至关重要，特别是在髓核中。 退变时基质合成酶的变化，导致了胶原蛋白型和的合成增加，蛋白多糖产生减少，髓核成分的改变加重了退变。 基质降解酶的表达合成增加（包括MMPs和ADAMTSs等），超过天然抑制因子（如TIMPs），使基质降解增加，IL-1参与调节了这个过程。,IL-1对基质代谢的影响,2007年Le Maitre等24研究表明，退化的椎间盘中IL-1增加，但抑制剂IL-1Ra没有相应增加。此外，用IL-1刺激人类椎间盘细胞导致基质基因表达减少和MMPs、ADAMTSs表达增加。 Le Maitre等25首先发现了完整的椎间盘细胞产生明胶、酪蛋白、型胶原降解酶；IL-1输入正常椎间盘内将诱导这些酶表达；IL-1Ra靶向输送到退变椎间盘病变部位将几乎完全减弱这些酶的活性。 Iida等26研究结果显示蛋白激酶受体-2（PAR-2）在大鼠椎间盘纤维环和髓核组织细胞中均表达，IL-1上调PAR-2的表达。PAR-2AP显著增加IL-1的释放并成为炎性介质。虽然PAR-2AP对MMP-3和MMP-13mRNA水平没有直接的影响，但用PAR-2AP治疗显著上调ADMTM-4mRNA水平。PAR-2AP和IL-1可以协同上调ADMTM-4、MMP-3、MMP-13mRNA水平。PAR-2的表达提示人椎间盘组织也可能存在。较退变早期，椎间盘退变严重阶段表达PAR-2的细胞数量显著升高。 Studer等27研究发现激活椎间盘p38蛋白激酶（p38MAPK）的活性可阻断IL-1炎性反应，因此设计使p38沉默的疗法可以帮助保护椎间盘细胞合成分解代谢的平衡。,IL-1对基质代谢的影响,因此，IL-1在炎性反应过程中不但影响基质成分、含量，而且还刺激MMPs的表达，也影响蛋白酶的活性及其对基质的降解作用，加速椎间盘退变。,IL-1在椎间盘退变中宏观作用 IL-1对神经调节的影响,Purmessu等28研究显示 椎间盘细胞均表达神经生长因子（NGF）和大脑衍生神经营养因子（BDNF） 非退变和退变椎间盘细胞内Trk-A、Trk-B的表达, 表明生理条件下椎间盘存在神经内分泌情况。 IL -1增强NGF及TNF作用的神经肽的表达，提示IL-1和TNF在调节椎间盘内神经生长及其在下腰痛的作用。 IL-1对NGF的表达可能起一个关键调节器的作用，而TNF通过P物质调节伤害性感受器可能起支配作用。,神经生长因子（NGF）,神经生长因子（NGF）是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。 NGF包含、三个亚单位，活性区是亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，与人体NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性。,神经生长因子的作用机理,NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇钙、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。,IL-1对神经调节的影响,IL-1不仅本身可致痛还可刺激某些疼痛介质如PIA2和前列腺素E2(PGE2)的合成，还可与突出的椎间盘压迫神经根一起导致神经根性疼痛。 Ozaktay A C，Cavanau J M，Asik I，et a1Dorsal root sensitivity to interleukin-1 beta，interleukln-6 and tumor necrosis factor in ratJEur Spine，2002，11(5)：467-475,IL-1在营养与凋亡中的作用,椎间盘营养缺乏，可造成毒性降解产物堆积。IL-1是否诱导椎间盘细胞凋亡，目前相关研究较少。 Zhao等29的研究表明，血清剥夺24小时导致培养的椎间盘细胞凋亡率增加，IL-1明显增加血清剥夺后的细胞核凋亡数目和对caspase-3活性影响，并呈剂量依赖性。单IL-1是没有足够的刺激来诱导椎间盘细胞凋亡；为了抑制椎间盘细胞凋亡，提高椎间盘营养供应可能比拮抗IL-1更有效。 现在公认IL-1介导的软骨细胞破坏是类风湿性关节炎的重要发病环节，在椎间盘内IL-l可抑制软骨细胞增殖，介导释放大量氧自由基和一氧化氮（NO），NO是IL-1诱导软骨细胞凋亡的效应分子，而氧自由基也在细胞凋亡中发挥重要作用，因此阻断IL-1的生物学效应，可抑制细胞凋亡。,生物力学,慢性炎性反应和机械过度负荷被认为是椎间盘退变的因素。 生物力学和生物化学因子在椎间盘退变起了作用，但是研究有限。 生物力学方面，椎间盘在躯干弯曲或扭曲时受剪切应力作用。 生物化学方面， 在椎间盘内发现了IL-1,其提高金属蛋白酶的表达。 因此提示椎间盘细胞可能受剪切力和钙信号反应的IL-1作用。,Elfervig等30首次研究 记录人椎间盘细胞生物力学和生物化学联合的信号反应。IL-1似乎使纤维环细胞对生物力学负荷敏感，即提示在机械负荷作用下炎性因子反应性增加，纤维环细胞对剪切力的敏感性在炎性反应时也增加，并可能影响椎间盘退变的开始和进程。 30、Elfervig MK,Minchew JT,Francke E,et al.IL-1 Sensitizes Intervertebral Disc Annulus Cells to Fluid-Induced Shear Stress. J Cell Biochem,2001,82(2):290-298.,生物力学,Elferving等通过测定椎间盘细胞内钙离子浓度，证实IL-1能增强纤维环细胞对切应力的敏感性(具体表现为钙离子浓度明显升高，并长时间维持在较高的水平)，使纤维环易于损伤，导致其撕裂和突出，同时IL-1能引起MMPs的释放，进一步加重椎问盘的退变。 ！可能与MMPs家族中两个钙离子：一个钙离子参与MMPs中酶活性的激活，另一个钙离子为酶活性的稳定所必需有关。 ！IL-1刺激软骨细胞合成分泌MMPs，促进基质的降解，如使蛋白多糖合成受抑制（小剂量IL-1），降解增加（大剂量IL-1）。 Elfervig MK,Minchew JT,Francke E,et al.IL-1 Sensitizes Intervertebral Disc Annulus Cells to Fluid-Induced Shear Stress. J Cell Biochem,2001,82(2):290-298.,治疗进展,Kim等31研究了54个人的IL-1Ra等位基因（A1A5型）多态性，腰椎间盘髓核突出组A1、A3出现率高于正常组，等位基因A1A5依次出现在腰椎髓核突出的手术和保守治疗组，手术组A3出现率显著高于保守治疗组，结果显示等位基因A3高的病人适于手术治疗，IL-1Ra基因多态性可能影响腰椎髓核突出的临床病程。因此，通过测定等位基因A3出现率可提示治疗方案的选择。 Le Maitre等25首先发现了将IL-1Ra靶输送到退变椎间盘几乎可完全减弱明胶、酪蛋白、型胶原降解酶的活性。其更关键的发现是某些基质降解酶表达与其基质降解活性成正比。将基因工程过度表达IL-1Ra的细胞注射到退变椎间盘内，可以显著地抑制上述涉及酶的表达。由此为临床提供了治疗基础，即在椎间盘退变早期阻滞基质降解、用组织工程修复破裂的椎间盘、恢复正常基质的成分和结构。 Shamji等32发现弹性蛋白样多肽（ELPs）和已知的IL-1Ra形成药物复合剂型可聚合分散的IL-1Ra并提高其结合度，在生理条件下形成一个“药物仓库”，使其在患处缓慢释放。IL-1Ra抑制IL-1活性是一个很好的治疗靶点。 但是Goupille等33研究膝关节骨关节炎局部注射IL-1Ra的临床受益可能是有限的，更持久的拮抗剂需要进一步研究探讨。,小结,IL-1在椎间盘内炎性反应的开始和进程中起了一个关键、促进作用，其激活炎性反应，激活基质降解酶，诱导细胞外基质降解，导致细胞老化退变，进而产生连锁放大效应，加速椎间盘退变的进展。 因此，干预其介导的炎性反应可能是治疗椎间盘疾病的一个有效靶点。,针对IL-1治疗椎间盘疾病,综上所述，其措施主要有： 1、控制细胞分泌IL-1。可通过使用糖皮质激素、COX2抑制剂，使用基质金属蛋白酶中钙离子等部位的抑制剂达到抑制作用。 2、IL-1Ra拮抗IL-1，可阻滞椎间盘退变过程，利于椎间盘修复。目前IL-1Ra已用于类风湿性关节炎治疗的临床研究。 3、调节基质金属蛋白酶和基质及MMPs 和TIMPs之间的平衡，沉默p38MAPK及抑制蛋白激酶，使其作用减少。 4、测定等位基因A3出现率，确定是保守还是手术治疗。 5、改善早期退变椎间盘营养供应、减少应力负荷也是至关重要的。,其他炎性因子的调节,Jimbo等28研究发现，IL-l是通过调节其它细胞因子如IL-6、环氧合酶2(Cox-2)、MMP-l、MMP-3等来发挥作用的。 28 Hiroshi T,Toru S,Yikikazu O,et alInflammatory cytokines in the ruptured intervertebral disc ofthe lumbar spineJSpine，1996，21(2)：218-224,NO对椎间盘的影响,NO是一类新型的细胞间信使,是一种气体分子,具有细胞因子的特点。从广义上讲可以看作是一种细胞因子。NO参与调节体内许多生理和病理过程。包括免疫调节、炎症反应以及关节炎的病理过程等35。在关节软骨中IL-1抑制蛋白多糖合成部分是通过NO合成增多而发挥作用的36。 Kang等37发现突出的颈腰椎间盘能自发的产生NO，它可能启动椎问盘退变的生化变化和神经根性痛的病理生理过程。 Kang等38用体外培养的方法研究了NO对其他因子生成的影响，发现内源性NO能够强烈地抑制IL-6的产生，这说明自分泌机制在椎间盘代谢的过程中发挥重要作用。正常椎间盘自发产生NO很少，而在IL-1作用于下NO产生量增加，突出椎问盘组织细胞在IL-1作用于下，N0的产生量会进一步增加。,一氧化氮(nitric oxide， NO)是一种强力的血管扩张剂，引起血管漏出；另一方面，NO能抑制血栓素、白细胞介素-6的合成，显示抗炎作用。 【81Murrell GAC，Dolan MM，Jang D，et a1Nitric oxide：an important articular free radical【J】J Bone Joint Surg(Am)，1996，78(2)：265274】。 近年来随着对其研究的进展发现它在退行性骨关节炎及椎间盘的退变中起重要作用。NO可抑制软骨细胞增殖，NO供体硝普纳也抑制软骨细胞的增殖。IL-1既能刺激软骨细胞合成大剂量NO，又能明显抑制软骨细胞的增殖，IL-