【医学ppt课件】第四章酶 enzyme

第四章 酶 Enzyme,前 言,一、酶的研究历史,1、19世纪中叶对发酵本质的探讨： 1833年Payan 和 Persoz：淀粉糖化酶（diastase） 19世纪70年代 Pasteur：发酵是酵母细胞活动的结果。 1878年khne: Enzyme- “在酵母中” 1897年Bchner兄弟：用酵母提取液实现发酵获得了1907年的诺贝尔化学奖。 2、关于酶的化学本质的认识： 1926 J.B Summer：首次从刀豆中得到脲酶结晶，并证明其化学本质是蛋白质，J H Northrop和W M Stanley 分享了1946年的诺贝尔化学奖。 1982 Thomas R Cech从四膜虫发现rRNA的自身催化作用，并提出了核酶（ribozyme）的概念。,3、酶促动力学 Michaelis 和 Menton 1913年米氏学说。 邹承鲁 60年代初，提出酶蛋白必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系公式和确定必需基团数的方法，分别被称为“邹氏公式”、“邹氏作图法”。还提出了酶活性部位的柔性学说。,酶是由生物细胞合成的以蛋白质为主要成分，对底物起高效催化作用的生物催化剂。还有一类具有催化作用的核酸-核酶（ribozyme）,二、酶的概念,三、酶的重要性,第一节 酶的结构与功能,一、以酶结构、组成及功能分类 单体酶（monomeric enzyme） 寡聚酶（oligomeric enzyme） 多酶体系（ multienzyme system ） 多功能酶（multifunctional enzyme ）或串联酶（tandem enzyme）,二、酶的分子组成,1、单纯酶(simple enzyme)：单纯蛋白质,酶蛋白（apoenzyme）,辅助因子(cofactor)： 金属离子 小分子有机物,2、结合酶: (Conjugated enzyme) 或全酶 （holoenzyme）,1、金属离子为辅助因子的酶 金属酶：羧肽酶（Zn+2）和黄嘌呤氧化酶（Mo+6）； 金属激活酶：各种激酶和核酸酶（Mg2+） 金属离子的作用：参与三元络合物（E-M-S）起稳定酶蛋白构象和多种催化作用。 2、小分子有机化合物的辅助因子 辅基: 与酶蛋白共价结合, 不容易被透析除去，如黄素和生物素等辅基； 辅酶:与酶蛋白以非共价键疏松结合, 容易被透析除去，如TPP、NAD等； 辅基或辅酶的作用:传递电子、氢或基团。,二、酶的活性中心（active center）,1、活性中心概念： 能结合并催底物使之发生化学变化的位于酶分子上特定空间结构区域。辅助因子参与酶的活性中心。 2、酶活性的必需基团（essential group） （1）概念：间接或直接与酶催化活性相关的多肽链上某些氨基酸残基的功能基团。,酶活性中心必需基团： 结合基团(binding group) 催化基团(catalytic group) 活性中心外必需基团,（2）类型：,S-S,活性中心外 必需基团,结合基团 催化基团,活性中心必需基团,底物,肽链,活性中心,酶活性中心示意图,一些酶活性中心的氨基酸残基,酶 残基总数 活性中心残基 牛胰核糖核酸酶 124 His12, His119, Lys41 溶菌酶 129 Asp52, Glu35 牛胰凝乳蛋白酶 245 His57, Asp102,Ser195 牛胰蛋白酶 238 His46, Asp90, Ser183 木瓜蛋白酶 212 Cys25, His159 弹性蛋白酶 240 His45, Asp93, Ser188 枯草杆菌蛋白酶 275 His46, Ser221 碳酸酐酶 258 His93-Zn-His95 His117,第二节 酶促反应的特点与机制,一般催化剂的特点 酶催化作用的特点 酶催化作用的机制,一、一般催化剂的特点,催化效率高 反应前后质量不变 催化热力学允许的反应 加速可逆反应的进程不改变反应的平衡点,二、酶促反应的特点：,酶的高度催化效率（本质） 酶的催化具有高度特异性 酶促反应的条件温和 酶促反应无副反应 酶的催化受调控,酶与一般催化剂催化效率的比较,底物 催化剂 反应温度 反应速度常数 脲素 H + 62 7.4 10-7 脲酶 21 5.0 106 过氧化氢 Fe 2+ 22 56 过氧化氢酶 22 3.5 107,（一）酶的高度催化效率,1、反应过程：,过渡态,起始态,终态,能量,反应过程,2、酶促反应的能力学基础,化学反应速率的依赖因素： 分子间碰撞濒率； 有效碰撞分子的百分数。 几个概念： 能阈: 反应物分子发生化学变化所需最低能量。 活化分子: 含有高于反应能阈而能起反应的分子。 活化能: 活化分子所需要的高于反应物分子平均水平的能量。, 供给能量，如加温、光照等 降低活化能,加快反应速度的方法：,一般催化剂 反应活化能,反应总能量变化,酶促反应活化能,非催化反应活化能,初 态,终 态,能 量 改 变,活 化 过 程,酶促反应活化能的改变,过渡态,例如：过氧化氢分解反应 2H2O2 2H2O +O2 无催化剂 75312 J（18000 cal） 胶态钯 48953 J （11700 cal ） 过氧化氢酶 8368 J （2000 cal ）,（1） 绝对特异性：作用于一种底物进行专一反应生成一种特定产物。如： O 脲酶 H2NCNH2 + H2O 2NH3 + CO2,1、定义：酶只能催化一种或一类底物,发生一定的化学变化, 生成一定的产物。,2、类型：,（二）酶的特异性：,（2）相对特异性：作用于一类化合物或一种化学键。如脂肪酶 、磷酸酯酶和蛋白水解酶等。 （3）立体异构特异性：只能催化一种立体异构体进行反应，或产物是一种立体异构体。如： L-乳酸脱氢酶：作用于L-乳酸 延胡索酸酶：作用于反式的丁烯二酸,组 HO,CH3,COOH,组,HOOC,CH3,OH,L（-）乳酸 D（+）乳酸 （与LDH契合） （不能在LDH中的三点结合）,精,精,“三点附着理论”解释: L- 乳酸脱氢酶的催化作用特异性,（三）酶的催化受调控,1、酶和代谢物的区域化分布 2、多酶体系、多功能酶和同工酶等 3、代谢物对酶活性的抑制和激活 4、酶活性的调节：变构调节、共价修饰和酶原激活 5、酶含量的调节：诱导、阻遏和降解,三、 酶促反应的机制,（一）酶底物复合物（中间产物学说）,1、中间产物学说： E+S ES E+P,2、酶与底物结合特点： （1）可逆的、非共价的结合； （2）底物只与酶的活性中心结合； （3）酶与底物结合是通过一种称为诱导契合模式进行的。,k1,k2,k3,S,E,E-S复合物,a,b,c,a,b,c,（二）诱导契合假说（induced-fit hypothesis）,E,S,（三）酶催化作用的机制,酶,A,B,1、趋近效应与定向作用 （ proximity effect & orientation arrange）,3、多元催化 (multielement catalysis),多元催化：多个基元催化形式的协同作用。一般包括酸-碱催化，共价催化（亲核催化, 亲电子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化， His-57碱催化等； 酸-碱催化：通过暂时提供（或接受）一个质子以稳定过渡态达到催化反应的目的；,酶活性中心广义酸碱基团,溶菌酶酸、碱催化反应示意图,共价催化（亲核催化, 亲电子催化）：通过催化剂与底物的共价键结合，形成过渡态来加速反应。共价催化具有亲核、亲电过程。 亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓的亲核攻击。 亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催化反应,是亲核催化的反过程,第三节 酶促反应动力学,概念： 酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素。 反应速度：单位时间内底物减少或产物增加的速度，常用初速度来衡量。,产 物,0 时 间,初速度 酶促反应速度逐渐降低,酶促反应的时间进展曲线,影响酶促反应速度的因素：,底物浓度S 酶浓度E 反应温度 pH 值 抑制剂 激活剂,一、底物浓度对酶促反应速度的影响,v Vm 0.3 0.2 Vm 2 0.1,0 1 2 3 4 5 6 7 8 S,S与v关系： 当S很低时，S与v成比例- 一级反应 当S较高时，S与v不成比例 当S很高时，S，v不变-零级反应,S,v,Km,Vm 2,v =（Vm/Km） S,v=Vm=K2E,底物浓度对酶促反应速度的影响,V=,Vmax S,Km + S,（一）矩形双曲线：,(二)米-曼氏方程 （Michaelis-Menten equation）,V=,Vmax S,Km + S,1、米-曼氏方程解释： 当SKm时，v=(Vmax/Km) S, 即v 正比于S 当SKm时，v Vmax, 即S而v不变,2、米-曼氏方程成立条件： 初速度为标准 单底物 稳态（steady state） 3、推导方程: 游离酶浓度=E-ES ES生成速度=k1（E-ES）S ES分解速度=k2ES+ k3ES 当稳态时： ES生成速度=ES分解速度 k1（E-ES）S= k2ES+ k3ES,（E-ES）S k2+ k3 ES k1 ES= 因v=k3ES,当所有E被S饱和时，即达到最大速度，此时ES=E，Vmax=k3 E 代入上式：,=,= Km,ES,Km + S,v =,k3ES,Km + S,Vmax S,Km + S,=,（三） Km与 Vmax的意义,1、Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度； 2、 k2k3 时Km可用来表示酶对底物的亲和力大小， Km与酶对底物亲和力大小成反比； 3、 Km值是酶的特征性常数之一， Km值范围在10-6 10-2mol/L 4、 Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比； 5、 k3为酶的转换数：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变为产物的分子数。110 4/s,（四 ）Km值与 Vmax值测定,1、双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934） 1 = Km 1 + 1 V Vmax S Vmax,1/V,-1/Km 0 1/S,斜率= Km/ Vmax,1/Vmax,例题,Neurospora crassa 的D-丝氨酸脱水酶需要磷酸吡哆醛作为辅酶。催化反应： CH2OH CHNH2 COOH CH3CO COOH+NH3 在实验中测定酶的磷酸吡哆醛饱和曲线得到下列数据： s v 磷酸吡哆醛10 -5（M） 20分钟生成丙酮酸（M） 0.20 0.150 0.40 0.200 0.85 0.275 1.25 0.315 1.70 0.340 2.00 0.350 8.00 0.360,用这些数据求丝氨酸脱水酶对磷酸吡哆醛的表观米氏常数。,v Vm 0.3 0.2 Vm 2 0.1,0 1 2 3 4 5 6 7 8 10-6 S,丙酮酸M/20min,Vm=0.36 1/2Vm=0.18 Km=3.210-6 M,解：1、v对S作图法:,磷酸吡哆醛10 - 5（M） 20分钟生成丙酮酸（M） S 1/S v 1/v 0.20 5.0 0.150 6.66 0.40 2.5 0.200 5.00 0.85 1.17 0.275 3.64 1.25 0.80 0.315 3.17 1.70 0.58 0.340 2.94 2.00 0.50 0.350 2.86 8.00 0.125 0.360 2.78,解2、1/v 对1/S作图法：,7 6 5 4 3 2 1,-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5,1/v,1/S,-1/Km=-2.8510 5 Km=3.51 10-6,1/Vm=2.55 ; Vm=0.39,二、酶浓度对反应速度的影响,反应速度与酶浓度成正比：当SE,式中Km可以忽略不计。,k3ES,Km + S,=,k3E,v=,v,S,o,0 10 20 30 40 50 60 ,2.0 1.5 1.0 0.5,温度对唾液淀粉酶活性的影响,产 物 麦 芽 糖 的 毫 克 数,三、温度对酶促反应速度的影响,酶的最适温度: 酶活性最高时的温度, 也即酶的催化效率最高, 酶促反应速度最大时的温度。,酶的最适pH: 酶催化活性最高时的pH。,2 8 10 pH,酶 的 活 性,pH对某些酶活性的影响 A: 胃蛋白酶; B: 葡萄糖-6-磷酸酶,四、pH对酶促反应速度的影响,A,B,一些酶的最适 pH 值,酶 最适 pH 胃蛋白酶 1.8 过氧化氢酶 7.6 胰蛋白酶 7.7 延胡索酸酶 7.8 核糖核酸酶 7.8 精氨酸酶 9.8,五、抑制剂对酶促反应速度的影响,抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活性降低或丧失。 抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。,（一）不可逆抑制（irreversible inhibition） 抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合, 使酶丧失活性, 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性.,SH S E + Hg2+ E Hg + 2H+ SH S,SH Cl S E + As-CH=CHCl E As-CH=CHCl + 2HCl SH Cl S,巯基酶 路易士气,例1： 巯基酶的抑制,S E Hg + S,COONa CHSH CHSH COONa,SH E + Hg SH,COONa CHS CHS COONa,二巯基丁二酸钠,S CH2OH SH CH2OH E As-CH=CHCl + CHSH E + CHS S CH2SH SH CH2S,As-CH=CHCl,二巯基丙醇,解毒方法：,RO O RO O RO X RO OE,P + EOH P + HX,有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶(失活),RO O RO OE,P + -CHNOH,磷酰化酶(失活),N,+,CH3,-CHN,N,+,CH3,O OR O OR +EOH,P,例2： 羟基酶的抑制,羟基酶: 有丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶 有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心,解磷定,（二）可逆抑制(reversible inhibition),抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失, 结合是可逆的, 能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。,可逆抑制类型： 竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制（non-competitive inhibition） 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）,1、竞争性抑制(competitive inhibition) 概念 竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。,S,S,E,E,I,I,E,E + P,无 I 有 I,竞争性抑制的底物浓度曲线,v,竞争性抑制作用过程,S,竞争性抑制的动力学方程:,v=,VmaxS,Km(1+I/Ki)+S,1v,=,Km Vmax,(1+ ) +,IKi,1 S,1 Vmax,竞争性抑制的特征曲线：, I ,正常,1v,1 S,1 Vmax,-1,Km(1+ ),I Ki,-1 Km,竞争性抑制的特点：,I与S分子结构相似； Vmax 不变，表观Km增大； 抑制程度取决于I与E的亲和力 ，以及I和S的相对浓度比例。,COOH CH2 CH2 COOH,琥珀酸脱氢酶 + FAD + FADH2,COOH CH CH COOH,琥珀酸 延胡索酸,对氨基苯甲酸 二氢蝶呤 FH2 FH4 谷氨酸,二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶 磺胺药 (-) 氨甲蝶呤(-),例：,COOH CH2 COOH,丙二酸（-）,2、非竞争性抑制 （non-competitive inhibition） 概念 抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争关系。 非竞争性抑制作用过程：,S,S,E,E,E,E + P,S,E,S,I,I,I,I,非竞争性抑制的动力学方程:,1v,=,Km Vmax,(1+ ) +,IKi,1 S,1 Vmax,（1+ ）,IKi,非竞争性抑制的特征曲线：,1v,正常, I,1 S,-1 Km,1 Vmax,(1+ ),IKi,非竞争性抑制的特点：,1、I与S分子结构不同； 2、Vmax 减小，表观Km不变； 3、抑制程度取决于I大小。,例：,1、Ag 1+、 Cu 2+、 Hg 2+和 Pb 2+对酶的抑制 2、质子化的叔胺（R3NH+）对乙酰酯酶的抑制,（三）反竞争性抑制 （uncompetitive inhibition） 概念 抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性。 反竞争性抑制作用过程：,E,E,E + P,E,I,I,S,S,S,反竞争性抑制的动力学方程:,v=,VmaxS,Km +(1+I/Ki) S,1v,=,Km Vmax,(1+ ),IKi,1 S,1 Vmax,反竞争性抑制的特征曲线：, I ,正常,1v,1 S,1 Vmax,-1,Km,I Ki,+,(1+ ),-1 Km,1 Vmax,(1+ ),I Ki,反竞争性抑制的特点：,1、I与S分子结构不同,I只与ES结合 2、Vmax 和表观Km都减小； 3、抑制程度取决于I和ES二者的浓度。,例：,氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制,可逆性抑制作用的动力学比较,六、激活剂对酶促反应速度的影响,1、激活剂: 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。如： 金属离子： Mg 2+ 、 K+、 Mn2+ 阴离子： Cl- 有机物： 胆汁酸盐 2、分类： 必需激活剂 Mg 2+ 对己糖激酶 非必需激活剂 Cl- 对淀粉酶,七、酶活性测定,酶活性：酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。 酶活性单位：指酶促反应在单位时间（s,min,h）内生成一定量（mg, g, mol）的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。,一个国际单位（IU ,1976年）：在特定条件下, 1 min内使底物转变 1mol所需的酶量； 一个催量（kat）：在特定条件下,1 Sec内使底物转变 1mol所需的酶量 1I.U.=16.6710 -9 kat=16.67 10 -3 Kat； 1Kat =610 7 I.U. 酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。,例题：,某无细胞的粗提液，每ml含20 mg 蛋白质。在0.5ml的标准总反应体积中，含有10 l 这中提取液。在最适宜条件下，一分钟内生成30ng的产物。求： 用下述单位表示反应速度v : nmol/ml /min, nmol/L/min, mol/L/min, mol/L/min 若10 l该提取液，在1 ml总反应体积中进行实验，其反应速度是多少？ 反应混合液和提取液中酶活性浓度各是多少？ 酶制剂的比活力是多少？,解：,V=30/0.5=60 nmol/ml/min =60 10 3 nmol/L/min =60 mol/L/min =6 10-5 mol/L/min V=30/1 =30 nmol/ml/min =3 10-5 mol/L/min 反应液酶活性浓度= 60 nmol/ml/min =0.06mol/ml/min =0.06单位/ml 0.5 ml的反应液内含0.03单位酶，即10 l (0.01 ml) 提取液含0.03单位酶，所以： 提取液酶活性浓度=0.03/0.01=3单位/ml 酶比活=3/20=0.05单位/mg蛋白,第四节 酶的调节,一、酶活性的调节 二、酶量的调节 三、同工酶,一、酶活性的调节：,1、共价调节： 不可逆共价调节 酶原的激活 可逆共价调节 酶的共价修饰 2、非共价调节酶的变构调节,酶原（zymogen）: 指酶在细胞内合成或初分泌时无活性的酶的前体。 酶原激活:酶原在特定条件下，被水解一个或几个特定肽段致使酶分子构象发生重塑，从而形成或暴露酶的活性中心，表现出酶活性的过程。,（一）酶原与酶原激活,-S-S-,X,缬,天,天,天,天,赖,异,甘,缬,组 46,丝 183,静电吸引 力或氢键,肠激酶 胰蛋白酶,胰蛋白酶原,-S-S-,X,缬,天,天,天,天,赖,异,缬,丝,胰蛋白酶,S S,S S,组,活性中心,游离的六肽,胰蛋白酶原的激活过程,酶原与酶原激活的生理意义： 1、保护组织器官本身免受酶的水解破坏； 2、保证酶在特定时空发挥催化作用； 3、酶原可视作酶的储存形式。,（二）酶的共价修饰,P,E,E,ATP,ADP,P,H2O,蛋白激酶,磷蛋白磷酸酶,肌肉中磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化过程：,磷酸化酶-b,磷酸化酶-a,酶的共价修饰（covalent modification）或化学修饰（chemical modification） 在其他酶的催化下，一些酶分子肽链上特定基团与某种化学基团发生可逆性共价结合，从而改变酶的活性。 共价修饰基团类型：磷酸化和去磷酸化、乙酰化和去乙酰化、甲基化和去甲基化、腺苷化和去腺苷化等。,酶促化学修饰对酶活性的调节,（三）变构酶与变构调节,蛋白激酶A (无活性),蛋白激酶A (有活性),cAMP,C,C,C,C,R,R,R,R,蛋白激酶A的激活,ATP、柠檬酸,（）,AMP、ADP 2,6-二磷酸果糖 1,6-二磷酸果糖,(+),6-磷酸果糖激酶-1的变构调节,变构酶相关概念：,变构调节（allosteric regulation）:一些代谢物小分子可与某些酶的活性中心以外的某些部位可逆性非共价结合，使酶分子结构发生改变，从而影响酶的活性。 变构酶（allosteric enzyme） 变构部位（allosteric site） 变构效应剂（allosteric effector） 变构激活效应和变构抑制效应 协同效应（cooperativity）:正协同效应和负协同效应,二、酶含量的调节,（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏-转录水平 1、诱导作用（induction）和诱导剂（inducer） 2、阻遏作用（repression）和辅阻遏剂（corepressor） （二）酶蛋白降解的调控 1、无选择性蛋白降解：溶酶体 2、选择性蛋白降解：ATP+泛肽+泛肽结合降解酶,三、同工酶,乳酸脱氢酶（LDH）同工酶:,LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 (H4) (H3M) (H2M2) (HM3) (M4),M,H,乳酸脱氢酶（LDH）,1、定义： 是指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂合体，其分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同而能催化相同反应的一组酶。 2、同工酶的产生： 3、同工酶的作用：,人体心肝和骨骼肌LDH同工酶谱 组织器官 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 （ 占总 LDH活性的百分比） 心 3570 2845 216 06 05 肝 08 210 333 627 308 骨骼肌 110 418 838 936 4097 正常血清 27.12.8 34.7 4.3 20.9 2.4 11.7 3.3 57 2.9,第五节 酶的命名与分类,一、酶的命名 习惯命名：由发现者命名，常以底物名、反应性质以及酶的来源命名； 系统命名（1961年国际酶学委员会确定）每一个酶由下列三种表示： 1、系统名称：底物名+反应性质（底物名之间用“：”隔开） 2、分类编号：E.C.+四个数字 3、推荐名：选一个习惯名（实用、简单）,二、酶的分类,1、氧化还原酶（oxidoreductase） 2、转移酶（transferase） 3、水解酶（hydrolase） 4、裂解酶（或裂合酶lyase） 5、异构酶（isomerase） 6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）,第六节 酶在医学上的应用,一、酶与疾病的关系 （一）酶与疾病的发生,酶缺乏或异常引起的疾病 酶 疾 病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸尿症 6磷酸葡萄糖脱氢酶 蚕豆病 酪氨酸酶 白化病 细胞色素氧化酶 氰化物中毒 胆碱酯酶 有机磷中毒,（二）酶与疾病的诊断血清酶活性测定,临床诊断部分常用酶 酶 主要临床应用 谷丙转氨酶 肝实质疾患 谷草转氨酶 心肌梗塞、肝实质疾患 胆碱酯酶 有机磷中毒 乳酸脱氢酶 心肌疾患、肝实质疾患 淀粉酶 胰腺疾病 碱性磷酸酶 骨病、肝胆疾患 胰蛋白酶(原) 胰腺疾病 肌酸激酶 心肌梗塞、肌肉疾患 醛缩酶