医学课件1991年诺贝尔生理医学奖膜片钳技术

1991年诺贝尔生理医学奖,膜片钳技术,主讲人：唐国奎,Neher出生于1944年，德国人 1965年毕业于Wisconsin University 1976年在耶鲁大学医学院取得医学博士学位 此后长期从事基础医学研究,获奖者简介,Sakmann1942年出生于德国的斯图加特市 1963年毕业于Tubingen 大学，一直从事电生理学方面的研究,1976年Neher和Sakmann合作发明了patch clamp技术，发现了细胞膜存在离子通道，而共同获得1991年诺贝尔奖。,1976年Neher和Sakmann建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。以后由于吉欧姆阻抗封接（109）方法的确立和几种方法的创建，1980年以来，此技术已可用于很多细胞系的研究。,前言,膜片钳技术的优势在于其具有0.06pA的电流测量灵敏度，1m2的空间分辨率及10S的时间分辨率。使我们通过该技术了解到某个瞬间、特定条件，细胞膜离子通透性和膜通道蛋白构型的变化，从而使其成为目前从功能角度探讨各种生理、病理功能机制的最直接、理想的电生理学研究手段。该技术的问世，为生理学、药理学、病理生理学和分子生物学的多种学科关于生命活动规律、疾病及转归机制、药物作用机制的研究开辟了广阔的前景。Neher和Sakmann也因其杰出的工作和贡献，获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。,在兴奋过程中离子移动数量之多，速度之快，使人们推测在兴奋时膜结构中有特殊的蛋白质通道的存在。但由于当时技术所限，未能阐明。直至1976年Neher和Sakmann首次运用一种被称为膜片钳(patch clamp)的新记录方法，记录膜结构中单一的离子通道的开放和关闭，引起的单通道离子电流和电导，从而揭开了离子通道研究的新篇章。,Neher和Sakmann的贡献,Neher和Sakmann将直径15m的玻璃微电极在火上抛光，然后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧密接触。电极尖端与膜之间的接触，使尖端内的小片膜与其余部位在电学上绝缘，形成50M封接，保证了电流经微电极进入测量电路。以后，Neher又作了改进，用负压轻吸微电极造成管口与膜脂质双层之间非常紧密的封接（千兆欧封接）。千兆欧封接有两个重要后果，首先，小管内和细胞外液之间的电阻高达100千兆欧姆，因此在同一钳位电压下，膜单离子通道开放和关闭引起的离子电流、电导以及通道开放的时间机率及通道的动力学特性等皆可被测定。,第二，微电极尖端管口和膜之间封接的机械强度不同，可以产生几种不同的记录方式。不同的记录方式可用来研究通透性的不同方面。微电极尖端管口所围绕的细胞膜就是要观察离子通道变化的“膜片”，如果在这一小片膜上只含有一个或少数几个通道蛋白分子，则可通过离子通道电导的特点，测定出单一通道开放时的离子电流，从而对单通道的功能特性进行分析。他们应用这套技术顺利地记录了蛙肌肉细胞上单一离子通道电流。结果显示，蛙肌肉细胞的细胞膜上一个离子通道可通过的电流约为2010-12A，换成离子数目大约是每秒通过一亿个离子。此后，他们又对离子通道的运作，细胞分泌过程及通道的调节功能进行了研究。,A显示出玻璃微电极接触进入至细胞中。B则是使用高级放大仪，将膜上的离子通道与微量吸管的尖端相触，以放大一部分的细胞膜。其中，微量吸管内连接了电流放大器。D表示电流通过离子通道，离子通道开启。C为通道的高度放大：细胞外覆有受体以及离子滤器。,细胞膜电流的测定,膜片钳技术是用玻璃微电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（G）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。,膜片钳技术的原理,膜片钳技术原理图,Electrophysiology-Apparatus,Electrophysiology-Apparatus,Patch clamp,首先建立的单通道记录法（single channel recording）是细胞吸附式（cell-attached mode），其后又建立了膜内面向外模式（inside-out）和膜外面向外（outside-out）的模式。后来，又分别建立了开放细胞吸附内面向外模式（open cell-attached inside-out mode）和穿孔囊泡外面向外模式（perforated cell-attached inside-out mode）。全细胞记录法是指在常规的方法的基础上，附加穿孔膜片（perforated patch）的模式。,膜片钳法的各种模式,膜片钳法的各种模式图,膜片钳技术的最主要的优点在于阻抗封接形成的结果使漏出电流极少，所以能正确地进行电压固定。然而不足的是，在形成巨阻抗封接时，由于腔内负压的作用使膜片被吸入微电极腔内，形成所谓的“”形膜片，从而造成不可避免的机械性刺激。 由巨阻抗封接带来的第二大优点是背底噪声水平达到极低。因为由热噪声引起漂移的标准误差与阻抗的平方根值成正比，所以巨阻抗封接是可达到最小。此外，虽然所用的膜片钳放大器的探头场效应管运算放大器电压噪声较小，但对其也不能忽视。由于膜片微电极在安装时的阻抗性电流噪声与封接阻抗（Rs ）成反比，故也可因巨阻抗封接而大大减小。,膜片钳技术的优缺点,在膜片钳技术出现之前，在电压固定条件下进行的细胞膜电流记录法，只能向细胞内刺入二根电极或者蔗糖和凡士林进行双重缝隙法（dual gap）从细胞外进行记录，但这两种方法仅适用于非常大的细胞。相反地，应用膜片钳法时对一般较小细胞也能在电位固定的条件下记录出电流。这也是膜片钳法的一个很大的优点。此外，膜片钳技术还有可以直接控制细胞内环境的优点，同时也存在相反的一面，即比较小的胞质中可动分子可被渗漏，这又是它的不足之处。,使影响膜通道因素单一化：在同一细胞膜上通道的种类很多，可受到如化学、电压和机械等多种因素的影响而改变其机能状态。如果细胞在活动过程中，始终认为地维持其膜电位不变，清除了离子流的变化和膜电位变化之间的相互作用，可使观察因素相对简单化。 使参与活动的离子通道单一化：由于静息膜电位的水平可分别影响不同类型的离子通道，如果有意改变并维持某一膜电位水平，将使一类膜离子通道首先失活，消除这一类或几类通道的活动对实验结果的影响，再用一些特异性离子通道阻断剂后，就可观察剩余通道的活动规律。使参与活动的离子通道相对单一化。,膜片钳技术的意义,由于膜片钳技术的诞生，实现了对细胞膜少数几个或某一个离子通道的“开”“关”过程和活动规律的观察，并使研究某些因素（如第二信使物质）对细胞膜通道膜内部分结构的作用成为可能。 可任意的改变膜内外物资的组分，观察膜通道功能变化，为从分子水平研究细胞的活动机制提供有效的机能学方法。 与分子生物学方法结合可拓宽研究范围。 测量膜电容及其变化，研究细胞分泌功能与机制。,尽管膜片钳技术发展的历史不长，但由于它能分辨通过细胞膜单个通道的电路，而多数实验都是以在特定细胞上表达的单个离子通道的性质为研究对象，因此，已得到了广泛的应用，并已取得了许多重大的进展。 通过膜片钳技术，人们才认识到膜通透性变化的本质，了解离子通道可有三种状态：开、关和失活。通道的开放是全或无式的，通道一旦打开形成的离子流幅值恒定，而只有开放时间长短的变化，因此通道开放的机率和开放的持续时间依赖于膜电位和时间。而配基门控通道有关闭、开放和脱敏三种状态，配基与受体的结合和解离的过程比较慢，通道开放态和关闭态的转换比较快，另外配基门控通道还受其他配基和磷酸化的调制。,展望,应用膜片钳技术可证明受体的存在并进行受体分型，即通过快速换液装置加相应的激动剂、拮抗剂及变构性调制剂，记录膜单通道的离子电流，并根据受体的动力学及其它特性来证明所要检测的受体。 膜片钳技术扩展了电生理技术的应用范围，如以往因技术缘故难以研究哺乳动物的小细胞或脆性很大的细胞，而今用膜片钳技术则可进行研究。 膜片钳技术与Fura-2荧光测钙技术结合，一方面以荧光强度监测细胞内Ca2+浓度的变化，另一方面以全细胞膜片钳技术同时记录同一细胞膜电容的变化，进而分析研究细胞内Ca2+浓度与细胞分泌事件之间的关系。,膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链式反应技术结合，一方面可对形态相似的细胞作基因水平的鉴定，另一方面可对形态相似而电活动不同的细胞作出分子水平的解释。 另外，膜片钳技术