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文档简介
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化,一. 实验目的 通过本实验,学习大肠杆菌感受态细胞制备和转化的原理与技术方法。,二. 实验原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能使许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。,转化(transformation): 是将异源DNA分子引入受体细胞,使其获得新的遗传性状的一种技术方法。 进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。,大肠杆菌转化的方法: 化学法:使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞,通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞; 电转化法:通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,转化子的筛选: 利用导入的DNA上的选择性标记,区分转化子与非转化子。 选择性标记主要有两类: 营养筛选标记 抗性筛选标记,三实验方法,1挑取大肠杆菌DH5单菌落,接于5mL LB液体培养基中37振荡培养过夜 2以1:50比例将1ml菌液转移到新鲜LB液体培养基中,37振荡培养1.52 hr左右,使A600在0.40.5左右,3将培养液4ml转移到5ml离心管中,4,2000g离心3min 4弃上清,加0.5mL用冰预冷的0.1 M CaCl2溶液,轻轻吹打或摇动混匀细胞 注意:加入CaCl2动作需轻柔,勿剧烈震荡,并且尽量使细胞处于低温中,5冰上放置20min,2000g离心2min 6弃上清,加0.1ml预冷的 0.1 M CaCl2溶液,轻轻吹打或摇动混匀细胞,即得感受态细胞 注意:离心后观察沉淀,如果出现中间空心的沉淀说明操作正常,7将取0.1ml感受态细胞转移到1.5ml离心管中,加2l 质粒,混匀,冰上放置30min 842水浴90秒,在冰上放置2min 9加入 0.5 ml新鲜LB培养基,37,200rpm振荡约30min45min(注:转纯质粒可省略,转连接产物需进行) 10. 取 100l 涂布到含有氨苄青霉素的平板上,加X-gal/IPTG各3L 11倒置平皿,37培养1216h,每个平板大约20ml的培养基,平板培养基,用 CaCl2法制备的感受态细胞,可使每微克超螺旋质粒 DNA产
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