荧光pcr快速检测试剂盒

荧光PCR快速检测试剂盒,主要内容,基础理论部分 实验操作部分 注意事项及其他,基础理论部分,基础知识 PCR原理与过程 PCR体系 荧光PCR,PCR基础,1869年，核酸的概念 Miescher从细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物(DNA、RNA) 1944年，核酸是遗传物质 从S 型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，就不发生转化,1953年，DNA双螺旋结构 冈崎片段 DNA的半保留复制 1971年，Khorana提出体外扩增设想 1985年 ，Mullis发明PCR 耐热聚合酶,PCR基础,Mullis发明PCR,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 实质：体外模拟DNA的复制过程 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成 变性：打开DNA螺旋双链 复性：引物与模板结合 合成：Taq酶沿模板延伸,PCR的原理,模板DNA双链的打开（变性）：模板DNA经加热至94左右一定时间后，双链解离成为单链，便于与引物结合 模板DNA与引物的退火(复性)：当温度降至55左右，单链模板DNA可与引物配对结合 引物引导下新链的合成（延伸）：DNA模板-引物复合体在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则合成一条新链,Cycle1,Cycle2,Cycle3,动画：PCR原理.swf PCR课件.swf,PCR原理,变性 温度一般92oC-94oC,再高会缩短Taq酶半衰期 使用薄壁均匀离心管 时间取决于模板的复杂程度，前期一般15min。 GC%、空间结构、杂蛋白等 循环中变性一般1560sec。 对于模板没有纯化而扩增效果不好的，考虑延长变性时间 注：热变性对DNA 有重大的损伤，因此有时候变性时间长反而产物量会减少。,PCR原理,退火 因为引物 模板，所以引物与模板配对的复性动力学系数远比模板复原的要大 温度37oC-65oC甚至72oC（两步法）都有，视引物与模板的同源程度而定，一般使用比Tm值少5oC 10oC。如果引物与模板不是严紧配对，一个碱基错配约降低Tm 5oC。 Tm计算经验公式：Tm=2（A+T）+ 4（G+C） 时间1560sec。,PCR原理,延伸 温度一般在72oC，因为是Taq酶反应最佳温度 时间按扩增区段（目标产物大小）而定，一般1560sec足够。 72oC时合成速度 1000bp/min Taq酶在70oC合成速度为60nt/sec 在55oC合成速度为24nt/sec 在37oC合成速度为1.5nt/sec 在22oC合成速度为0.25nt/sec 含有酶的反应液操作最好在冰上进行,PCR反应体系,纯水（补够体积，使缓冲液为使用终浓度） 10反应缓冲液（酶的作用环境） dNTP 引物 模板 Taq酶 探针（荧光PCR）,PCR反应体系,反应缓冲液 对于不同的模板引物，最佳缓冲条件有待摸索。常用 50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、1. 5 mmol/L MgCl2。 Tris-HCl 在反应中pH会有变化， pKa为-0.021/oC 50mmol/L内的KCl有利于退火，高可能会抑制酶活 有些反应使用NH4+代替K+(16mmol/L),PCR反应体系,反应缓冲液 Mg2+浓度影响引物退火和酶的活性，高Mg2+增强复性，也增加非特异性，降低模板变性温度。 Mg2+浓度 dNTP + 模板 + EDTA 浓度 据报道，自由Mg2+浓度在0.70.8mM之间为好。 有报道使用Mn2+代替Mg2+，但是会增加突变 dNTP应等浓度配置,PCR反应体系,反应缓冲液中可加一些PCR促进剂 明胶 Triton X-100 稳定酶的活性 BSA DTT 甘油 DMSO 降低解链温度，提高反应特异性 甲酰胺 TMAC(氯化四甲基铵) gp32(T4噬菌体基因32蛋白) 甜菜碱,PCR反应体系,dNTP 组成核酸长链的一个个小单元 dATP，dGTP，dCTP，dTTP，dUTP 引物 一小段单链DNA 在Taq酶的作用下用于引导链的合成,UNG酶,在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。,引物设计,引物设计的目标是在扩增的特异性和扩增效率之间取得平衡 引物长度： 15-30nt。引物越短，引物与靶DNA结合速率越大，确保Tm = 55oC的最短引物可获得最好的效率和特异性，常用为18-24nt左右。 如果扩增的序列具不均一性，引物长度应长些，28-35nt。长引物多用于扩增蛋白异构体或蛋白家族DNA；从不同物种克隆另一物种的已知序列基因；扩增高变异特征的序列，如病毒。,引物设计,引物碱基：GC%以40-60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物对位置与跨度： 据使用目的而定，多选用保守区段进行扩增，特异性，一般扩增不超过1kb。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则易于形成引物二聚体。 引物3端的碱基5,6个碱基尽可能不要错配，特别是最末两个碱基，要求严格配对，否则易导致PCR失败。,引物设计,考虑引物的稳定性和结合稳定性，设计GC在5端和中间区段。避免3端GC丰富，最后5nt最好包含3个A或T。 引物5端可加上合适的酶切位点， 便于对酶切分析或进行分子克隆，不影响特异性。 若序列未知而设计简并引物，应考虑密码子偏爱和使用I(次黄嘌呤，deoxyinosine)，但3端避免简并。 Tm值应尽量一致，若不一致，可用小Tm降低5oC做退火温度或先用高Tm降低5oC做4-5循环，在使用低Tm值。,PCR反应体系,Taq酶（DNA聚合酶） 按模板配对原则，把dNTP串联出一新链 耐热，94度1小时仍有50%的聚合活性 离子依赖性：反应缓冲液中要有Mg+ 有核酸外切功能（可实现荧光PCR） 抑制剂：离子表面活性剂，尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)、Tween20，NP-40、Tritox-100在高浓度时也可抑制,PCR优化(普通PCR),当未检测到产物或产物带很弱 增加循环数 稀释扩增产物作为模板，再做PCR 提高模板质量 蛋白质含量过多？ 反应抑制物存在？离子去污剂、酚、肝素、二甲苯青、溴酚兰 提高首次变性温度与时间（模板复杂，GC%高，二级结构） 改变缓冲各成分浓度 换用酶 添加PCR反应增强剂(DMSO、BSA、PEG、甘油、甲酰胺、甜菜碱) 使用嵌套引物对产物再扩增 重新设计引物,PCR优化(普通PCR),当产物多带或高分子量产物成片 提高退火温度 改变缓冲液各成分浓度 纯化产物再扩增 嵌套式对产物稀释模板扩增 延长或缩短延伸时间 降低酶（或引物、模板甚至dNTP)的用量 重新设计引物,RT-PCR：逆转录PCR,逆转录：从RNA到cDNA PCR：以cDNA为模板进行 一步法：在同一反应体系中进行反转录和PCR 适用于基因特异引物，操作方便，污染少，敏感性高 两步法：先反转录出cDNA做模板，再进行PCR 适用于各种引物(随机引物、Oligo(dT)、特异引物)，灵活，引物酶选择性大，可优化提高保守度,各种衍生的PCR,降落PCR 长距离PCR 巢式PCR 反向PCR 不对称PCR 等位特异PCR 重组PCR LCR,引物标记PCR 原位PCR 免疫PCR RACE-PCR 转录依赖的扩增(TAS) 自主序列复制(3SR) 链替代扩增(SDA) Q复制酶系统,PCR和RT-PCR的应用,基因克隆 DNA测序 突变分析 基因重组融合 载体构建 多态性分析(RAPD、PCR-AFLP) 遗传图谱描绘 临床诊断 法医鉴定 ,荧光PCR,荧光定量PCR比常规PCR多一个寡聚核苷酸探针，探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子。 完整的探针在激光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光。 PCR扩增过程中，Taq酶分子在链延长的过程中可以通过自身的5-3核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，从而在激光激发下产生特定波长的荧光，这种荧光随着PCR扩增过程而动态增强。 动画：real-time PCR.swf,荧光PCR：TaqMan法,荧光PCR：SYBR染料法,荧光PCR：分子信标法,LightCycler探针技术,通用探针技术,荧光能量共振转移(FRET),探针法的荧光PCR基本原理都是FRET 与分子空间的距离紧密相关,一般为7-10nm时即可发生FRET,距离越长,FRET现象减弱.,探针设计,根据不同的荧光PCR原理进行设计 常见的TaqMan探针：基本原则与引物设计相似，不过Tm值一般比引物高10左右。 针对检测区段的最保守区设计 先确定探针，再确定引物 与探针同向的引物不能离的太远 扩增区段一般为100bp左右，不宜过长。,常见的荧光基团,BHQ：black hole quencher,定量PCR与定性PCR的根本的区别,平台期,指数期,荧光PCR的定量原理,在平台期之前，PCR进行指数扩增 遵循公式：Nf=N0(1+Y)n 其中Nf：循环数为n时的扩增产物数，N0：起始拷贝数，Y：平均扩增效率，n：循环数 两边取对数，变换公式后得到： LogN0=-nLog(1+Y)+LogNf,荧光PCR的定量原理,N0的对数与n成反比例，即是说起始模板量的对数值与需要达到阈值时的循环次数呈反比。 在阈值时的n值就是Ct值。 可根据已知的N0对数与n(Ct值)描出标准曲线，然后利用标准曲线计算出未知样本的起始模板量。,Ct：,C代表Cycle，t代表threshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,荧光域值（threshold）的设定,threshold = 10 SDcycle 6-15,标准曲线对荧光定量PCR很重要,Ct值与起始模板的关系,模板Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,荧光PCR特点,灵敏度高（是优点，但处理不好也是缺点） 特异性强 封闭式检测，无需后处理 即时反映扩增过程，更适用于定量 可一管多检,循环数的确定,根据公式Nf=No(1+Y)n 得到下面关系(常见Y=0.7) 模板 需要循环数 终拷贝 3 e5 2530 趋向e12 1.5e4 3035 趋向e12 e3 3540 趋向e12 50 4045 趋向e12 当Nf=e12时，指数循环趋于平台效应 一般超过25循环可能产生某些非特异性，有些用于克隆的PCR，只要8循环就可以了。,荧光定量PCR的临床应用,早期诊断 病原快速诊断和控制 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 输血源的筛选 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断,实验部分：荧光PCR试剂盒,试剂盒包括： 抽提试剂（作用：释放核酸，去除抑制物） 反应试剂（反应液，Taq酶/逆转录酶） 对照品 保存与运输： 抽提试剂一般放4度 反应试剂一般-20度 试剂盒低温运输,实验操作部分：样品处理,经典纯化法：裂解细胞、沉淀核酸、洗涤干燥、复溶 细菌 有些菌体可直接PCR 细菌蛋白可能会抑制Taq酶活性，用量应少 热裂解、反复冻融、碱解 细菌一般简单处理就可以了,实验操作部分：样品处理,主要是培养基终和某些细菌的代谢产物影响PCR反应，去掉或稀释即可,沙门氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 大肠杆菌 空肠弯曲菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌 霍乱弧菌 副溶血弧菌 阪崎氏肠杆菌 肉毒杆菌,拟态弧菌 创伤弧菌 溶血性链球菌 乳酸杆菌 结核杆菌 变形杆菌 布氏杆菌 蜡样芽孢杆菌 耶尔森氏肠炎菌及假结核耶尔森氏菌,实验操作部分：样品处理,病毒 低速离心去掉细胞、大颗粒， 高速离心（一般要加助沉剂如PEG）收集病毒，再以表面活性剂、蛋白酶K等消化（辅以加热裂解） 血液、细胞 常规方法DNA抽提 表面活性剂和蛋白酶K消化，核酸沉淀后洗涤，复溶 组织 冰冻研磨、Trizol裂解，蛋白酶K消化 苯酚抽提，异丙醇/乙醇沉淀，洗涤浓缩，复溶,实验操作部分,反应液配制： 按使用份数取反应试剂+Taq酶（反转录酶），充分混匀后离心，分装于反应管 加样 阴性对照和阳性对照、空白对照 样本抽提物 上机 主要分三块：面板设置、反应运行、结果分析,荧光PCR仪,ABI：9600、7000、7300、7500 Roche：LightCycler（空气式加热） Bio-Rad（MJ）： iCycler、Opticon2 Stratagen：3000P，3005P TaKaRa： 国产：,MJ Opticon：冷光源，绿色LED,温度范围：0-105，不要低于环境温度30 精确度：90时30秒内精确度为0.3 均一性：90时30秒内均一性为0.4 温度变化速率：最大可达3.0/秒 样品容积：可使用96孔平板(低剖面)，或者960.2ml条形管(低剖面) 激发光光谱：470nm-505nm 发射光光谱：523nm-535nm, 540nm及以上,主面板,样品设置,反应条件设置,运行状态,反应结果,定性结果判断,原则： 有指数扩增且Ct值较小为阳性