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凋亡抑制蛋白Livin研究进展（贵阳中医学院研究生）周东升 综述 郝新宝 审校 摘要: Livin为 IAPs的成员之一，在人类多种肿瘤中高表达，其过表达可增加恶性肿瘤细胞的抗凋亡作用及耐药性。并且与肿瘤的监测、预后、复发有密切的关系。针对livin的抑制剂和生物免疫治疗正成为研究的热点。关键词: Livin ；细胞凋亡；过表达；预后；肿瘤治疗细胞凋亡(apoptosis)是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，也可以叫细胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)；它是由膜受体和细胞浆蛋白所执行的一系列级联反应事件，Kerr等于1972年首次提出这个概念。恶性肿瘤是细胞增殖与凋亡失衡而产生的病理产物，凋亡抑制是肿瘤发生的重要机制之一，凋亡基因的失控表达，凋亡通路的紊乱、凋亡抑制因子的过表达和促凋亡因子抑制都会导致肿瘤的发生与发展。所以在肿瘤的治疗过程中如何促进肿瘤细胞凋亡是一个重要的研究方向。凋亡抑制蛋白( Inhibitor of apoptosis protein，IAP)近年来引起人们的关注。该家族有8个成员：即人类凋亡抑制蛋白1(HIAP-1)、 人类凋亡抑制蛋白2（HIAP-2)、神经元凋亡抑制蛋白(NIAP)、X连接的凋亡抑制蛋白(XIAP)、ILP-2、布鲁斯（Bruce）、生存素(survivin)和Livin。越来越多的研究发现，Livin基因在恶性肿瘤的发生、发展、转移、化疗耐药等方面起着重要的作用。为此，现就Livin基因的发现、结构、分布、作用机制及其与肿瘤关系作一综述。1 Livin的发现Livin几乎同时被4个不同的实验小组在2000年所发现。Lin等1在人胎肾互补DNA文库中分离到该基因，故将其称为肾脏凋亡抑制蛋白(Kidney IAP，KIAP)。Vucic等2因该基因在人黑色素瘤细胞中高表达，称之为黑色素瘤凋亡抑制蛋白(ML-IAP)。Kasof等3将该基因命名为Livin。Ashhab等4进一步明确了此新基因有2个剪接异构体，分别命名为Livin和Livin。为了避免名称混淆现将其统称为Livin。2 Livin的结构及分布特点人类的livin基因定位于染色体20ql3.3，全长46kb，包含7个外显子及6个内含子，Livin蛋白N端含一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列BIR（baculovirus 4IAP reapeat）结构，C端含一个羧基端环指结构域（RING结构域），其转录产物因剪接方式不同有两种mRNA亚型Livin和Livin，分别编码298和280个氨基酸的蛋白质，两者相差18个氨基酸。两者主要区别在第6号外显子区，livin比Livin第6外显子5端少54bp。RING结构域虽不直接参与抑制细胞凋亡作用，但研究发现其对Livin在细胞内的分布具有重要作用。Livin的BIR功能区是发挥抗凋亡活性的主要结构，有4个Q螺旋和一个维护其三维结构稳定性的锌指结构组成。研究发现Livin在正常成人的大多数组织中均不表达或表达很低，但在胎儿的脑、肾和肝等组织中及大多数人类实体瘤细胞中高表达。Ashhab4等在脑、骨骼肌和外周血淋巴细胞中检测到Livin低表达，而Livin在胎肾中高表达在心脏和脾脏中低表达，在成人肾脏中也仅仅呈现低水平的表达。Kasof2等发现Livin在细胞核中和细胞质内都有表达。Livin在乳腺癌细胞系中定位在细胞骨架。而Hakhyun Ka5等在胎盘组织中检测到Livin定位在细胞核中。3 Livin的作用机制3.1 与Caspases的相互作用：Caspases(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)蛋白是介导细胞凋亡的重要蛋白家族，多数凋亡刺激物必须通过Caspase蛋白的级联激活反应引起细胞凋亡6-7。细胞凋亡主要存在三条通路:死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路，它们最终都通过Caspase起作用，因此可以说它是细胞凋亡的共同通路。Caspases蛋白有10多个家族成员。而Livin能与其中多个成员相互作用，抑制凋亡的执行过程。Livin主要通过其BIR区与Caspases结合后启动以阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径，从而抑制凋亡蛋白酶的活性。Kasof等2研究发现， Livin可与介导细胞凋亡的下游效应Caspases，即激活形式的Caspase-3和Caspase-7结合，并抑制其活性。其中Livin与Caspase-3的结合能力最强，而与Caspase-7的结合能力相对较弱。同时， Livin也能与Caspase-9的酶原结合从而抑制Caspase-3和Caspase-7的蛋白酶解加工。Livin还可与未加工的或断裂形式的Caspase-9结合，抑制线粒体/细胞色素C、Apaf-1及dATP介导的Caspase-9激活作用。然而Nachmias B8等在对耐药黑色素瘤的研究中发现了一个新奇的现象， Livin能与Caspase结合产生抗凋亡作用，也能够被Caspase-3和Caspase-7在特异的Asp-52位置处裂解，Livin裂解后的亚单位虽然仍有完整的BIR 和Ring结构域，但他们不仅丧失了抑制凋亡的作用反而获得了促进凋亡的能力，而同时Caspase-3和Caspase-7的活性也被抑制。这种现象表明Livin和Caspases蛋白之间有复杂的调节机制，也表明Livin结构的完整性是其发挥抗凋亡作用的前提条件。对于该现象Nachmias 9等进一步研究发现完整的Livin蛋白在细胞胞浆内均匀弥散地分布，而裂解后称之为截短的Livin ( Truncated Livin， tLivin)显著集中定位于细胞核周高尔基体。利用突变分析确定了tLivin促进凋亡的两个决定性功能区域：即裂解后暴露出的氨基末端和RING结构域，前者的甘氨酸残基决定了tLivin在核周的定位，完整的RING结构域只有在tLivin正确定位后才能行使促进凋亡的功能。3.2激活TAK1/JNK1信号传导途径:氨基末端激酶(JNK)是分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号通路家族成员之一，是连接细胞膜表面受体及决定细胞核下游靶基因表达的重要信号调节酶，在细胞的增殖、分化和凋亡过程中起重要作用10。JNK蛋白位于胞质，由3个基因编码，分别为JNK1、JNK2、JNK3。Sanna 等11的研究显示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2，并且这是Livin蛋白对抗TNF和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。TAK1(TGF-activated kinase 1)是MAPKKK家族成员之一，在TGF-1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反应子(coactivator)，TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。2.3 Livin具有泛素连接酶(Ubiquitin Ligase，E3)的功能12。泛素能够与靶蛋白共价结合并使靶蛋白发生泛素化，然后再被蛋白水解复合物降解并失去靶蛋白原有的功能。Livin可以作为一种泛素连接酶，使其靶蛋白Caspases发生泛素化并降解从而抑制细胞凋亡。Livin作为泛素连接酶还可以促进Smac/DIABLO蛋白的降解13 。Smac ( Second mitochondria derived activator of caspases)又称作DIABLO，是IAP家族重要的负性调节蛋白，是在凋亡信号的刺激下，由线粒体释放入胞浆，在胞浆内与IAPs的BIR端直接结合而抑制IAPs的活性。Livin使Smac蛋白泛素化并降解可间接阻止Smac对抗XIAP的凋亡抑制作用。而另一方面SMAC又是IAPs的拮抗剂。在体内以抗凋亡信号转导为主的情况下，Livin大量表达。Livin通过与SMAC结合而中和SMAC的caspase活化蛋白的活性，从而使多种caspase不能活化而发挥抗凋亡作用。然而在体内以促凋亡信号转导为主的情况下，SMAC会从线粒体中大量释放，与Livin特异性结合并占据Livin发挥活性的BIR结构域，从而使Livin抗凋亡的作用大大降低14。由此可见二者在不同细胞信号调控下具有相互影响、相互制约的作用，构成精密的动态平衡的细胞凋亡系统中的一环。4 livin在肿瘤中的表达及意义4.1 肺癌 Tanabe等15用RT-PCR检测38例非小细胞性肺癌(NSCLC)肺癌组织Livin的mRNA表达情况，并设置15例正常肺组织作对照，结果发现肺癌组织Livin mRNA表达率为76.3% (29/38)，而正常肺组织表达率分别为6.7% (1/15)。这一研究结果显示Livin在NSCLC发生发展中起着重要作用。Yagihashi等16研究发现51.3%(19/37)的肺癌患者血清Livin抗体的检测为阳性，提示如能检测到Livin抗体将有助于肺癌患者的诊断。陈晓等17用免疫组织化学技术检测Livin和Smac蛋白在89例非小细胞肺癌组织和25例癌旁肺组织中的表达，非小细胞肺癌组织中Livin蛋白阳性表达率为53.19%(48/89)，高于癌旁肺组织中的8.00%(2/25)，差异有统计学意义，而且Livin蛋白表达水平与淋巴结转移、TNM分期及病理类型有密切相关；与性别、年龄、分化等无关。4.2 消化系统肿瘤 Yagihashi等18研究发现Livin在人类胃癌、结肠癌、胰腺癌及肝癌等肿瘤细胞系中过度表达。并对35例胃肠癌患者和10例正常人Livin抗体的表达情况进行了检测，其中17例(47%)患者血清与重组的Livin蛋白反应，且与Survivin抗体的表达无相关性。Livin抗体在胃癌的高表达以及与Survivin抗体的非相关性提示，对Livin抗体的检测有助于对肿瘤的监测。4.3泌尿系统肿瘤Kitamura等19用免疫组化检测45例肾细胞肾癌患者的肿瘤标本，发现其中26例(57. 8% )患者的肾癌组织标本中Livin表达阳性，该研究同时用酶联免疫及Western-blot检测肾细胞肾癌患者血清中抗Livin抗体的表达，发现患者中该抗体表达明显高于正常的志愿者，而肿瘤组织中Livin的表达及血清中抗Livin抗体的表达与患者生存率无明显相关性。Liu等20用Western-blot及RT-PCR检测48例膀胱癌组织标本，发现在膀胱癌复发肿瘤组织中Livin的表达率(58. 8% )显著高于原发肿瘤组织(29. 0%，P0.05)。在2年的随访中Livin阳性组患者肿瘤的复发率亦明显高于阴性组(P0.05)，这提示通过膀胱癌病人Livin表达的检测对预后判断及复发风险有参考价值。4.4 非霍奇金淋巴瘤 Gao JM等21应用免疫组织化学法检测Livin蛋白在30例非霍奇金淋巴瘤患者及11例淋巴结反应性增生患者淋巴结中的表达，并应用real-time PCR对其中20例非霍奇金淋巴瘤、10例淋巴结反应性增生及4例正常人的淋巴结组织中Livin mRNA表达水平进行检测，分析livin蛋白和mRNA表达与NHL患者临床表现及其特征的相关性。结果表明NHL患者淋巴结组织中Livin mRNA表达水平与正常淋巴结组织以及淋巴结反应性增生组织比较均显著增高(RQ中位数分别为12.4 vs 0.34和12.4 vs 0.61)(p0.01)。30例非霍奇金淋巴瘤中有16例Livin蛋白表达阳性，阳性率为53.3%；11例淋巴结反应性增生患者仅1例表达阳性，阳性率为9.1%。Livin蛋白及mRNA二者的表达均与NHL分期、B症状、beta2-MG、LDH密切相关，与年龄、性别、类型无关。因此Livin表达水平对评价患者临床分期及预后可能具有指导意义。4.5 乳腺癌 Vucic等用ML-IAP抗体检测高表达ML-IAP的MCF7乳腺癌细胞系，发现LivinC末端的RIN结构主要与细胞内微丝结构结合，从而定位在细胞骨架，使LivinBIR功能区能够有效地抑制Fas、TNFR1、DR4、DR5引起的细胞凋亡，导致乳腺癌的发生。Yagihashi等22对46例乳腺癌患者血清中的Survivin和Livin抗体进行了检测，46例患者中Survivin抗体阳性患者11例，Livin抗体阳性患者15例，共有24例患者检测到了Survivin和(或)Livin抗体，Survivin和Livin抗体的表达没有相关性，提示乳腺癌患者外周血中的抗Livin抗体可作为一种新型肿瘤抗原来检测，从而提高其筛查率和检测率。4.6 神经母细胞瘤 Dasgupta 23等用定量RT-PCR测定了59例神经母细胞瘤(NBL)患者livin表达情况，结果显示晚期39例中17例，局限期20例中6例呈现高表达。用livin传染MYCN扩增的NBL细胞显示其对阿霉素及依托泊苷的抵抗增强；与此相反，用siRNA沉默livin基因则增强了NBL细胞自发的和药物诱导的凋亡。通过多变量分析预后因素显示livin高表达的病人比MYCN扩增的病人预后更差。livin的高表达保护了肿瘤细胞免受基因毒性药物的影响，而这种作用可以使用siRNA技术阻断。以上发现提示livin可能为NBL耐药的治疗提供新的靶点。5 Livin与肿瘤治疗5.1基因治疗方面的研究以RNA干扰技术抑制Livin基因的表达，从而增加肿瘤细胞的凋亡率是目前肿瘤靶向治疗的研究热点。梁春艳等24利用RNA干扰技术体外合成Livin的dsRNA并转染人乳腺癌ZR-75-30，通过RT-PCR及Western blotting方法检测发现，转染后的乳腺癌细胞株中LivinmRNA及蛋白质显著减少，而联合蒽环类药物(表柔比星)后细胞凋亡率亦显著增加。Yuan等25同样用RNA干扰技术转染非小细胞肺癌A549细胞及103H细胞，发现敲除Livin基因能抑制上述2种肿瘤细胞生长并诱导其凋亡，同时使细胞对传统化疗药物阿霉素及顺铂的敏感性显著增加，这些研究使我们看到了Livin在基因治疗方面具有广阔前景。 5.2 免疫治疗方面的研究 Andersen等26研究发现，黑色素瘤细胞表达的Livin作为一种肿瘤抗原物质在外周血中会产生特异性地识别Livin的抗体，而且肿瘤组织中有较多的自然杀伤细胞浸润，在浸润于肿瘤微环境中针对Livin的反应性T细胞表面包被HLA-A2抗原复合体，它对黑色素瘤细胞具有细胞毒作用。而Hiroyuki等27研究亦发现，Livin蛋白中的一段特殊氨基酸序列(Livin7KWFPSCQFLL)与HLA-A24有很高的亲和力，体外刺激具有Livin 7肽片段的HLA-A24阳性肺癌患者的外周血淋巴细胞，可使其产生肽特异性的CTLs(细胞毒淋巴细胞)，而这些诱导产生的CTLs细胞对Livin/ML-IAP+的肺癌细胞具有毒性作用，但在无Livin表达的肺癌组织中上述刺激并不产生CTLs。以上研究结果说明Livin可作为肿瘤免疫治疗的一个靶点。5.3 IAP抑制剂的研究 IAP与肿瘤发生发展有密切关系。筛选有高选择性抑制肿瘤活性的化合物，研制基因特异性的拮抗剂是有价值的途径。SMAC是线粒体在凋亡过程中产生的内源性的线粒体源性的蛋白。在胞浆中SMAC结合和抑制IAPs，可以促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的过度增生28-30。随着近年Smac类似物HtrA2/Omi以及特异性拮抗XIAP的蛋白XAF-1的发现，使IAP抑制剂成为肿瘤治疗药物研究开发的新亮点31-32。5.4 耐药方面的研究 Wang X33等研究发现livin在HCT-8/V大肠癌细胞中高表达，并且对几种化疗药物耐药。用shRNA干扰抑制Livin基因的表达，促使HCT-8/V大肠癌细胞对长春新碱、依托泊苷、5-氟尿嘧啶引起的凋亡增强。化学敏感性分析确定了这个结果并表明HCT-8/V细胞的抗药表现型被逆转。这些数据使我们看到针对livin基因的治疗可能是逆转化疗耐药有希望的目标。6 展望livin通过多种途径发挥其抗细胞凋亡作用，与肿瘤的发生、发展、预后和耐药密切相关。但是其许多细节我们仍然不是很清楚，例如其对预后评价的价值有多大，是不是最优选择，与其它IAP成员的关系，最佳的治疗途径等等。因此，要使其真正成为有临床意义的肿瘤诊断、治疗的新靶点，我们需要对其进一步深入地研究。 参 考 文 献1Lin JH，DengG，HuangQ，et al.KIAP，a novelmember ofthe inhibitorof apoptosis protein familyJ.Biochem Biophys Res Commun，2000， 279(3):820-831.2Vucic D，StennickeHR，PisabarroMT，et al.ML-IAP，a novel inhibitorof apoptosis that is preferentially expressed in human melanomasJ. 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