《发酵论文》word版.doc

枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵的研究（董祖明 生物工程091 指导老师： 焦扬老师）（农业与生物技术学院 ，甘肃 张掖 734000）摘要：对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶的培养基成分及培养条件进行优化，在单因素基础上通过正交实验确定发酵培养基各成分最佳配比，采用优化培养基对发酵菌株的培养条件进行单因素实验。结果表明：最佳发酵培养基为：葡萄糖 10 g/l、麦芽糊精 20g/l、柠檬酸钠 3 g/l 、CaCl2 3g/l、KH2PO 10g/l、FeSO4 0.5g/l最适发酵条件为: 接种量3.5%、装液量50 mL/ 250 mL、溶氧50.5%、32,发酵36h,在最佳培养条件下碱性蛋白酶酶活可达507.53U/ml关键词：枯草芽孢杆菌 碱性蛋白酶 发酵 培养基 引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为911,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成1。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究2。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产3。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口4。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点5。本研究通过正交试验对枯草芽孢杆菌发酵培养基及培养条件进行优化,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种: 枯草芽孢杆菌（发酵试验室培养）1.1.2 试剂: 酪氨酸 福林试剂 0.4mol/l三氯乙酸 0.4mol/l碳酸钠溶液 干酪素 亚硫酸钠溶液 标准缓冲液（PH 6.86）1.1.3 培养基 种子培养基： 胰蛋白胨 5g/l 酵母浸粉5g/l 葡萄糖 10g/l KH2PO4 18g/l121蒸气灭菌20min。摇瓶培养基：酵母浸粉 0.875 g/l 麦芽糊精 5 g/l 柠檬酸钠 0.15 g/l KCl 0.46 g/l CaCl2 0.15 g/l K2HPO4 0.5 g/l pH 值自然，121蒸气灭菌20min。 发酵培养基：葡萄糖 10 g/l麦芽糊精 20g/l柠檬酸钠 3 g/l CaCl2 3g/l KH2PO 10g/l FeSO4 0.5g/l PH 值自然，121蒸气灭菌20min。 1.1.4 器材：自动式发酵罐 高压灭菌锅 超净工作台 电热恒温水浴锅 低温离心机 分光光度计 PH计1.2 方法1.2.1 碱性蛋白酶活力的测定取碱性蛋白酶菌种发酵液于离心管内，4000r/min离心20min取上清液,采用Folin 酚法测定碱性蛋白酶活力酶活力5。酶活力单位定义为：在温度55 pH10.0 的条件下，1min 水解酪素产生1g 酪氨酸所需酶量定义为1 个酶活力单位，以U 表示。 A680*K*n*4 样品的酶活力(U/ml) 10式中：A- 样品平行实验的平均吸光度K-吸光常数4 -反应试剂的总体积(ml) 10 -反应时间(min ) n -稀释倍数1.2.2 不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶的影响无机盐分别选用0.02% Na2HPO4、0.02% KCl、0.02% K2HPO4、0.02% NaCl，以不加无机盐为对照组，在其他条件不变的情况下，以酶活力为指标，确定最佳无机盐。1.2.3 发酵罐发酵1.2.3.1种子培养：在无菌条件下自斜面菌种一环菌体，接入装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，在32振荡培养12-16h。1.2.3.2 发酵前的准备：发酵培养基的配制，电极的标定及发酵罐的实消1.2.3.3 接种：将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火打开接种口，将种子培养液注入。接种量为3.5%，盖好接种口，调节搅拌转速至所需数值，培养开始。1.2.3.4 发酵过程控制：控制过程基本参数的记录（种子液OD600，PH,Do,温度），发酵过程直接参数记录（PH,Do,温度，转速）及离线参数记录（OD600，酶活，PH值）1.2.3.5 粗酶液分离：继续发酵后将发酵液离心（3500r/min，15min）收集上清液保存，收集离心沉淀进行灭菌处理。1.2.3.6 清洗发酵罐，空消，结束发酵过程。2 结果与分析2.1 碱性蛋白酶酶活力测定标准曲线碱性蛋白酶测定结果如图1 所示。由该曲线求得线性回归方程为：Y=89.317X-2.048，R2=0.9935。本法在酪氨酸浓度060g/ml 范围内有良好的线性关系。2.2 不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶酶活力的影响由图2 分析：K2HPO4与Na2HPO4相比较， HPO42-一定时，Na比K对芽孢杆菌产酶较好。K2HPO4与KCl相比较，K一定时，HPO42-比Cl-对芽孢杆菌产酶有促进作用。KCl与无CaCl2相比较，对芽孢杆菌产酶无影响。所述，KCl有利于芽孢杆菌产碱性蛋白酶。2.3 发酵过程曲线在摇瓶发酵的基础上,进行了5 L 罐中的放大实验。接种量3.5%，发酵温度32，装液量50ml。对发酵过程中的直接参数PH,DO及离线参数OD600，酶活值等进行测定并记录数据，得到的数据如下表所示。 表一 发酵参数记录表时间（h） 转速（r/min） OD600 DO(%) PH 稀释倍数 酶活（U/ml）10 60 0.7 39.8 6.82 25 185.2 12 60 0.486 50.5 6.83 25 390.314 196 0.426 44.0 6.86 25 507.5316 197 0.432 49.4 6.98 25 228.1318 221 0.428 51.2 6.93 25 195.6920 60 0.540 50.0 6.86 25 167.43根据表一所示数据作酶活力高低与OD600及DO关系的发酵过程曲线，所绘出的曲线如下图所示 图一 发酵过程曲线 由图一可知，开始发酵0-10小时内菌体浓度较高，酶活和DO都很低。可能是菌体接种后对发酵环境有一个适应的过程，主要进行菌体的快速生长，产生的粗酶较少，故酶活较低。10小时后虽然菌体浓度开始下降，但菌体的酶活和溶氧迅速增加，且在14小时酶活达到最大值，为507.53U/ml，说明此阶段碱性蛋白酶已经开始大量合成。查阅文献可知枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶活力可达1000以上，而测出的酶活力较低，说明菌体生长不太好。14-18小时以后酶活迅速下降，OD600无明显变化趋势，而DO又开始增加，在18小时DO达到最大值，说明溶氧过高对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶有抑制作用。由图可知在溶氧达到第一个峰值50.5%时碱性蛋白酶的酶活力达到最大值，溶氧达到最大值51.2%时酶活已开始下降并达到一个较低的水平，故发酵的最佳溶氧为50.5%。18小时以后DO及酶活都下降并降到一个很低的水平，发酵结束。由表一数据可知，发酵过程中PH在6.86附近波动，并无太明显的上升趋势，说明产生的碱性蛋白酶较少。查阅相关文献可知枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶酶活在1000以上时，其发酵液PH在9-11之间，说明枯草芽孢杆菌并没有大量的产生碱性蛋白酶。 3 结果与讨论采用枯草芽孢杆菌为发酵菌株，用单因素试验确定并优化了最佳培养基成分和最适发酵条件，最后得到最佳培养基为（g/L）：葡萄糖 10 g/l、麦芽糊精 20g/l、柠檬酸钠 3 g/l 、CaCl2 3g/l、KH2PO 10g/l、FeSO4 0.5g/l。最佳培养条件为： 接种量3.5%、装液量50 mL/ 250 mL、32,发酵 36h,溶氧为50.5%，在最佳培养条件下碱性蛋白酶酶活可达507.53U/ml本研究 采用5 L 发酵罐、装液量为3L,研究了芽孢杆菌产碱性蛋白酶的扩大培养条件。在摇瓶水平的基础上，结合本实验室5 L 小型发酵罐具体情况和相关文献，以菌体DO值、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600，考察它们对碱性蛋白酶产率的影响。结果表明，较优发酵条件是，DO为50.5%、温度32、粗酶液中酶活力507.53U/mL参考文献：1 姚刚，程建军，孙鹏 枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶的研究.食品科学 2009.VOL.30.NO.232 李祖明，李鸿玉，白志辉等 碱性蛋白酶生产菌的育种及其液态发酵条件的研究. 食品研究与开发.2008年5月 第29卷第5期3 王福荣 工业发酵分析 北京:中国轻工业出版社.1997.90-924 肖怀秋,林青录,李玉珍 中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质J.食品与生物技术学报.2005.24(4):42-265 舒丹,李宏,严建华 高温芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵条件及酶学性质研究J四