课件：第十六章细菌基因工程.ppt

第十六章 细菌基因工程,第一节 细菌基因工程的发展现状和发展趋势,2019,-,1,细菌与基因工程关系密切,细菌是单细胞、结构简单的原核微生物，目前对其生理代谢途径以及基因表达的调控机制研究较为透彻 细菌的物种和代谢类型多种多样，对环境因子敏感，易于获得各类突变株 生长速度快，便于大规模培养，容易进行遗传操作,2019,-,2,细菌基因工程的发展简史,1973年，波依尔(Boyer)和科恩(Cohen)首次完成外源基因在大肠杆菌中的表达 1982年，第一个基因工程产品利用构建的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的产业时代。,2019,-,3,细菌基因工程的发展现状,1、细菌工程菌与人类药物生产 1982年美国首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。 未来市场前景广阔的药品： 单克隆抗体、反义药物、基因治疗药物、可溶性蛋白质类药物和疫苗,2019,-,4,细菌是生产蛋白药物的最好生物反应器,对化学方法难以合成的中间体进行合成，从而生产活力更强的衍生物，例如更高效的抗肿瘤药物羟基喜树碱和前列腺素 使微生物产生新的合成途径，从而获得新的代谢产物，例如去甲基四环素等 利用微生物产生的酶，对药物进行化学修饰，例如多种半合成青霉素的生产 生产天然稀有的医用活性多肽或蛋白质，如用于抗病毒、抗肿瘤的药物干扰素和白细胞介素等,2019,-,5,2、细菌工程菌与环境保护,原理：采用现代分子生物学和分子生态学的原理和方法，充分利用环境微生物的生物净化、生物转化和生物催化等特性的功能基因，构建高效表达的基因工程菌进行污染治理、清洁生产和可再生资源利用 优点： 效率高、成本低、反应条件温、无二次污染，同时可以增强自然环境的自我净化能力。,2019,-,6,应用范围： 工业和生活废水治理 重金属污染土壤的生物修复 (bioremediation) 农药残留的微生物降解 生物制浆和生物漂白 石油污染的消除 友好可再生材料的合成等,2019,-,7,超级工程菌(superbug),美国把降解芳烃、萜烃、多环芳烃的质粒转移到能降解脂肪烃的假单胞菌体内，培育出能同时降解4种烃类的“超级工程菌” ，降解石油烃类的能力比野生菌高几十倍乃至几百倍 “超级工程菌”是第一个获得美国专利的生物工程菌株,2019,-,8,3、细菌工程菌与食品、饲料及其他工业,食品生产：利用生物技术构建的品质优良的食用乳酸杆菌能提高生产菌在食品发酵过程中的稳定性，改善发酵食品的质量并且降低了成本，大大缩短生产周期。 相关产品：酶制剂、氨基酸、维生素、增稠剂、有机酸、乳化剂、表面活性剂、食用色素、食用香精及调味料等,2019,-,9,4、细菌工程菌与农业生产,各类农业微生物的应用是实现农业可持续发展和保护生态环境的有力保证。 由于自然菌株和传统技术本身的一些缺陷与不足，诸如研究周期长、成本高、活性低等，实现农业微生物的产业化受到很大限制 基因工程为微生物遗传改良提供了有效手段,2019,-,10,第二节 细菌基因工程的表达系统,表达系统组成：外源基因、表达载体和宿主细菌。 1）表达载体(expression vector) 用来控制转录、翻译、蛋白质稳定性以及克隆基因产物的分泌等遗传元件。 2）宿主细胞： 大肠杆菌、枯草芽胞杆菌 酵母及动物、植物、昆虫细胞、动植物个体等,2019,-,11,一 表达载体构建原则,表达元件的选择和利用 克隆载体：满足在宿主菌中复制和选择要求的载体。 质粒载体，整合载体。 大肠杆菌外的细菌中应用的克隆载体一般是穿梭载体，含有大肠杆菌克隆载体的序列，便于在大肠杆菌中扩增和制备。 例如，用于苏云金芽胞杆菌的克隆载体pHT304的基础骨架为大肠杆菌克隆载体pUC18, 另装有能在Bt中复制的质粒复制区序列ori1030和用于选择的红霉素抗性基因。,2019,-,12,1. 启动子的选择,1）选择强启动子超量表达外源基因，最大限度地获得蛋白质产物。 如E. coli 中的lac、tac和T7等可调控强启动子 2）采用基因自身的启动子或宿主菌的相关性状基因的启动子表达关键基因，使宿主菌表现出一种特殊的性状，或启动其他产物的大量合成。 不一定要高量表达，只需正常表达。,2019,-,13,2. 转录的有效性,在表达载体上设法除去衰减序列或插入抗转录终止序列以避免转录的提前终止，促使mRNA有效地延伸和终止。 在终止密码子后增加终止子序列，使转录有效终止，并延长mRNA的半衰期。,2019,-,14,3. 翻译起始的有效性 翻译起始是多种成分包括mRNA、16SrRNA、fMet-tRNA，核糖体S1蛋白、蛋白合成起始因子之间的协同作用的过程。 要使翻译起始效率最高，要满足以下条件： 选用最佳起始密码子AUG（偶尔为GUG和UUG）； S-D序列（Shine-Dalgarno sequence）接近或与以下序列完全相同：5AGGAGG3； 除S-D序列外，处于起始密码前的两个核苷酸应该是A和U； 如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高； 在翻译起始区不能形成明显的二级结构。,2019,-,15,4.翻译的有效终止,采用UAA或一连串的终止密码来有效终止原核细胞翻译。,2019,-,16,二 外源基因表达的方式,1外源基因以融合蛋白形式表达 目标基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合，构建成一个融合蛋白基因。 用于融合的表达标签(tag)蛋白和多肽： 六聚组氨酸肽(6xHis)和谷胱甘肽S-转移酶(GST) 利用tag的特性可以对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，因此融合表达既可以保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降解，同时也大大简化了重组蛋白的纯化过程。,2019,-,17,2构建可分泌蛋白，分泌到胞外培养基中,位于蛋白质N端称为信号肽的一段氨基酸序列会帮助蛋白通过细胞膜。通过基因操作可在外源蛋白的N端添加编码信号肽的DNA序列，形成一个分泌蛋白。 缺陷： 仅仅是信号肽序列的存在并不能确保高效分泌，并且革兰氏阴性细菌由于外膜的存在，也不能使分泌蛋白进入周围的培养基。 解决方法： 1）使用革兰氏阳性细菌或真核生物细胞，它们都缺少外膜，能直接分泌蛋白进入培养基。 2）通过遗传工程将革兰氏阴性细菌改造成蛋白质分泌型。,2019,-,18,3. 外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达,包涵体是致密的不溶性复合物，含有大部分的表达蛋白，可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。 一些以可溶性蛋白形式表达时易被降解的蛋白质，以包涵体形式表达时却可以很稳定。通过超声波破碎、离心等能较容易地对之进行初级纯化。用盐酸胍或尿素变性溶解包涵体中的蛋白质，透析除去变性剂后，蛋白质可重新折叠复性。 缺陷：经变性/复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，更有些蛋白尤其是分子量较大的蛋白基本上不能正确进行重折叠,2019,-,19,4. 外源基因在细胞表面的表达 （表面展示技术cell surface display ）,把目的蛋白基因序列(外源蛋白)与特定的载体蛋白基因序列(又叫定位序列)融合后导入微生物宿主细胞，从而使目的蛋白表达并定位于微生物细胞表面。,2019,-,20,三、常见细菌表达系统,大肠杆菌并不一定是所有外源蛋白表达的理想微生物，除了大肠杆菌以外，还有许多其他细菌的表达系统 1、革兰氏阴性细菌通用的表达载体 2、枯草芽胞杆菌表达系统,2019,-,21,1、革兰氏阴性细菌通用的表达载体,pAV10 在低拷贝数、广宿主质粒pRK290的多克隆位点中插入来源于转座子Tn5末端反向重复序列的一段70bp DNA而构建。 来源于Tn5的DNA克隆片段包含两个独立而重叠的启动子，每一个启动子分别负责一个Tn5基因的转录。Tn5能有效地作用于许多细菌宿主，它的启动子也能促进这些生物的转录。,2019,-,22,克隆载体pAV10,四环素抗性基因(Tetr)；单个BglII限制性内切酶位点；复制起点(ori)；启动子(p)；多克隆位点(MCS)。多克隆序列中插入目的基因，使基因处于Tn5启动子(p)的控制之下。箭头表示转录的方向。,2019,-,23,2、枯草芽胞杆菌表达系统,（1）穿梭载体(shuttle vector) 特征：同时具有大肠杆菌载体和枯草芽胞杆菌载体的复制起点 举例： pDG148-Stu，利用大肠杆菌pBR322和枯草芽胞杆菌载体pVB110的复制起点，能够超量表达插入其StuI酶切位点的外源蛋白。,2019,-,24,pDG148-Stu克隆表达载体的结构特点,具有乳糖操纵子调节基因lacI及其调控序列，使外源蛋白的表达受IPTG的调控。 具有一个杂合启动子，它来源于乳糖操纵子的表达调控区域和枯草芽胞杆菌SPO-1菌株的启动子区域，有利于外源蛋白的高效合成。 3个抗性基因作为筛选标记： kan（卡那霉素抗性基因）和ble(博莱霉素抗性基因）可同时用于大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的抗性筛选， bla（氨苄霉素抗性基因）只能用于大肠杆菌的抗性标记。,2019,-,25,pDG148-Stu克隆表达载体,2019,-,26,（2）整合载体(integration vector),特征：能将目标基因整合到宿主的基因组中，一般通过同源重组或转座因子的转座特性实现外源基因的整合。 举例： pDG1730是典型的枯草芽胞杆菌整合载体，可将外源基因整合到-淀粉酶基因内部。 该载体的基本骨架是大肠杆菌的克隆载体和用于革兰氏阳性细菌的红霉素抗性选择标记基因(erm)；用作整合的元件是中间插入了壮观霉素抗性基因(spc)的-淀粉酶基因，其中含有多克隆位点。,2019,-,27,3、微生物细胞表面表达系统,微生物细胞表面展示系统的构成：载体蛋白、目的蛋白和宿主菌株。 位于细胞表面的蛋白都可用于细胞表面展示，常见的载体蛋白包括： 1）大肠杆菌的外膜蛋白和与肽聚糖相关的脂蛋白 2）假单胞菌的外膜蛋白F(OprF)和冰核蛋白INP 3）蜡状芽胞杆菌群的S-层表面蛋白(Surface layer protein) 4）葡萄球菌的表面蛋白A(SpA)，胞外附属结构(如鞭毛)的蛋白等,2019,-,28,为了将目的蛋白展示于微生物细胞表面，需要构建目的蛋白和外表面蛋白的融合。 大多数目的蛋白位于融合蛋白的N端或C端，有时目的蛋白的短片段也可以在融合蛋白的中间表达。,与细菌外膜蛋白在N端或C端连接的目的蛋白 (a)外源蛋白插入到细菌外膜蛋白暴露于表面的环中；(b)形成融合蛋白； 两种情况中，外源蛋白或肽段都是位于细菌细胞的外表面,2019,-,29,微生物细胞表面展示技术的应用,开发一些独特的生物产品如活疫苗、细胞催化剂、细胞吸附剂、生物传感器等，还能开发用于医学诊断、工业、环境保护等的细胞受体等。 存在的问题： 1）开发细胞催化剂时，细胞表面酶的活性与游离酶相比往往降低； 2）在构建细胞表面蛋白库时，有些蛋白的表达量太少以至于难以鉴定； 3）空间阻碍、多亚基蛋白的表达、多种外源蛋白的同时表达等。,2019,-,30,第三节 细菌基因工程的应用,2019,-,31,基因工程的实践主要有3种表现形式,改造细菌使之性状得到遗传改良，获得更好的应用效果，如杀虫、固氮等 制作生物反应器，利用细菌来生产某种物质 为了得到某些高表达量的细胞内代谢产物而细菌进行必要的遗传学改造，将与目标代谢产物合成有关的基因转入到合适的细菌，相当于在宿主菌中重新载入了或加强了某条生理代谢途径，从而在宿主细菌中得到理想的细胞次级代谢产物，如链霉菌中的新抗生素的合成,2019,-,32,细菌基因工程的应用,农业领域的基因工程细菌 食品和工业基因工程菌 重组DNA技术生产医用抗生素 重组DNA技术生产胰岛素和药物前体 环境微生物基因工程菌的应用,2019,-,33,农业领域的基因工程细菌,(一) 微生物基因工程农药 重组微生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌基因工程及应用 （1）增强杀虫毒力 （2）拓宽杀虫范围 （3）延长持效期 （4）克服可能出现的昆虫抗性,2019,-,34,农用抗生素产生菌的遗传操作 杀虫抗病重组微生物 其它重组杀虫抗病微生物 （1）生物囊杀虫剂 （2）基因工程抗病菌 （3）杀虫抗病工程菌,2019,-,35,将Bt毒素蛋白基因转入萤光假单胞菌，使之形成伴胞晶体，将菌体杀死但不破坏伴胞晶体而且菌体外形保持完整，其有效期平均增加了两百多倍，无污染，成为一种新型的微生物杀虫剂，用于蔬菜害虫防治。,生物囊杀虫剂,2019,-,36,（二）微生物肥料,固氮菌，根瘤菌。 解磷菌，巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) 解钾菌，胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus) 植物根际促生菌或植物根圈促生细菌(PGPR) VA菌根真菌，帮助植物吸收矿质营养，特别是磷素营养 腐熟剂，加速高分子有机物分解为小分子养分物的腐生菌 光合细菌，如红螺菌等 复合菌肥，将以上菌肥的两种或多种混合施用，产生比单独施用更好的效果。,2019,-,37,重组根瘤菌,在美国，基因组中整合了外源dctABD基因的重组苜蓿根瘤菌能提高大田苜蓿产量，是世界上首例通过了遗传工程菌安全性评价并进入有限商品化生产的工程根瘤菌。 我国研制的重组大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum) HN32已通过农业部农业转基因生物安全评价审批进行环境释放，是世界上第二例获准进行环境释放的重组根瘤菌。,2019,-,38,食品和工业基因工程菌,乳酸菌基因工程菌 生产食品添加剂的基因工程菌 1氨基酸工程菌 2. 合成L-抗坏血酸的重组菌 3. 生产酶制剂的工程菌 合成靛蓝的工程菌 限制性内切酶的生产,2019,-,39,氨基酸工程菌的应用,将氨基酸生物合成途径中的限速基因导入生产菌中，增加其表达量。 强化表达氨基酸输出系统的关键基因，或者降低某些基因产物的表达速率，最大限度地解除氨基酸及其生物合成中间产物对其生物合成途径可能造成的反馈抑制。 将一种完整的氨基酸生物合成操纵子导入另一种氨基酸的生产菌中，建构能同时合成两种甚至多种氨基酸的工程菌。,2019,-,40,氨基酸的基因工程菌,世界上第一个氨基酸的基因工程菌是产苏氨酸的重组大肠杆菌，构建于1980年，进一步改造后苏氨酸产量高达86.4g/L。 同时间高产苏氨酸的棒杆菌基因工程菌的建构也获得成功，产率达到33 g/L以上。,2019,-,41,合成L-抗坏血酸的重组菌,棒杆菌中分离的2,5-DKG还原酶基因在草生欧文菌中表达后，重组草生欧文菌能将D-葡萄糖转化成2-KLG，L-抗坏血酸的生产因此简化。,2019,-,42,生产酶制剂的工程菌,生物酶工程主要包括三方面内容： 利用基因工程技术大量生产酶； 对酶基因进行遗传修饰； 设计出新的酶基因。,早在1995年就能用基因工程菌生产工业用酶(包括食品与洗洁剂)。目前已有一百多种酶基因导入了工程菌中，包括尿激酶基因和凝乳酶基因等。 除转基因作物外，食品工业上利用基因工程菌生产酶制剂已成为另一个高度应用基因工程技术的领域,2019,-,43,利用重组大肠杆菌从色氨酸合成靛蓝,大肠杆菌合成色氨酸酶。途径A中的萘双加氧酶由NAH7质粒编码；途径B中的二甲苯氧化酶由质粒TOL编码。合成靛蓝的大肠杆菌转化子只含有两种途径之一。,2019,-,44,重组DNA技术生产医用抗生素,1合成新抗生素 2改进抗生素生产 （1）开发能有效利用氧气的链霉菌 （2）转基因产黄头孢工程菌大量生产7ACA(7-氨基头孢酸),2019,-,45,利用链霉菌合成新抗生素,野生型天蓝色链霉菌和质粒pIJ2303产生放线菌紫素，一种链霉菌产生梅德霉素，紫红链霉菌合成榴菌素和二氢榴菌素。但用pIJ2303转化紫红链霉菌Tu22，将同时合成放线菌紫素和一种新的