课件：微生物检测技术演示文稿.ppt

微生物检验技术,讲授:周慧恒,2019,-,1,一、第一讲 二、第二讲 三、第三讲 四、第四讲 五、第五讲 六、第六讲 七、第七讲 八、第八讲 九、第九讲 十、第十讲,目录,一、实训一 二、实训二 三、实训三 四、实训四 五、实训五 六、实训六 七、实训七 八、实训八,实训,2019,-,2,第一讲：微生物及微生物检验概述,1、什么是微生物,酿酒、天花，列文虎克、巴斯德、 科赫,2019,-,3,远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成 了醇香可口的饮料人类最早发明的酒,2019,-,4,天花是感染痘病毒引起的，无药可治，每4名天花病人当中便有一人死亡，而剩余的3人却要留下丑陋的痘痕。 明代以后，人痘接种法盛行起来。到目前为止，天花是在在世界范围被人类消灭或控制的第一个传染病。,天花病毒,2019,-,5,安东列文虎克 荷兰,格拉夫 霍霍夫利特 微生物的鼻祖,无孔不入的微生物，何时何地不在与人们打交道。甚至在我们体内到处安营扎寨，自由出入。可是，人们不肉眼看见它们，因而几千年来，人类竟不知道世界上还有微生物这东西存在。 直到1673年列文虎克用自制显微镜发现了“小动物”的微生物世界！他一生当中磨制500多个镜片，制造400多种显微镜，其中只有9种至今仍有人使用。虽然他活着的时候就看到人们承认了他的发现，但要等到100多年以后，当人们在用效率更高的显微镜重新观察列文虎克描述的 “小动物”，并知道他们会引起人类严重疾病和产生许多有用物质时，才真正认识到列文虎克对人类认识世界所作出的伟大贡献。,2019,-,6,法国科学家路易斯巴斯德(1822-1895) 被后人誉为“微生物学之父”。,证实发酵由微生物引起,免疫学预防接种,鹅颈烧瓶实验也创造了一种有效的灭菌方法巴氏灭菌法。,反驳微生物自然发生说,鹅颈烧瓶实验,科学虽没有国界，但科学家却有自己的祖国,德国的波恩大学 普法战争爆发,2019,-,7,传染病是人类健康的大敌。从古至今，鼠疫、伤寒、霍乱、肺结核等许多可怕的病魔夺去了人类无数的生命。人类要战胜这些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一个发现传染病是由病原细菌感染造成的人就是罗伯特科赫。,罗伯特科赫（18431910）-德国医学家,罗伯特。科赫发现结核杆菌一百周年,被后人尊为细菌学鼻祖，传染病的克星，细菌学的奠基人和开拓者,2003年，经过全球10个国家的科学家的共同努力，终于确认了冠状病毒是SARS的病原体。最终判定这种冠状病毒是否真正的元凶，依靠的是100多年前德国伟大的细菌学家科赫提出的“科赫原则”。,1870结婚-1900年30岁生日-1910,2019,-,8,2、微生物的特点 1 .个体微小，结构简单 2. 分布广，种类多 3 .繁殖快，数量大 4.易于变异，适应力强 5 .易于培养，代谢活力强,2019,-,9,3、微生物对产品的污染,2019,-,10,直接致病微生物： 致病性的细菌、人畜共患传染病病原菌和病毒、产毒霉菌和霉菌毒素，可直接对人体致病和造成危害。 沙门氏菌、痢疾杆菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌 、肉毒梭菌等 结核杆菌、布氏杆菌、炭疽杆菌,2019,-,11,相对（条件）致病微生物 通常条件下不致病，在一定特殊条件下才有致病力的微生物。 葡萄球菌、链球菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌等,贮存方式不当 人体抵抗力下降,2019,-,12,非致病微生物 对人体本身无害、是引起食品腐败变质、卫生质量下降的主要原因。因此又叫腐败菌 非致病菌、不产毒霉菌以及酵母 假单胞菌属、黄杆菌属、产硷杆菌属、芽胞杆菌属、梭状芽胞杆菌。,2019,-,13,4、污染的预防与控制,2019,-,14,pH,aw,2019,-,15,消毒 -杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的FF。 灭菌 -用物理和化学方法杀灭或清除传播媒介上一切微生物的方法。,2019,-,16,利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用。低温通常起抑菌作用。 嗜冷微生物适合于10生活的细菌，最适生长温度在20左右。 嗜温微生物生长温度在1545之间，最适生长温度在37左右的细菌。 嗜热微生物生长温度在3075之间，最适生长温度在55，在100以上温度生长，称为嗜高热微生物。,2019,-,17,消毒与灭菌方法 a、干热灭菌法 1.火焰灭菌（酒精灯） 2.干热灭菌（电热干燥箱） b、湿热灭菌法 1.巴氏消毒 2.煮沸消毒 3.间歇灭菌法 4.加热蒸汽灭菌法（高压灭菌锅） c、辐射 d、过滤 e、化学方法,2019,-,18,5、微生物检验的意义 a、它是衡量食品卫生质量的重要指标。 b、通过食品微生物检验，可以判断食品加工环 境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价。 c、食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针。,2019,-,19,6、微生物检验的对象,菌落总数,大肠菌群,2019,-,20,各种曲霉的菌落 青霉的菌落,2019,-,21,啤酒酵母的菌落 红酵母的菌落 各种酵母菌的菌落,2019,-,22,7、微生物检验的质量管理 一)内部质量控制 a.为保证实验室连续评价结果的可靠性和精密度，必须对所用方法的重复性及再现性定期测定 b.对于不同的控制系统，实验室必须建立限值，超过限值应采取纠偏措施。 实践中内部质量控制可包括： (1)系统地使用一式双份的菌落计数测定； (2)由同一检验人员和几个检验人员作平行样； (3)定期或不定期进行盲样测试。,2019,-,23,（二)外部质量控制 a.实验室应参加外部的质量控制活动,对其开展的每一项检测均应参加相应的室间质量控制。 b.对有关实验室或管理机构发出的测试样品应严格地当作普通样品一样处理,这样一种方法有助于实验室每天测试的准确性和重复性,是对实验室所用的方法,试剂,设备,人员能力的测试。,2019,-,24,C.从室间样品测试中的错误可以发现实验室的不足之处,对工作人员的教育改进可以提高实验室的检测质量。 d.对返回的室间测定评级中存在的问题应当召集体员工讨论,改进措施(包括方法的改变,员工的改变,员工的再训练,培养基和试剂购买来源的更换等)应当记录在案。,2019,-,25,e.某些项目缺少室间质量控制,实验室可以设置室内质量控制,每半年自行评估一次。 f.经常参加微生物实验室间质控活动,有助于加强检测人员的基本功训练,增强样品检测过程中“量”的概念。 g.实验室间的质控可在国内外范围进行,有能力的实验室应力争参加国家际间质控活动,树立良好的检验信誉。,2019,-,26,8、微生物检验的发展趋势 近年来，随着分子生物学和微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。,2019,-,27,1. 电阻抗法 电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，已经开始应用于食品微生物的检验 。其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。,2019,-,28,2. 快速酶触反应及代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，根据酶的特性，选用相应的底物和指示剂，反应的测定结果有助于细菌快速诊断。如美国3M Petfifilm TM微生物测试片可分别快速测定细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等。,2019,-,29,3.微量生化法 Bachman和Weaver在20世纪40年代后期首先开创了微量生化法。至今，市售的微生物鉴定用试剂盒有多种，常见的有MICRO-ID、API等。API由20个含干燥培养基的微管组成，其中的培养基用于进行酶促反应或糖发酵试验。检验时将预处理的菌悬液加入微管中培养后观察颜色变化，并纪录，输入APILAB Plus软件得出结果。API创建了独特的数值鉴定法，可鉴定15个系列、600多个细菌种。因此，该方法具有简单、快速、可靠等特点。,2019,-,30,第二讲:微生物的形态结构与生理特性,2019,-,31,1、细菌 细菌是一种具有细胞壁的单细胞生物. 细菌的大小以微米（m）为测量单位（一微米等于千分之一毫米）。 根据细菌形态一般分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类。 细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、核糖体和内含物等基本结构。 细菌的特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。,2019,-,32,大肠杆菌,2019,-,33,金黄色葡萄球菌,2019,-,34,2019,-,35,2019,-,36,2、酵母 酵母菌（yeast）是一通俗名称，没有确切定义。 一般认为酵母菌具有以下五个特点： 个体一般以单细胞状态存在 多数出芽繁殖，也有的裂殖 能发酵糖类产能 细胞壁常含有甘露聚糖 喜在含糖量较高、酸度较大的环境中生长酸度较大的环境中生长,2019,-,37,2019,-,38,种类较多，目前已知100多个属，有700多种。 分布广，在水果、蔬菜、花蜜和植物叶子表面以及果园的土壤里。在牛奶、动物的排泄物以及空气中也有酵母存在。大多数腐生，少数寄生。 与人类关系密切,2019,-,39,酵母菌是人类应用比较早的微生物。 在食品方面酿酒、制作面包、生产调味品等。 在医药方面生产酵母片、核糖核酸、核黄素、细胞色素C、B族维生素、乳糖酶、脂肪酶、氨基酸等。 在化工方面使石油脱腊、以石油为原料生产柠檬酸等。 在农业方面生产饲料（例如单细胞蛋白SCP）。 在生物工程方面作为基因工程的受体菌。,2019,-,40,3、霉菌,指凡是在基质上长成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状的丝状真菌，其菌丝体比较发达而又不产生大型子实体。,2019,-,41,霉菌的菌落特征： 液体培养时的特征： 如果是静止培养，菌丝往往在液体表面生长，液面上形成菌膜。如果是震荡培养，菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球，亦可形成絮片状，与震荡震荡速度有关。 菌落特征 霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。,2019,-,42,常见的霉菌： Aspergillus flavus（黄曲霉） Asp.niger（黑曲霉） Mucor mucedo（高大毛霉） Rhizopus oryzae（米根霉） Pencillinm chrysogenum（产黄曲霉） Neurospora crassa（粗糙镰孢霉） Trichoderma viride（绿色木霉）,2019,-,43,土曲霉的菌落,2019,-,44,黑根霉的菌落,2019,-,45,青霉的菌落,2019,-,46,黑曲霉的菌落,2019,-,47,5、病毒 病毒的结构十分简单，没有细胞结构，只有蛋白质外壳和内部的遗传物质。,豌豆萎黄病毒,烟草花叶病毒,大肠杆菌噬菌体,球状,杆状,蝌蚪状,2019,-,48,1,2,3,5,2019,-,49,病毒不能独立生活，必须寄生在其他生物的细胞内。一旦离开活细胞，病毒的生命活动就会停止。,2019,-,50,6、微生物的营养 微生物同其他生物一样都是具有生命的，微生物细胞直接同生活环境接触并不停地从外界环境吸收适当的营养物质，在细胞内合成新的细胞物质和贮藏物质，并储存能量，微生物从环境中吸收营养物质并加以利用的过程即称为微生物的营养（nutrition）。 营养物质是微生物构成菌体细胞的基本原料，也是获得能量以及维持其它代谢机能必须的物质基础。微生物吸收何种营养物质取决于微生物细胞的化学组成。,2019,-,51,分析微生物细胞的化学成分，发现微生物细胞与其他生物细胞的化学组成并没有本质上的差异。,2019,-,52,7、微生物的生长,1.个体生长很不明显，持续很短时间就繁殖。,2.在实际的工作中，常以微生物的群体为单位来研究微生物的生长。,2019,-,53,调整期,对数期,衰亡期,稳定期,2019,-,54,温度 A：微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度 B：绝大多数微生物最适生长温度为25 -37 C：最适温度范围内，微生物的生长速率随温度上升而加快；超过最适生长温度后，微生物的生长速率急剧下降 D：依据最适生长温度，可将微生物分为低温型、高温型、中温型。,2019,-,55,氧 依据对氧的需求，微生物分为好氧型微生物（多数细菌、大多数真菌）；厌氧型微生物（某些链球菌、某些产甲烷杆菌）；兼性厌氧型微生物（酵母菌） PH A：每种微生物的最适PH不同 B：多数细菌最适PH是6.57.5；真菌5.06.0； 放线菌7.58.5。 C：超过最适PH，影响酶活性、细胞膜稳定性等,2019,-,56,7、微生物的代谢 微生物在生长发育和繁殖过程中，需要不断地从外界环境中摄取营养物质，在体内经过一系列的生化反应，转变成能量和构成细胞的物质，并排出不需要的产物。这一系列的生化过程称为新陈代谢。 微生物的代谢(metabolism)是指发生在微生物细胞中的分解代谢(catabolism)与合成代谢(anabolism)的总和。,2019,-,57,1、微生物实验室守则 微生物实验室守则包括以下几个方面：人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等。,第三讲:微生物常规技术与培养基 的配制,2019,-,58,影响药品微生物的检验结果的因素。 a、实验人员在取样或试验过程中污染微生微。 b、生物学分析方法本身的误差。 c 、样品中或环境中微生物分布不均匀等因素在 药品检验中，为保证微生物试验数据的可靠性和重现性，药品微生物实验室必须使用经验证的检测方法并按良好的实验室规范指导试验。,2019,-,59,无 菌 室 布 局 无菌室应远离交通干道、厕所及污染区，应选上、下水道及其他安装适宜的位置。无菌室的配套设施包括洗刷、培养基配制、消毒灭菌、灭菌物品存放和传输、培养间、结果观察、试验菌实验和办公室等，要集中，减少污染，便于管理和使用。,2019,-,60,2019,-,61,2、培养基的配制,定义：指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的的营养基质，（混合养料）。,特点：任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素（碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水），且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。,用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品。因此，它是进行科学研究，发酵生产微生物制品等的基础,2019,-,62,原则： a.培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确） b.营养物的浓度与比例应恰当（营养协调） c.物理化学条件适宜（条件适宜） d.根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）,2019,-,63,配料,溶解,调pH,过滤,分装,灭菌,包扎,摆斜面,贮存,步骤：,2019,-,64,2019,-,65,（1） 肉汁蛋白胨培养基-细菌 牛肉膏 5g ，氯化纳 5g，蛋白胨 10g，水 1000ml，pH7.2-7.4 （2） EC肉汤-大肠杆菌 胰蛋白胨20g，3号胆盐(或混合胆盐) 1.5g，乳糖 5g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾 1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL,2019,-,66,（3） 麦芽汁培养基-酵母菌 干麦粉加4倍水，在60度保温34h，用碘液试验至糖化完全为止，调糖度为100巴林，煮沸过滤，pH5-6.0 （4） 查氏培养基-霉菌 NaNO3 3g，FeSO4 0.01g ，K2HPO4 Ig，KCl 0.5g ，MgSO4.7H2O 0.5g，蔗糖 30g ，H2O 1000ml ，pH5-6,2019,-,67,2019,-,68,2019,-,69,2019,-,70,3、消毒的基本概念与方法 消毒 是指采用物理、化学和生物的方法消除物体的表面病原菌和有害微生物的过程，使之达到无害化。 消毒的保证水平为10-3 ，（指一件物体品经消毒处理后仍然有微生物存在的机率）。 灭菌 则是指指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子的过程。 要求的水平为10-6 灭菌是绝对杀灭而不是相对，灭菌包含消毒但消毒不能包含灭菌。,2019,-,71,无菌 经灭菌处理后的物品称为无菌物品 无菌操作 用于防止 微生物进入范围的,2019,-,72,清洁消毒法,2019,-,73,清洁消毒法,2019,-,74,清洁消毒法,2019,-,75,2019,-,76,消毒灭菌的级别 灭菌：杀灭一切微生物，达到无菌。 常用方法：高压蒸汽、电离辐射、等离子体、二氧化氯、过氧乙酸、戊二醛等。 高水平消毒 可杀灭各种微生物，包含细菌芽孢。 常用方法：热力、紫外线、二氧化氯、臭氧。 中水平消毒 可以杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒方法。 常用方法：超声波、碘类、醇类、季铵盐。 低水平消毒 只能杀灭细菌繁殖体，亲脂病毒的化学消毒方法。,2019,-,77,物理法,化学法,浸泡法,喷雾法,热力消毒法,生物 净化法,辐射消毒法,燃烧法,烤箱法,煮沸法,干热法,湿热法,紫外线灯照射法,电子灭菌灯法,电离辐射法,擦拭法,高压蒸汽灭菌法,常用消毒灭菌的方法,熏蒸法,日光曝晒法,2019,-,78,第四讲：微生物检验常规技术,1、微生物染色及显微形态观察技术,细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。 根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。 简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。,2019,-,79,2019,-,80,a.常用碱性染料进行简单染色，因为细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时其分子的染色部份带正电荷，易与细菌结合使细菌着色。,2019,-,81,一）、涂片： 无菌操作 滴的生理盐水的量不能太多 菌不能加太多，涂布要均匀,2019,-,82,二）、干燥和固定 三）、染色 四）、水洗 五）、干燥：不能擦,2019,-,83,六）、镜检 必须完全干燥后才能用油镜观察 油镜使用原理及注意事项,2019,-,84,油镜操作步骤 1、低倍镜观察（寻找观察目标）。 2、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 3、油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使物象清晰-观察记录。最大光圈,2019,-,85,4、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。 5、将显微镜各部分还原，放回箱中。,2019,-,86,b.格兰氏染色是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液的作用： （1）碱性染料 草酸铵结晶紫液。 （2）媒染剂 碘液，其作用是增强染料与菌体的亲 和力，加强染料与细胞的结合。 （3）脱色剂 乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱 色。利用不同细菌对染料脱色的难易程度不 同，而加以区分。 （4）复染液 蕃红溶液，目的是使经脱色的细菌重新 染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。,2019,-,87,操作步骤 （1） 涂片 取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制成涂片，干燥、固定。要求单一菌种、混合涂片（在载玻片同一区域用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片）各制一片。 （2） 染色 用草酸铵结晶紫染液染色1 min，用水冲洗。 （3） 媒染 滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1 min，水冲去碘液。 （4） 乙醇脱色 以95%乙醇脱色2030s。立即用水冲洗净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够则阴性菌被误染为阳性菌。,2019,-,88,（5） 复染 蕃红染液复染1 min，水洗。 （6） 吸干并镜检 若研究工作中要确证未知 菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌 进行染色作为对照。,2019,-,89,2、微生物的计数技术,直接计数,核酸计数,培养法,显微镜直接计数 比浊法 电子计数器计数法,荧光定量PCR,最大可能数法 混菌法 平板计数法,2019,-,90,平板计数法 使不可见的微生物在人工培养基平板上生长成为可见的菌落（CFU），从而可用肉眼进行观察、计数。较其他方法直观准确 ，是一种经典的检测活菌数的方法，也是目前国际上通用的方法。,2019,-,91,平板计数法示意图,2019,-,92,2019,-,93,平板计数的优缺点 优点：直观、准确、可靠 该方法不仅可以检测到样品中的有效活菌数，而且可以检测到产品的微生物污染情况，即杂菌数。 缺点： 由于培养基和培养条件的局限性，所得的结果一般低于实际值。,2019,-,94,操作步骤 （一）检测前的准备 （二） 操作过程（母液制备、系列稀释、加样、涂布、培养、菌落识别、计数） （三） 计算,2019,-,95,稀释、加样和涂布注意事项 适宜稀释度：根据标准或企业提供的信息选择稀释度。 系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样和涂布不同稀释度时也要更换吸管和刮刀。 每个培养皿均要标明培养基种类、样品编号、稀释度 稀释和加样要准确，涂布均匀及时，使用的吸管量程要适宜。 无菌水对照，以检查吸管、刮刀以及稀释用水灭菌是否彻底、操作过程是否合乎无菌要求。,2019,-,96,3、菌种保藏技术 菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料。 微生物保存不妥容易发生变异，或被其他微生物污染，甚至导致微生物死亡。 菌种的长期保藏是非常必要的。 菌种保藏要求具有该菌种的详细历史及有关实验资料。,2019,-,97,基本原理是在挑选优良纯培养物并使新陈代谢处于最低或几乎停止的状态，即使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。 基本措施是低温、真空、干燥。,2019,-,98,常用保藏方法,定期移植法 液体石蜡法 真空冷冻干燥法 -80低温冻结法 液氮超低温冻结法,2019,-,99,第5讲微生物检验工作流程与质量控制,1、微生物检验工作流程,a.送检样品的处理,样品的接收 样品数量的多少，其包装是否完好，样品温度是否变化。 干燥的样品有无受潮现象，冷冻样品是否融化，易腐样品有无腐败变质现象。 采样记录。,2019,-,100,b.样品登记 注明柜号、品名、客户、采样日期/时间、采样人、追踪编号（半成品）等。,2019,-,101,试剂准备 准备检验项目用的所有药品试剂，并放入传递窗。,c.检验前准备工作,2019,-,102,药品称量及溶解,2019,-,103,药品分装,2019,-,104,包扎、灭菌及验证,2019,-,105,平皿、吸管的包扎,2019,-,106,干燥灭菌,2019,-,107,更换工作服 在第一缓冲间内更换专用工作服，并戴口罩、内帽、鞋套。 消毒处理,2019,-,108,取样 取样时，对样品袋口用75%酒精喷洒消毒，用无菌器具（镊子、剪刀、小勺）进行取样。,d.样品检验,2019,-,109,做样 菌落总数、大肠菌群、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、霉菌/酵母菌的具体检验根据检验规程操作。,2019,-,110,培养 操作完成后，放进适宜温度的培养箱内进行培养适当的时间。（例如，LST在361培养48h，BPW在37 水浴培养18h 等）,2019,-,111,洗涮及晾干,2019,-,112,e.结果报告,2019,-,113,2、微生物检测的质量控制,1检验人员 2仪器.设备 3检验培养基,试剂 4检验环境 5采样 6样品的接收和预处理 7检验质量 8校验的执行 9参考菌株及其保存 10实验室内外部质量控制 11检验报告及结果质量控制,2019,-,114,1检验人员,(1)微生物检验不能完全依赖全自动鉴定仪器,检验工作中每一步骤均需要有高度的主观分析和判断能力,与个人的经验.技能和微生物检验基础知识水平密切相关. (2)除要求微生物检验人员必须具备严肃认真的工作态度,精密细致的观察和操作习惯,注重个人卫生外,还必须训练掌握微生物检验技术. (3)检验人员应执行上岗前培训制度,上岗前培训合格方能上岗操作,还要主动参加学习,培训,讲座,学习新技术,掌握微生物学检验方法,标准及相关法律法规,2019,-,115,(4)参与编写测试程序及仪器操作程序,学习质量保证体系知识和计量学基本知识 (5)参加各类水平测试和盲样测试,提高检测水平和分析问题,解决问题的能力 (6)微生物学检验室负责人应定期对检验人员进行专业知识和操作熟练程度的考核,提高检验人员的素质.,2019,-,116,3培养基,为保证干粉培养基质量指标，在实际工作中应注意； （1）加强包装的密封性能； （2）使用时尽量缩短开盖时间； （3）一般干性培养基放在低温干燥的环境中保存，对于易受潮的品种，启用后宜放入干燥器中保存； （4）由于配制水分不同，启用次数或时间增加，干粉培养基的pH值可能会有所变化，应随时略加调整。,2019,-,117,培养基的配制应严格按照标准规定的方法进行操作，并做好原始记录。 为保证培养基必须在玻璃容器，搪瓷或铝锅中进行，如用铜，铁器皿，会对微生物生长有毒害作用； 配制培养基时应按检验项目规定的配方添加，不得随意增减或更改培养基成分。 此外，要用专用的角匙取药品，避免交叉污染而影响检验结果；,2019,-,118,培养基配制最好用蒸馏水或去离子水，避免使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质； 不同类型的微生物对pH值的要求不同，配制培养基时应测调值，如测定结果与所要求的值不符，则用1N NaOH或1N HCL溶液进行调节。,2019,-,119,7检验质量,除按国家标准方法对所需检验项目进行检测外，在实际工作中还应注意以下几个方面，否则会影响检验结果的准确性： （1）在定量检验时用重量法还是用体积法，检验结果会有误差，因为此重不等于1的样品，1ml和1g的化验结果绝不会相等. 一般固态的样品宜用重量法,液体样品宜用体积法. 但对粘性液体(如酸奶),如用体积法,会粘附一定量的样品在吸管上,因此此类样品最好用重量法.,2019,-,120,(2)如检样需用用无菌水或无菌生理盐水稀释,则最好用均质器或组织碎机,以800010000转/min的转速处理1min,制成均匀的菌悬液. (3)样品稀释时,常会滞留少量样品在吸管内外,应多加注意. 吸入液体后,应沿管壁慢慢注入递增的稀释中,特别注意此时吸管尖端切不可碰到稀释液中.,2019,-,121,(4)在培养基注入检样,菌悬液时,注意培养基温度宜在45 -50 之间,并使培养基与检样,菌悬液充分混合. (5)微生物培养时,应根据要求选择正确的培养温度和时间. (6)应用无菌水或无菌生理盐水作空白对照,如果在空白对照中检出细菌,则可认为培养基质量存在问题或在操作过程中存在污染情况. 另外,采用标准菌种作阳性对照,观察培养基的质量情况. (7)整个检验过程应严格遵守无菌操作. (8)及时检查结果,做好原始数据记录.,2019,-,122,2019,-,123,2019,-,124,2019,-,125,2019,-,126,2019,-,127,2019,-,128,2019,-,129,2019,-,130,2019,-,131,2019,-,132,2019,-,133,2019,-,134,2019,-,135,2019,-,136,2019,-,137,2019,-,138,2019,-,139,2019,-,140,2019,-,141,2019,-,142,2019,-,143,2019,-,144,2019,-,145,2019,-,146,2019,-,147,2019,-,148,2019,-,149,2019,-,150,2019,-,151,2019,-,152,2019,-,153,2019,-,154,2019,-,155,2019,-,156,2019,-,157,2019,-,158,2019,-,159,2019,-,160,2019,-,161,2019,-,162,2019,-,163,2019,-,164,2019,-,165,2019,-,166,2019,-,167,2019,-,168,201