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细胞因子诱导的肿瘤杀伤细胞的研究进展摘要: 近年来,随着生物技术的发展，肿瘤治疗有了新思路。过继细胞免疫治疗是治疗肿瘤的一种重要方法。而细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers，CIK)和树突状细胞(dendritic cell，DC)是肿瘤过继性免疫治疗的两个重要部分，CIK是高效肿瘤杀伤细胞，它能通过自身细胞毒性与分泌性细胞因子发挥杀伤作用；DC是目前研究发现的人体内功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cells， APC)，它能识别抗原，激活获得性免疫系统；两者联合培养，可以更好的杀伤肿瘤细胞，成为当今肿瘤治疗研究热点之一。1、 DCCIK细胞实验研究1.1 DC细胞的生物学特性及抗肿瘤机制DC细胞是目前发现功能最强的专职抗原提呈细胞。体内、外研究均表明，DC细胞能诱发肿瘤宿主对特异性抗原的免疫应答，提高肿瘤宿主免疫效应细胞的细胞毒活性。当前多用外周血单核细胞在GM-CSF和IL_4等诱导培养成为具有抗肿瘤作用的成熟Dc。Dauer M等1报道，用常规细胞因子组合培养外周血cDl4+细胞，48 h后便可成功获得成熟DC。此法获得的Dc与常规方法所得到的DC具有同样的形态学特点，免疫表型分子的表达百分率相似，且缩短了培养时间。减少了培养体系污染几率，并避免反复冻存对细胞的影响，同时减少费用，具有未来研究和治疗应用的使用价值o。6 Dauer M，0bemaier B，Henen J，et a1Mature dendritic cells derive from human monocytes within 48 hours：a novel 8trat。gy for dendritic ceU diIkrentiation I如m blood precur80玛J Immunol 2003。170：406940767 Xin Gu柚，XS Le“g，JiRun Peng et a1A novel，r印id strat89y to f0姗dendritomas fbm hum锄dendritic cell8 8nd heDatoceUular carcinolnaceU line HCCLM3 cells using mature dendritic cellB derived f如m humaIIperiphenl blood CDl4+monoc”e8 within 48 hour8 of ivitr0 cultureworld J Gastroenterol，200410(24)：356435681.2 CIK细胞的生物学特性及抗肿瘤机制CIK细胞是人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗IFN一1、CD3McAb、IL-2等)共同诱导培养而获得的一群异质细胞，其表面标记CD3CD56呈双阳性，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点（1）。CIK细胞可分泌包括IL-4和IFN-Y在内的多种细胞因子，具有较淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）及肿瘤侵润淋巴细胞（TIL）更高的增殖能力和更强的杀瘤活性。CI K 发 挥杀伤作用的机制主要有:释放具有细胞毒性的细胞质颗粒物杀伤靶细胞;Mehta等13研究认为，CIK释放胞浆颗粒人细胞外间隔，通过颗粒内含物发挥对靶细胞直接杀伤作用。另外证实通过豁附分子LFA-1 /ICAM-1相互结合后，CIK能够分泌大量的含有一氮一甲苯碳酞基一左旋一赖氨酸硫甲苯醋的胞浆毒性颗粒，这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解。产生大量的炎性细胞因子直接或间接杀伤肿瘤细胞。大量实验证明，培养的CIK可以分泌多种细胞因子，如TNF-+,IL -2,G M-CSF,IF N-y等不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。表达FasL，诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris等14提示，CIK在培养过程中表达FasL，能抵抗FasL+肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡，又可诱导Fas+肿瘤细胞凋亡，发挥对肿瘤细胞慢性杀伤作用，保证抗瘤活性的长期持久。岑溪南等Us通过实验证实，CIK可诱导bcrabl阳性的K562细胞凋亡。促进T细胞增殖活化。任欢等E63研究认为，CIK体内抗瘤作用可能与促进宿主体内T细胞增殖活化有关。并推测，原始的CD3+ CD56+ T细胞随CIK输注体内后，在宿主机体状态或肿瘤抗原刺激下转变成具有杀瘤活性的细胞毒性T细胞，发挥抗瘤作用。此外，DC能够分泌刺激分子和细胞因子，促进CIK的活化和分化;通过刺激抗原特异性T 细胞增殖，间接启动CIK116,171，从而促进这一机制的实现。CIK对肿瘤的杀伤作用是通过识别肿瘤表面表达的一系列相关配体，因此CIK不只是依赖于一种抗原，可以通过系统地传递针对多种肿瘤产生杀伤作用J。而且CIK可以通过多种方式杀伤肿瘤细胞。CIK能活化肿瘤细胞凋亡基因，使FLIP(FLICE-inhibitoryprotein)、bcl一2、bcl-xL、抗细胞凋亡因子(DADl)和survivin基因表达上调，从而诱导肿瘤细胞凋亡。另外，CIK可以通过直接对肿瘤细胞的杀伤作用和提高患者的免疫力来抑制肿瘤的生长和复发归J，如与细胞表面受体结合导致细胞质毒性颗粒释放而杀伤肿瘤细胞；CIK还可以产生大量炎性细胞因子，实现对肿瘤细胞的抑制和杀伤；CIK可以分泌多种细胞因子，如IL-10、IL4、IFN一1等，不仅对肿瘤细胞有直接的抑制作用，还可以通过调节机体的免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。在CIK的临床研究中发现，CIK对肿瘤细胞具有强大的杀伤作用，很少引起移植物抗宿主病，说明CIK具有较好的耐受性。并且对已经产生耐药性的患者也安全有效叫。CIK,细胞的抗肿瘤作用机制还未完全明了, 目前认为CIK细胞可被淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)有关识别结构激活导致胞浆毒性颗粒释放而杀伤肿瘤细胞; CIK,细胞也可因表面CD3受体结合而激活,导致胞浆毒性颗粒释放产生溶瘤作用,CIK细胞可产生大量炎性细胞因子实现对肿瘤细胞的抑制或杀伤,CIK细胞也可诱导肿瘤细胞凋亡,因CIK细胞能活化肿瘤细胞凋亡基因; 使得FLIP,Bcl-2,Bcl-xL,DAD1和survivin基因表达上调。CIK细胞能促使Fasl的合成，研究发现CIK细胞培养上清中含有具有生物学活性的可溶性的Fasl。因此,CIK可通过配体受体（Fas：Fc）介导的的方式诱导肿瘤细胞凋亡，故CIK细胞尤其适用于+AM9阳性肿瘤的免疫治疗!ICANJ等#&$用过氧化酶免疫染色法发现,Ga,G$/a,Yb 细胞能分泌穿孔蛋白%3+3该蛋白与靶细胞溶解有关!9+-%&和细胞间黏附分子%&%Y,-Q%&在介导,Yb细胞杀伤靶细胞时起着重要的13CIK细胞的分离和培养徐艳等（2）无菌采集健康人外周血，肝素抗凝，以FicouHyPaque淋巴细胞分离液分离获得界面层的单个核细胞(MNC)，RPMI一1640洗3次，调细胞密度为4l&mL；贴壁培养3h，收集悬浮细胞用含10(体积分数)胎牛血清(FBS)的RPMI一1640液调细胞密度为2ltPmL，第0天加入rhlFN一1 1000umL，放置37，5(体积分数)CO：培养箱中培养24h后添加终浓度为20ngmL的CD3McAb和500UmL的rhIL-2。继续培养，以后每3天半量换液1次，补加rhIL-2。（2）徐艳，刘丽娟，高建梅，王林坪等 DCIK细胞特异性抗肿瘤生物学活性研究 J 中国现代医生 2010，48（27）：08-10DC细胞是目前发现功能最强的专职抗原提呈细胞。体内、外研究均表明，DC细胞能诱发肿瘤宿主对特异性抗原的免疫应答，提高肿瘤宿主免疫效应细胞的细胞毒活性。Marten3等将外周血来源的CIK细胞和同源DC细胞共培养一段时间后发现，DC和CIK细胞的增殖能力明显增强，共培养14 d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出2倍左右。共培养24 h后，DC细胞白细胞介素(IL)-12的分泌量为单独培养时的693倍，与DC细胞共培养的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性显著提高。近期，国内许多学者观察了不同来源的DC细胞与CIK细胞共培养后DCCIK细胞的表型、体外增殖和细胞毒性的变化，相关报道均支持Marten的实验研究，认为DC和CIK细胞共培养可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖和免疫功能。张嵩等还通过动物实验探讨DC-CIK细胞在肿瘤治疗中的作用。动物实验结果表明，化疗后应用DC_CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失。而且，DCCIK细胞的抗肿瘤效应对机体免疫系统功能不产生影响，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应用DCCIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要临床意义。Schmidt-wolf等1于1991年首次发现在外周血淋巴细胞(PBL)中加入IFN-hlLl2和CD3 mAb，可培养出大量CD3和CD56双阳性T细胞，是非MHC限制性细胞毒性淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非限制性杀瘤活性，称其为CIK。CIK是具有典型细胞标记的一类异质细胞群，同时表达T细胞和NK细胞的表面标记CD3+CD56+61。Olioso等一1在研究CIK的免疫治疗时发现，CIK培养至第21天时CD3+表达率为97，比培养前扩增了34倍；而CD3+CD56+表达率为30，比培养前扩增了270倍。所获得的CIK对难治性淋巴瘤和转移性肿瘤均有较好的疗效。CD3+、CD56+T细胞是CIK群体中的主要效应细胞，兼有T细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点。CIK 是 将 人外周血单个核细胞在体外经过多种细胞因子(IFN-y,rI L-2、抗CD3McAb和IL-1a)共同诱导获得的一群异质细胞4)，同时表达CD3和CD56 两种膜蛋白分子5，所以它既有T细胞强大的抗肿瘤活性又有NK细胞的MHC限制性杀瘤特点。CIK的抗瘤作用特点是增殖速度快，杀瘤活性高，抗瘤谱广，对正常骨髓造血前体细胞毒性小，对多重耐药肿瘤细胞敏感，能抵抗肿瘤细胞引起的效应细胞Fas-FasL的凋亡等。它比淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokinea ctivatedk illerc ells,L AK)具有更强大的肿瘤杀伤活性，在重症联合免疫缺陷鼠/人淋巴瘤模型、S180(克洛肉瘤)荷瘤鼠模型、OCUM-2MD3胃癌腹膜种植转移模型及肝癌(BEL-7402细胞系)动物模型等的研究中CIK在清除病灶，抑制转移，延长生存方面明显优于LAK细胞EC。对于多种肿瘤细胞系(包括NK细胞敏感的K562和NK细胞不敏感的Hela,H L260，人B淋巴瘤细胞系OCI-LY8，人胃癌腹膜转移细胞株OCUM-2MD3，肝癌细胞系BEL27402)均表现出强大的杀伤活性。作用原理主要是取出肿瘤患者体内部分有潜力的免疫细胞，由多种免疫因子刺激诱导，经过体外的干预，扩增其数量，激活和强化其功能，并教会它们如何识别机体内的异常细胞，如恶性肿瘤细胞或者病毒感染细胞然后再回输到患者自己体内。肿瘤胞群，同时具有T细胞和NK细胞这两种治疗有r新的突破。树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，DC是人体内专职抗原递呈细胞，CIK是高效肿瘤杀伤细胞，前者识别病原，启动获得性免疫系统，后者通过发挥自身细胞毒性与分泌性细胞因子杀伤肿瘤，两者联合可以更好的杀伤肿瘤细胞，被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞,它具有增殖能力强、杀瘤活性高和杀瘤谱广、临床应用不良反应小的特点,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞。本文综述了DC-CIK细胞的生物学特性、作用机制等基础研究的最新进展。关键词:细胞因子诱导的杀伤细胞;过继性细胞免疫疗法;生物学特性细胞因子诱导的杀伤细胞( CIK) 是一类异质细胞群，由上世纪80 年代中期Schmidt-wolf 从外周血单核细胞中诱导产生，同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，兼具T 淋巴细胞强大的杀瘤活性和NK 细胞的非MHC 限制性，故又被称为NK 细胞样T 淋巴细胞。与以往报告的一些抗肿瘤效应细胞相比，CIK 细胞杀瘤活性更强、杀瘤谱更广。因此，以自体CIK 细胞为主体的肿瘤过继免疫治疗已逐渐成为肿瘤生物治疗中最活跃的应用与研究领域之一，是国内外关注的焦点。近年来，肿瘤的常规治疗方法均取得了很大改进，患者的长期存活率有所提高。手术、放射治疗和化学治疗能治愈部分肿瘤患者，但由于不能杀死全部肿瘤细胞，多数患者仍不能免于复发或转移的发生。作为现代肿瘤治疗的第4 种模式，以调动机体的免疫功能来清除肿瘤微小残留病灶或明显抑制肿瘤细胞增殖为基础的肿瘤免疫治疗，被越来越多的患者接受。过继性细胞免疫治疗杀伤机制不同于化学治疗,不存在耐药性问题,但不同个体间的疗效差异很大。NC I ( nationalcancer institute)统计显示,过继性细胞免疫治疗的有效率为7% 40% 3 。建立一种科学的理论基础,作为分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗的桥梁,使这两种治疗方法能够优势互补、协同杀伤耐药或复发的肿瘤细胞,成为肿瘤生物治疗研究者迫切需要解决的问题。 3 Edwards BK, Brown ML, Wingo PA, Howe HL, Ward E, RiesLA, et al. Annual report to the nation on the status of cancer,197522002, featuring population2based trends in cancer treatment J . J Natl Cancer Inst, 2005, 97 (19) : 140721427.目前,仍未有一种有效的方法能够预测过继性细胞免疫治疗的疗效,导致了过继性细胞免疫治疗的盲目性,因此,疗效预测方法的建立对过继性细胞治疗的规范化具有重要意义。过继性细胞免疫治疗的疗效取决于两个方面,一方面是过继性免疫细胞的质和量,另一方面是肿瘤组织的情况(包括肿瘤类型、瘤块大小、病理类型及免疫分子表型等) 。过继性免疫细胞的量,可以通过优化制备条件来获得更多的过继性免疫细胞。过继性免疫细胞的质主要是指细胞的功能状态。免疫效应细胞发挥杀伤作用是免疫活化性和抑制性受配体共同作用的结DC和CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,前者识别抗原、激活获得性免疫系统,后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞,二者联合确保了一个高效和谐的免疫体系。Marten等 7 将外周血来源的CIK和同源的DC共同培养一段时间后发现DC和CIK的增殖能力明显增强,共培养14 d后,