及其衍生技术在动物传染病防制中的应用课件

第八讲 PCR及其在疾病防制中的应用,一、 PCR的概念 二、 PCR基本原理 三、 PCR反应体系 四、 PCR的过程及条件 五、 PCR衍生技术 六、 PCR在动物疾病防制中的应用,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）又称体外核酸扩增技术，是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模拟天然DNA的复制过程，在附加的一对引物之间诱发重复的聚合酶反应。PCR包括DNA模板的变性（denaturation）、引物退火（annealing）及多核甘酸链的延伸（extension）等三个步骤组成的多次重复循环，使末端被引物5端限定的微量特异性DNA片段成指数形式积累。通过PCR，可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核甘酸片段。,PCR于1983年由美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等发明，1985年由Saiki等在Science杂志上公开报道，1987年获得专利，Kary Mullis因此获得1993年诺贝尔化学奖。,聚合酶链反应将靶DNA作为模板，与模板片段两端已知的3序列互补的两种寡核苷酸为引物，经过模板DNA变性、模板与引物退火结合以及在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸，合成与模板链互补的新DNA链。 目的基因的扩增是依据体内DNA的复制过程设计的。根据时间和温度，一个PCR循环可分为三步反应。,第一步，高温（9495）变性，高温使模板DNA双链间氢键断裂而解离形成两条单链（高温变性后突然降温，以保持单链形式）；第二步，低温（5556）退火，退火使特异性引物寡核苷酸片段按碱基配对规则与变性的单链DNA模板上的相应互补区配对结合（当然，同时也存在两条模板链之间的结合，但由于引物有高浓度、结构简单等特点，所以退火主要发生在模板与引物之间）；第三步,中温（72）延伸，在4种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）底物和Mg2+存在的条件下，从引物的3端开始，由DNA聚合酶催化合成与模板链互补的新DNA链。,每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板。由于扩增中碱基排列顺序由靶DNA决定，因此PCR的扩增具有高度特异性。经n次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，理论值应是2n。PCR扩增能力是十分惊人的，理论上经过30次的循环反应，可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106107倍的扩增。扩增产物可通过凝胶电泳、Southern印迹杂交或DNA序列分析等进行检测。,（一）DNA聚合酶 聚合酶是一种利用一段既成的脱氧核糖核酸或核糖核酸作为核酸模板，催化脱氧核糖核酸或核糖核酸生成多聚核苷酸的酶。DNA聚合酶的作用是将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，且不发生解离。分子生物学中经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶（Klenow 酶）、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶以及反转录酶等。,早期PCR存在的问题是，使DNA变性的温度也能使DNA聚合酶变性。1976年 ，Chien分离出热稳定性聚合酶。1986年 ，Erlich从一种 生活在温度高达75的热泉中的栖热水生菌（Thermus aquatcus）中分离纯化出适于PCR的热稳定DNA聚合酶TaqDNA聚合酶。 Saiki等人于1988年成功地将热稳定的TaqDNA聚合酶应用于PCR扩增，使PCR实现了自动化。,在加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系中，TaqDNA聚合酶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，以结合在扩增区段两端引物3端为起点，按53的方向合成新生互补链（TaqDNA聚合酶具有53核酸外切酶活性，而缺乏35核酸外切酶活性）。这种DNA聚合酶具有耐高温的特性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR反应全过程的需求。,TaqDNA聚合酶的最适温度为7580，每个酶分子合成速率约为150个核苷酸/s，即使在70，延伸速率亦可达到60个核苷酸以上。一般情况下，PCR选择72作为延伸温度。 纯化的TaqDNA聚合酶在体外无35外切核酸酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程中可引起错配。其在复制DNA过程中错误掺入核苷酸的比率为1/7500。当采用低浓度的dNTP（各20mol/L）、1.5mmol/LMg2+及复性温度高于55时，可提高酶的专一性，降低合成的错配率。另外也可以将其与具有35外切核酸酶活性的DNA聚合酶联用，以此来降低错配率。,TaqDNA聚合酶具有类似于末端转移酶的活性，可在新生成的双链DNA产物的3端加上一个碱基，尤其易加dATP。因此，克隆PCR产物到载体上时，可直接将构建的脱氧核苷酸转移酶载体与PCR产物连接，也可先用Klenow片段将PCR产物的3端的A去掉变为平端，再与平端载体连接。,（二）模板 PCR反应的模板（templete）可以是cDNA、基因组DNA或RNA。对于病毒DNA或质粒DNA，可直接经热处理后作为模板加入。对于血液、血斑、精液、羊水、口腔上皮细胞、尿样、毛发、石蜡包埋组织等，可以提取其基因组DNA进行PCR。现已发展出许多具体特殊样品的处理方法，有些已商品化。而当用RNA作为模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。,TaqDNA聚合酶还具有反转录活性。在23mmol/LMg2+浓度下，68时出现类似反转录酶的活性，若有Mn2+存在时，则反转录效果更佳。随着cDNA的合成及Mn2+的螯合，这个酶又能催化模板的聚合反应。利用这一活性，可直接用于反转录PCR，尤其适宜短片段的扩增，而不用先在另一个试管内进行cDNA合成反应。 以往用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增时，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过多次该酶结构与功能的改造，以及对PCR操作的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分子。,理论上，102104拷贝数的模板即可满足各种PCR过程。为了保证反应的顺利进行及特异性，一般认为，以染色体DNA作为模板时，其模板用量应控制在0.10.2g之间，而以重组DNA为模板时，则仅需ng级水平。,在提取DNA或RNA的过程中，所用的许多试剂，如SDS、酚、乙醇、蛋白酶K等在一定的浓度时均可能影响PCR。相反，许多试剂则能改善扩增的效率。氯化四甲铵（tetramethylammonium chloride，TMAC）能改善引物退火的特异性，而甜菜碱则能增加A-T序列的稳定性、降低G-C序列的稳定性，这对于扩增G-C丰度较高的序列非常有用。核苷酸类似物如7脱氮2脱氧鸟苷三磷酸对于扩增易形成二级结构的序列也是有用的。,（三）引物 所谓PCR扩增引物（primer），是指人工合成的与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的寡核苷酸片段，包括引物1和引物2两种。引物1又称Watson引物，是5端与反义链互补的寡核苷酸，用于扩增编码链或mRNA链；引物2又称Crick引物，是3端与正义链互补的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链。两引物在模板DNA上的结合位点之间的距离决定了扩增区段的长度。实验表明，1kb之内是理想的扩增跨度，2kb左右是有效的扩增跨度，而超过3kb时，普通的TaqDNA聚合酶就无法得到有效的扩增，而且也难以获得一致的结果。,引物可以决定PCR扩增的特异性与长度，因此引物设计的正确与否是关系到PCR扩增成败的关键。引物设计一般应遵循如下原则： 引物长度 引物不宜太短或太长，一般以1636bp为好。引物太短时会影响PCR的特异性，而引物过长时，则会增加成本和引物的Tm值。Tm值如果超过TaqDNA聚合酶的最适延伸温度，也会明显影响产物的特异性。 G+C含量 引物中的G+C含量，一般以4060为宜。,碱基分布 4种碱基应随机分布，嘌呤或嘧啶不要有3个以上的连续排列。尤其在引物的3端，不能存在3个以上G或C的连续排列，否则会形成引物与核酸G（或C）富集区之间的错误互补，进而影响PCR特异性。 引物自身不含互补序列，否则会形成发卡式的二级结构。 两个引物之间的互补或同源碱基应少于4个，否则会形成引物二聚体，尤其在引物的3端。 引物于非特异性靶区之间的同源性要小于70或者连续互补同源碱基少于8个，否则会导致非特异性扩增。,引物3端是引物延伸点，因此不能错配。3端最好是G或C，切忌A，也忌是编码密码子的第三个碱基，否则会因密码子第3位的兼并性而影响扩增的特异性。 引物的5端可以修饰，包括增加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，以及引入突变位点、启动子序列和蛋白质结合DNA序列等。之所以能进行如此修饰，是因为5末端碱基限制欠严格，只要与模板DNA配对的引物足够长，其5末端可以不与模板匹配而呈游离状态。,在许多场合都要使用的兼并引物，实际上是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。如若PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推演而来，就需合成兼并引物。 为了减少非靶序列的扩增，应用嵌套引物技术能使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。 在反应系统中，引物浓度一般要求在0.10.5mol/L之间，浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。 引物变性温度值应维持在5580之间，以接近72为最好。,（四）底物 dNTP为PCR合成DNA的底物 （substrate），各种dNTP浓度应相同，一般浓度范围为20200mol/L。如果dNTP浓度过低，则反应速度变慢 ；而当dNTP浓度过高时 ，则容易发生掺入错误，影响特异性。,（五）缓冲液 根据实践经验，一个50100l的标准反应系统，应包括20mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.5）、100 mmol/L KCl、1 mmol/L DTT、0.1 mmol/L EDTA、0.5 Tween20和1.5 mmol/L MgCl2。Tris-HCI缓冲液可稳定pH值，KCl有利于引物退火，而DTT与Tween20则可以保护TaqDNA聚合酶的催化活性。,（六）PCR反应系统 PCR反应体系包括引物、dNTPs、核酸模板、耐热性DNA聚合酶、适宜的缓冲液和Mg2+浓度。 一般情况下，一个50100l体积的标准PCR反应体系，其中应含有50 mmol/L KCl，10 mmol/L TrisHCl（室温，pH8.3），1.5 mmol/L MgCl2，明胶或牛血清白蛋白，2种引物各0.25mol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物dNTP各200mol/L，模板DNA0.1g，TaqDNA聚合酶2.5IU。,PCR反应的一般过程及条件: 变性 94 5min 变性 94 30s 复性 4565 30s 延伸 72 45s8min 最后一次延伸 72 7min 反应终止后，将样品保存于4或进行凝胶电泳，Southern印迹杂交或DNA序列分析以鉴定是否得到特异的扩增产物。,2535个循环,PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。目前，已衍生出多种PCR技术。 （一）反转录PCR （二）锚定PCR （三）反向PCR （四）不对称PCR （五）多重PCR （六）着色互补PCR （七）免疫PCR （ 八）套式PCR,（一）反转录PCR 反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）用于扩增RNA样品。即先用反转录酶从RNA开始，反转录合成cDNA，再按常规的PCR方法对cDNA进行扩增。这一技术广泛应用于RNA和RNA病毒的检测。,RT-PCR的关键步骤是RNA反转录成cDNA。而由cDNA进行的PCR扩增则与一般的PCR没有差别。用作模板的RNA可以是总RNA，也可以是mRNA。所有基因的mRNA都带有polyA尾巴，因此，所有的mRNA都可以用寡聚物（oligodT）作为引物与之3端配对，在反义引物或寡聚物（oligodT）的引导下，合成cDNA，再按普通PCR方法用目的基因的两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的基因序列。,（二）锚定PCR 通常进行的PCR必须知道欲扩增DNA或RNA片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行扩增。而当欲扩增片段的序列未知时，则可通过锚定PCR（Anchore PCR）进行扩增。基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在 cDNA 3端加上同源多聚物（polydG）尾，通过与其互补的锚定引物（polydC）来保证扩增反应的特异性。,（三）反向PCR 常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，而反向PCR（Inverse PCR）则是对已知序列两侧的一段未知序列进行扩增分析。具体方法为先用一种能酶解已知序列侧面的限制性内切酶消化已知序列，再利用T4DNA连接酶使具有黏性末端的未知序列环化，然后用另一种限制性内切酶切开已知序列。经过上述线状环状再线状的变化，使原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列的中央，这样经PCR扩增便可获得大量未知序列。利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。,（四）不对称PCR 不对称PCR（Asymmetric PCR）又称单链扩增PCR，一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为5011001。这样在合成一定数量的双链产物后，较少的引物被消耗殆尽，在随后的循环中，只有一条引物参加反应，结果合成出大量的单链DNA。由于分子量不同，可通过电泳分离单链DNA。用于制备探针、DNA序列分析及配合RT-PCR研究真核DNA外显子等。,（五）多重PCR 在同一反应体系中加入多对引物进行PCR，扩增同一模板的多个区域，这类PCR技术称为多重PCR（Multiplex PCR）。有时在同一反应体系中同时加入多对不同PCR引物和相应的模板，进行扩增以检测多种病原体的感染，也称为多重PCR。某些疾病，其致病基因片段较长，且常有多处发生缺失或突变，用一对引物进行PCR检测时，有时扩增不到目的片段，这种情况可用多重PCR技术进行检测分析。如果某一片段缺失，或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低，则在相应的电泳图谱上就无相应的片段出现，但可保证其他特异片段出现。目前报道的多重PCR反应，最多可同时扩增12条扩增带。应用多重PCR技术可检测特定序列的存在或缺失。在临床混合感染的检测诊断上具有其独特优势和实用价值。,（六）着色互补PCR 着色互补PCR（Color complementation assay PCR）又称荧光PCR（Fluorescent PCR），是用不同的荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物，通过多重PCR同时扩增多个DNA片段，反应结束后除去多余引物，扩增产物在紫外线照射下能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。通过颜色的有无及其组合可很快检测基因缺失、基因间较大变异或发现某些感染的病毒基因等。其为PCR技术的临床自动化诊断打下了基础。,（七）免疫PCR 免疫PCR（Immune PCR）是将高度灵敏的PCR技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型的诊断技术，是目前最有希望的诊断方法。它的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的连接分子使二者联接起来，这样就可以使作为指示系统的DNA分子通过抗体而特异性地结合到抗原上，从而形成一种特异性“抗原-抗体-DNA复合物”，再通过对其中已知片段DNA扩增，即可证明抗原存在与否。,免疫PCR的特点在于：通过免疫捕获作用纯化检测对象；用于检测的微生物无需事先明确其核苷酸序列；该方法也适用于微生物以外的抗原检测，其前提条件是被检测对象具有良好的抗原性，并且备有其相对应的抗体；无需根据不同对象设计不同的引物。被联接的已知片段DNA相当于指示剂，无论检测对象是什么，只需合成针对该DNA片段的引物即可；省去了普通PCR实验检测RNA病毒的反转录过程，即增加了灵敏度又降低了实验成本。这项技术的发明者Sano.T.（1992）等的试验表明，免疫PCR的灵敏度比ELISA方法高10万倍，足以检出单个抗原分子。,（八）套式PCR 普通PCR的产物DNA往往需要再扩增，以便对之进行进一步鉴定、分子克隆或其他用途。此时，由于DNA产物的末端效应，用原来的那对引物难以实现再扩增的目的。如果在原来的引物内侧重新设计一对引物，再进行新一轮PCR，则很容易获得更大量的DNA产物。如果需要，还可再进一步扩增，但每次需要在上一次产物的内侧重新设计引物。这种采用多对成套引物，逐步扩增DNA内侧片段的PCR就称为套式PCR（Nested PCR）。目前很多分子生物学实验室为了各自的研究需要都在应用这一技术。,（一）传染病的早期诊断和不完整病原体检疫 在早期诊断和不完整病原体检疫方面，应用常规技术难以得到确切结果，甚至漏检。用PCR技术可对未形成病毒颗粒的DNA、RNA或样品中病原体破坏后残留的核酸分子迅速进行扩增测定，且仅需提取微量DNA分子即可以得出结果。,（二）快速、准确、安全检测病原体 PCR技术不需经过分离培养和富集病原体。常规PCR一般只需几十分钟至2小时就可