富硒大米中硒的种态分析研究.doc

富硒酵母中含硒分子的提取和硒的种态分析富硒酵母中含硒分子的提取和硒的种态分析 高愈希(1, 蒲云霞 1,2, 彭晓敏1, 吴刚2 (1. 中国科学院高能物理研究所核分析技术重点实验室，北京 100049；2. 包头医学院基 础医学部，包头 014040） 摘摘 要要 富硒酵母是常见的补硒营养品，其品质与所含硒的种态有关。为了评价富硒酵母 品质，用超声法破碎酵母的细胞壁，用考马斯亮兰法测定提取液中的蛋白浓度以考察细 胞破碎程度，用酶解提取法提取酵母含硒组分，用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测 定硒含量，通过提取液中的硒含量评估提取效率，用反相离子对高效液相色谱与电感耦 合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）分析酶解液中的小分子硒。酶解提取法硒回 收率为 80.97%，其中，SeO32-和 SeO42-占总硒的 1.63 %，65%的硒以易被人体吸收的硒代 蛋氨酸形式存在，其中大部分存在于含硒蛋白分子中。结果表明：超声破碎后用酶解提 取法适合于分析富硒酵母中硒的结合形态且能很好地避免提取液内含硒小分子的转化， 所研究富硒酵母中硒主要以易被人体吸收的含硒蛋白形式存在，品质较好。 关键词关键词: 富硒酵母，种态分析，超声破碎酶解提取，HPLC-ICP-MS 中图分类号：R194.5，O652 Extraction and Speciation of Selenium-Containing Species in Selenium-enriched Yeast GAO Yu-xi1, PU Yun-xia1,2, PENG Xiao-min1, WU Gang2 (1. Key Laboratory of Nuclear Analytical Techniques, Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 China; 2. School of Basic medicine, Baotou Medical College, Baotou 014040, China) Abstract: Se-enriched yeast is a common nurture for selenium complement. Its quality depends on the Se-containing species. To evaluate the quality of selenium-enriched yeast, the Se- containing species were analyzed as following: the walls of Se-enriched yeast were disrupted by an ultrasonic assisted procedure, and then the Se-containing species were extracted with an enzymolysis procedure. The validity of disruption was estimated based on the protein concentration in the disrupting buffer measured with the Bradford method. The extraction efficiency was evaluated based on the selenium content in the extract measured with ICP-MS. The selenium-containing species in enzymolysis supernatant was analyzed with reversed-phase ion- pairing HPLC-ICP-MS to assess the quality of selenium-enriched yeast. The Se recovery for the 收稿日期： 修订日期： 基金项目：本文系国家自然科学基金“硒对植物体内汞的生物学行为及效应的影响 20777075”及“用金 属组学追踪细胞中的金属: 对金属相关的病理生理的启示，20931160430”资助项目 第一作者简介：高愈希（1962） 、男、博士、中国科学院高能物理研究所副研究员，E-mail: enzymolysis procedure was 80.97%, among them, the inorganic forms of Se (SeO32- and SeO42-) was only 1.63% of total Se. A majority of selenium existed in the yeast was in the form of selenomethionine which can be easily absorbed and utilized by humans. The results indicate that the enzymolysis extraction after ultrasonic disruption is a suitable technique of sample preparation for assessing the quality of Se-enriched yeast and can avoid the transformation of Se-containing species in the extracted solution. The tested yeast has a good quality with selenomethionine as its dominant Se-containing forms present in proteins. Key words: selenium-enriched yeast, speciation, ultrasonic disruption-enzymolysis extraction，HPLC-ICP-MS 硒是人体必需的微量元素，在体内具有抗氧化、提高机体免疫力以及拮抗 重金属毒性等功能。人体缺硒可以导致克山氏病、大骨节病等疾病，补硒可以 预防相关疾病的发生1,2。因为硒在地壳中分布很不均匀，我国低硒地带从东北 一直延伸到西南，有数亿居民缺硒3。目前市场上出现了许多富硒食品和保健 品，如富硒米、富硒香菇、富硒螺旋藻、富硒酵母等。富硒食品、保健品的品 质不仅取决于其硒含量，还取决于其中的硒形态，因此硒的种态分析对这些产 品的品质评价是很重要的。 因适合大规模工业化生产和便于食品加工，富硒酵母已成为一种主要的补 硒保健品。富硒酵母中含硒分子种类繁多，其中含硒蛋白是主要的含硒物种4。 含硒蛋白肽链中包含硒代半胱氨酸（SeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet） ，前者在 RNA 遗传密码 UGA 指导下结合到蛋白链中形成硒蛋白，它们是硒生物活性的 主要体现形式。而后者则能够随机替代蛋白链中的蛋氨酸残基，因而普遍存在 于蛋白质中。一般认为，有机硒比无机硒毒性低且更容易被吸收5，存在于蛋 白质中的 SeMet 最容易被人和动物吸收利用6。因而评价富硒酵母品质就必须 分析富硒酵母中硒的形态，这首先需要破碎细胞壁并提取细胞内的含硒分子， 在众多的细胞壁破碎方法中，超声破碎法操作简便、适合在实验室中开展小批 量研究，Ayouni 等7用 40 mg Pronase 在 10 mL TrisHCl (10 mM, pH=8)缓冲液 内提取 1 g 富硒酵母中的硒，超声浴 3 小时将硒全部提出。Capelo 等8在超声 探头（功率 20 W）作用下，用 1 mL 含 1 mg protease S. griseus 的水溶液提取 10 mg 富硒酵母中的硒，超声 5 s 即可定量回收酵母内的硒，但因为长时间超声引 发含硒分子的转化或者因酶解时间太短含硒蛋白未完全水解释放出含硒氨基酸 等原因，随后对含硒分子的形态分析结果都不理想，本文在超声波破碎细胞壁 后，用酶解法提取其中的含硒物种， 用反相离子对 HPLC 与 ICP-MS 联用分析 了提取液中硒的存在形态，用以评估富硒酵母的品质，在酵母含硒组分被基本 提出的同时，尽可能避免了含硒分子的转化。 1 试验部份试验部份 1.1 试剂与材料试剂与材料 富硒酵母采用丹麦 Pharma Nord 提供的 SelenoPrecise yeast (S. cerevisiae, Se-yeast) ；七氟丁酸（HFBA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris） 、硒代半胱氨酸 (SeCys)、亚硒酸纳(SeIV)、硒酸钠(SeVI)、硒代尿素(SeUr)、硒代蛋氨酸(SeMet)均 为 Sigma 公司产品； Pronase E 购自 Merk (Germany )公司；浓硝酸、过氧化 氢、甲醇为国产优级纯试剂；其余为国产分析纯试剂。样品处理及溶液配制全 部使用经 Milli-Q 系统(Millipore)再处理的去离子水配制。 1.2 富硒酵母含硒小分子和硒代氨基酸的提取富硒酵母含硒小分子和硒代氨基酸的提取 0.4000 g 富硒酵母悬于 5 mL 提取缓冲液（0.1 molL-1 Tris-HCl pH 7.5)，冰 浴中超声破碎 10 s，间隔 10 s，共 30 min，控制超声破碎仪功率 80（FS- 300，上海生析超声仪器有限公司，300 W） ，加入 0.03 g Pronase E (protease XIV 型)，混合物在 37下搅拌 18 小时(100-120 rpm)后，离心分离 30 min。上 清用于随后的硒含量测定和种态分析。 1.3 富硒酵母及蛋白质提取液中硒含量的测定及硒种态分析富硒酵母及蛋白质提取液中硒含量的测定及硒种态分析 取富硒酵母(0.05 g)以及酶解提取液(0.2 mL)、提取残渣(0.1g)加入 6 mL 浓 硝酸和 30 %过氧化氢（V/V=5:1）混合溶液，室温静置过夜，170 下密闭消 化 8 h。然后在低于 80 的条件下挥发消化液至剩余体积 0.5 mL。用 2%稀硝 酸定容至 1 mL。 用 ICP-MS（Thermo X7）测量消化后酵母、酶解提取液和残渣中的硒含量。 采用碰撞池（CCT）测定模式，Ar 作为等离子体产生的辅助气体，等离子体冷 却气流速 13.0 Lmin-1，辅助气流速 0.8 Lmin-1，碰撞气为含氢 7.28%（V/V）的 氦氢混合气，流速 7.5 mLmin-1，用 80Se 计数定量。用 2%硝酸稀释硒标准贮存 液(100 mgL-1 质控标准 21, Spex Certiprep Co. USA)配置标准溶液，以 2%硝酸 做空白试验，用标准参考物质牛肝(1577a, NBS, USA，硒含量 0.560.07 gg-1) 检验分析结果的可靠性。 用超滤膜(Millipore Corp, Bedford, MA, cut off 5 KDa)过滤酶解提取上清液 以除去大分子物质。参照文献9用反相离子对 HPLC-ICP-MS 分析滤液内的含硒 小分子并略加改进。色谱分离时间为 30 min，最初和最末 5 min 采用流动相 A（0.3%(v/v)甲醇，0.1%(v/v) HFBA）洗脱，中间 20 min 用流动相 B（3% 甲 醇， 0.1%(v/v) HFBA） ，流速 1.0 mLmin-1，进样量 100 L。由于反相离子对色 谱的流动相可直接应用于 ICP-MS 检测器，色谱与质谱系统采用 PEEK 管直接 连接，以色谱手动进样器为质谱工作的触发信号。通过比较标准化合物与样品 色谱峰的保留时间确定含硒组分。采用峰面积定量，质谱工作条件同上。配置 系列浓度的标准化合物亚硒酸钠、硒酸钠、SeCys、SeUr、SeMet 的溶液（0 100 gL-1 Se）在相同操作条件下做工作曲线。 2 结果与讨论结果与讨论 2.1 富硒酵母中含硒分子的提取富硒酵母中含硒分子的提取 本工作用超声法破碎酵母细胞壁，操作简便、省时，为防止超声过程中产 生的高温对生物活性物质的影响，将样品置于冰浴中破碎，用考马斯亮兰法10 测定破碎所得上清液中的蛋白含量以评估细胞破碎效果。不同破碎时间时得到 的提取液蛋白含量见图 1（N3） 。 从图 1 可见，用提取缓冲液提取富硒酵母中的蛋白质，超声 30 min 后提取 液中蛋白含量基本不再显著升高。为排除蛋白质溶解能力的限制，将提取液分 离后，向残渣中再加入 4 mL 提取缓冲液，超声 30 min，共重复提取 4 次，所 得提取液中的蛋白含量依次为(XSD，N3) 3.010.21、0.750.09、0.190.04、0.070.03 mgmL-1，第二次超声提取所得总 蛋白量为第一次提取量的 1/5，虽然在本工作所选样品及提取液用量条件下，超 声破碎 30 min 后继续超声上清液蛋白含量还有所上升，提示细胞破碎可能尚不 充分，但考虑到较短时间的超声破碎可防止提取液中含硒分子的转化，所以本 工作细胞破碎时间选择为 30 min，且超声时将样品置于冰浴以防止转化。超声 破碎细胞壁后在蛋白水解酶 Pronase E 作用下，将蛋白质水解释放出肽链中结合 的 SeCys 和 SeMet，酶解所得提取液及残渣中的硒含量见表 1。 表 1 富硒酵母酶解提取液及残渣中的硒含量(XSD, N=3) Table 1 Se contents in fractions of enzymolysis extraction procedures. 酶解提取 Enzymolysis extraction 含硒量 Se content /g g-1 占总硒 Se 百分率 a percentage in total Se 上清液 Supernatant1142.774.5880.97 残渣 Residue239.360.9216.96 总计 Total1382.1397.93 注: a富硒酵母硒含量测定结果为 1411.4210.75 g g-1 Note: a Se content in Se-rich yeast measured in this research was research 1411.4210.75 g g-1 硒的提取率约为 81%，除细胞破碎不完全导致部分含硒分子未被提出以外， 还有部分硒可能以硒多糖形式存在于细胞壁留在提取残渣中。较少的样品量、 图 1 不同超声时间所得提取液中的蛋白含量 Figure 1 The plot of protein content in extract against ultrasounding time 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 020406080100 Ultrasounding time/min Protein conteint/mg.mL-1 较大的提取液体积与较长细胞壁破碎时间有利于提高细胞破碎率，在酶解过程 中加强搅拌也可以进一步提高 Se 的提取效率。本工作所提取的硒是富硒酵母中 能为人体吸收利用的主要部分，虽然酶解破坏了富硒酵母中的蛋白质分子，但 膳食中的蛋白进入人体后都是水解成氨基酸后才被吸收利用的，所以用酶解提 取法提取含硒分子对于富硒酵母品质评估是合适的样品制备技术。 2.2 硒含量测定与含硒小分子分析硒含量测定与含硒小分子分析 本文使用ICP-MS分析提取液中的硒，由于使用Ar作为产生等离子体的辅助 气体，测量过程中产生的多原子离子40Ar2+对自然丰度最高的同位素80Se(天然丰 度为49.6%)产生干扰。为了消除这种干扰，在样品测定过程中采用了碰撞池技 术（CCT） ，将产生干扰的多原子离子引入到反应池中与其中的气体相互碰撞， 使多原子离子解离或能量降低难以到达检测器，从而排除干扰。在CCT模式下 得到的80Se工作曲线在1100 ug/范围内线性回归系数(R2) 为 0.9998。测量标准 参考物质的硒回收率为98.21%，分析方法可靠。 本文用反相离子对色谱结合ICP-MS分析了酶解液中的含硒小分子。反相离 子对液相色谱对含硒氨基酸有较好的分离效果11, 以七氟丁酸（HFBA) 作为离 子对试剂，在pH=2-2.5范围内，SeO32-、SeO42-被质子呈电中性并被快速洗脱， 硒代氨基酸质子化后荷正电，和HFBA负离子形成离子对在反相柱上表现特征 保留时间，五种含硒标准化合物及酶解提取液小分子组分的色谱图见图2. 051015202530 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 80Se intensity/cps Retention time/min SeMet SeCys SeUr Se IV Se VI (a) 051015202530 0 20000 40000 60000 80000 100000 80Se intensity/cps Retention time/min SeIV SeVI SeCys SeUr SeMet U1 U3 (e) U2 （b b） 80Se Intensity/cps 012345 0 200 400 600 800 1000 051015202530 0 10000 20000 30000 40000 Se( VI) Se( IV) 80Seintensity/cps Retention time/min SeCys U Retention time/min 80Se intensity/cps SeMet SeUr (d) 012345 0 200 400 600 800 1000 051015202530 0 10000 20000 30000 40000 Se( VI) Se( IV) 80Seintensity/cps Retention time/min SeCys U Retention time/min 80Se intensity/cps SeMet SeUr (d) 图2 标准含硒化合物以及富硒酵母酶解提取液的HPLC-ICP-MS 色谱图。（a）硒标 准化合物；（b）富硒酵母酶解提取液（下）富硒酵母酶解提取液与硒标准化合物溶液等体 积混合（上）。 Figure 2 HPLC-ICP-MS Chromatogram of Se-containing standard compounds and samples. (a) 100 g L-1Se mixed standards: selenite (SeIV), selenate (SeVI), selenocystine (SeCys), selenourea (SeUr), selenomethionine (SeMet). (b) chromatogram of small molecule fraction obtained by enzymolysis extraction of se-enriched yeast(below), and that of the sample spiked with equal volume of the mixed standards (above). 图 2：ICP-MS 法分析 Se 含量的标准曲线 Fig 2: calibration curve for Se quautification with ICP-MS 在本研究条件下，各标准化合物的保留时间见表2，五种含硒小分子标准 可以被很好地分离、检出。富硒酵母经酶解液的小分子组分中共分离出八种含 硒分子，经与含硒标准化合物对照和标准加入检验，其中有SeO32-、SeO42- 、SeMet、SeCys和SeUr等五种含硒分子。另外三种（U1、U2、U3）因缺少更 多的标准物质无法认定。 用五种标准物质配制标准溶液 (0100 Se g /L)，得到的工作曲线的线性回 归方程及回归系数见表2。根据各含硒化合物的工作曲线计算酶解提取液中的已 知含硒物质的含量，结果也列于表2。 表2 酶解提取液中各种含硒分子含量(XSD, N=3) Table2 Contents of Se-containing species in enzymolysis extracts. 含硒物质 Se-containing compounds 保留时间/min Retention time 线性回归方程 Regression equation 回归系数(R2) Regression coefficient 硒含量 Se content/g g-1 破碎液 酶解液 Discrupting supernatant Enzymatic hydrolysate 占总硒百分比 Se% in total Se SeVI1.480.03y=514.51x+267.120.99187.400.0812.950.430.92 SeIV3.260.03y=529.76x+243.090.99417.750.1210.060.240.71 SeCys4.540.02y=543.68x+287.380.99915.260.1315.410.111.09 SeUr11.720.07y=632.21x+301.260.998728.700.422.03 SeMet18.720.03y=563.95x+295,430.996917.830.24921.041.5765.26 总计 Total988.1670.01 除了三种未知含硒物质，所分析5种物质硒含量占酶解液中硒的86.47%，占 酵母总硒的70.01%，其中以SeO32-、SeO42-形式存在的无机硒约占总硒的 1.63%，65%的硒以SeMet形式存在，加上以SeCys和SeUr形式存在的硒，能确 认的有机硒占总硒的68%以上，所研究富硒酵母中的硒绝大部分是有机硒。经 与未酶解前破碎上清液中所含游离态含硒小分子含量比较可知，绝大多数 SeMet来源于含硒蛋白的酶解，所这与杨林生等对某富硒酵母中硒形态分析的 结果基本相符：富硒酵母中绝大多数硒为SeMet形态的蛋白质或其它大分子态 硒，无机态硒仅占3 %左右，而游离硒只占0.01 %12。 Ayouni 等7用 40 mg Pronase 在 10 mL TrisHCl (10 mM, pH=8)缓冲液内提 取 1 g 富硒酵母中的硒，超声浴 3 小时将硒全部提出，用反相 HPLC- ICPMS（Hamilton PRPX100 柱，流动相：对羟基苯甲酸）分析了富硒酵母酶解 液中的硒形态，所检出硒（SeVI，SeMet，Semethionine oxide, Selenomethylcysteine）占酶解液硒的 63%，其中硒代蛋氨酸占检出硒的 80.50%。Capelo 等8在超声探头（功率 20 W）作用下，用 1 mL 含 1 mg protease S. griseus 的水溶液提取 10 mg 富硒酵母中的硒，用阳离子交换 HPLC- ICP-MS(Hamilton PRP-X200 柱，流动相：4 mM 甲酸嘧啶，3%甲醇)分析富硒 酵母酶解液中硒的形态，超声 5 s 即可定量回收酵母内的硒，超声 30 s 可使 SeMet 达最大浓度，然后浓度会有所下降，硒代蛋氨酸回收率为 31%。两种方 法的硒提取回收率高，这与超声的同时酶解从而有效促进酶与底物间的相互作 用有关。但种态分析结果不很理想，Ayouni7未检出 SeCys 和 SeIV 可能是因为 长时间的超声酶解导致这两种分子发生了转化。Capelo 等8仅检出 SeMet，且 回收率仅 31%，除了可能与分离分析方法有关外，还可能与超声酶解时间较短 （30 s）肽链未酶解完全释放出含硒氨基酸有关。本工作所用超声破碎酶解提 取技术可以有效避免操作过程中的物种变化，而且反相离子对色谱结合 ICP-MS 可以检出更多的含硒物种，适合分析富硒酵母中硒的形态。延长超声破碎及酶 解提取提取时间，增加提取缓冲液用量可以进一步改善本提取方法的硒回收率。 本工作优化了超声破碎法破碎酵母细胞壁的工作条件，试验了破碎酶解提 取法提取含硒组分的提取效率，为开展硒酵母的品质评价提供了基础。与两种 超声同时酶解提取含硒组分的方法相比，本酶解提取法可以更好地保持含硒分 子的形态。通过分析富硒酵母酶解提取液中硒的种态，发现所研究酵母中绝大 部分硒以有机硒形式存在，其中大部分以易被人体吸收利用的SeMet形式存在， 品质较好。 参考文献参考文献 1Moghadaszadeh B, Beggs A H. 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