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植物乳汁管生长发育调控的研究进展 植物乳汁管生长发育调控的研究进展 乳汁管（Laticifer）是存在于许多植物中的一种分泌结构，这种结构或是由单个细胞形成的管状结构（无节乳汁管），或是由一系列相连接的细胞组成的管状结构（有节乳汁管）。自然界中大约有12 500种植物中存在乳汁管，而这些植物大约分属22个科900个属，大多数为双子叶植物，只有少数为单子叶植物和蕨类植物。 乳汁管的生物学功能很多，如具有贮藏和运输营养物质、吸收氧气、调节水分平衡和保护植物体等作用1-2。其中，最重要的功能是保护作用，主要在于乳汁管具有完善的凝血系统，即在植物受到外界损伤后，乳汁管中流出的乳汁可以很快凝结成胶状物质并覆盖创伤面，此外，乳汁细胞具有毒性，可以使植物免受外界真菌及其他生物的侵害。 乳汁管中的乳汁具有重要的药用价值和经济价值，如罂粟（Papaver somniferum）的乳汁有麻醉止痛、催眠镇痉、止泻、止咳等功效;桑（Morus alba）的乳汁对部分细菌有明显抑制作用，尤其对变形杆菌、链球菌、灵菌的抑制效果最佳;橡胶树（Hevea brasiliensis）、橡胶草（Taraxacum kok-saghyz）和无花果（Ficus carica）的乳汁是生产天然橡胶的主要原料;产于热带美洲的山榄科植物人心果（Achras sapota）的乳汁可用于制作口香糖。 为此，探究乳汁管的生长发育过程及调控就具有非常重要的理论意义和实践价值。本文综述了植物乳汁管生长发育调控的研究进展，使人们更好地认识植物乳汁管的生长发育规律，为乳汁管生长发育的调控以及植物乳本文由收集整理汁的开发利用提供基础资料。 1 与乳汁管生长发育相关的蛋白质的研究 乳汁管中存在大量的乳汁，乳汁的成分极端复杂，在含乳汁成分的不同植物中以及在不同地点生长的相同物种中，乳汁成分以及含量均有所差异。除含有50%80%的水分外，还含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、激素、酶、蜡、淀粉、萜烯类物质、挥发油、固醇、樟脑、结晶体、类胡萝卜素、单宁、植物碱、盐类、树脂及橡胶等物质。随着二维凝胶电泳、多维液相色谱、质谱、蛋白质芯片和同位素标记亲和标签等技术的成熟，人们开始重视乳汁中蛋白质组学的研究，一些蛋白质不仅在植物生长发育及乳汁管的发育中有着重要作用，而且其中一些酶类还参与以上代谢产物的合成。 Nessler等从罂粟的乳汁中，分离出一组特异的低分子量蛋白质（大约20 ku），称作主要乳汁蛋白（MLPs）。随后，通过免疫印迹实验发现这些主要乳汁蛋白主要存在于乳汁管部分，其他部位则不存在。MLPs可能包括L-3，4-二羟苯丙氨酸脱氢酶，此酶存在于乳汁上清液中，是生物碱合成过程中的关键酶。Nawrot等利用双向电泳技术分离了白屈菜（Chelidonium majus）乳汁中的蛋白质组分，并用液相色谱-质谱联用技术鉴别出了21种蛋白质，其中包括：参与卡尔文循环的蛋白、与疾病防御相关的蛋白、核酸结合蛋白、信号转导蛋白等。Zhao等采用SDS-PAGE电泳、双向电泳以及质谱分析技术对甘遂（Euphorbia kansui）乳汁中的蛋白组分进行了分离和鉴别，共鉴别出了125种蛋白质，按其功能分为3类：乳汁管发育相关蛋白、疾病和防御反应相关蛋白以及参与细胞一般代谢的蛋白（新陈代谢、能量产生、信号转导及次级代谢等），同时也成功检测出了乳汁管在两个不同发育阶段的19种差异表达蛋白，并指出过氧化物酶、细胞色素P450单加氧酶超家族、脂肪氧合酶和多耐药性蛋白ABC转运体家族可能参与乳汁管发育、次生代谢物合成和运输。Damato等通过组合式肽配体库（CPLL）技术深入探索了橡胶树乳汁的蛋白质组，比常规方法多检测出了64种低丰度的蛋白质，并发现了4种新的橡胶树乳汁过敏原。 乳汁管中的许多蛋白质与植物的防御系统息息相关。Obreg等通过蛋白质组学和分子生物学技术从马利筋（Asclepias curassavica）乳汁中分离出两种同工酶ac和ac，它们属于半胱氨酸肽酶，这种酶在乳汁管的发育过程中起着降解蛋白质的作用。同时，Shivaprasad等证实，马利筋乳汁中的半胱氨酸蛋白酶通过抑制纤维蛋白原的特异性裂解来影响凝血过程，从而达到止血的目的，这就解释了为何人们可以使用某些植物的乳汁来对新伤口进行止血的原因，同时也证明了植物可以凭借乳汁管的完善的凝血系统来避免外界病原菌感染。Ramos等利用离子交换色谱和反相高效液相色谱技术从橡胶紫茉莉（Cryptostegia grandiflora）乳汁中纯化出半胱氨酸肽酶，并通过实验证实半胱氨酸肽酶能与其他防御蛋白协同作用保护植物体免受病原体的侵袭。Kitajima等指出桑乳汁管专门积累与生物胁迫相关的防御蛋白，如β-1，3-葡聚糖酶，哈茨木霉几丁质酶V， 渗调蛋白和凝集素等。 Chareonthiphakorn等从橡胶树乳汁中纯化出烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-醌还原酶（NAD（P）H-QR），该酶可以降低对苯二酚的含量，从而维持胶状乳汁的稳定性。NAD（P）H-QR活性的高低可作为预测橡胶产量的一个指标，以便在早期选择优势幼苗来提高橡胶产量。在白屈菜的乳汁中也鉴别出了和NAD（P）H-QR活性类似的1，4-对苯醌还原酶。 橡胶树的乳汁中含有许多能将多种底物合成橡胶的酶类，其中羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶是橡胶合成的关键酶。Skrukrud从续随子（Euphorbia lathyris）的乳汁中分离出了HMG-CoA还原酶和HMG-CoA裂解酶，认为HMG-CoA是将醋酸盐转化为三萜类化合物过程中的限速酶。 乳汁中的果胶酶和纤维素酶常与乳汁管的生长和发育密切相关。Wilson等从马利筋乳汁中纯化出果胶酶，指出该酶有溶解胞间层的作用，可能参与无节分枝乳汁管细胞的侵入生长，并且通过松散细胞壁物质而促进乳汁管细胞延伸生长。几年后，Allen等对夹竹桃（Nerium oleander）乳汁管中的果胶酶进行了细胞化学定位，发现果胶酶定位在乳汁管细胞的中央液泡里，并且在乳汁管细胞和邻近细胞的胞间层中也有少量果胶酶存在，从而证明果胶酶参与无节乳汁管细胞的侵入生长。Sheldrake发现有节乳汁管的乳汁中存在纤维素酶， 但无节乳汁管的乳汁中不存在该种酶，因此认为在有节乳汁管分化过程中纤维素酶起着溶解端壁的作用。 甘遂乳汁管发育早期，其细胞质浓厚，所含细胞器数量多且种类丰富，包括大量的核糖体、高尔基体、内质网、线粒体和质体等。而在乳汁管发育末期，成熟的乳汁管中细胞器已经无法区分，含有一个中央大液泡，其内充满了乳汁颗粒。并且，利用细胞化学和电子显微技术在甘遂的乳汁管中发现酸性磷酸酶，该酶的反应产物在中央大液泡的膜上以及线粒体和质体周围聚集成堆，而且在乳汁管发育晚期形成的小液泡也包含酸性磷酸酶的反应产物。证明乳汁管分化过程中的细胞器的降解与酸性磷酸酶有关。 2 与乳汁管生长发育相关的基因研究 在乳汁管生长发育相关基因的研究方面，主要开展的是割胶及生长调节物质处理对植物乳汁管生长发育相关基因表达的影响。许多研究者利用RACE与RT-PCR等技术对乳汁管发育相关的基因进行了克隆及表达分析。 Zhao等克隆出在乳汁管中含量丰富的HblMYC1和HblMYC2，机械创伤和乙烯利显著上调HblMYC1的表达，但对HblMYC2的表达作用很小;连续的割胶，显著下调HblMYC2的表达，而上调HblMYC1的表达;在用茉莉酸处理后，HblMYC2和HblMYC1的表达呈相互起伏的关系。Chen等克隆出HbEREBP1基因，证明割胶和机械创伤会下调该基因的表达，认为该基因是乳汁管中的负调节防御基因。Li等从巴西橡胶树中分离出3个MADS-box基因，分别称作HbMADS1，HbMADS2和HbMADS3。在乳汁管细胞中，HbMADS1和HbMADS3的转录能被茉莉酸诱导，然而HbMADS2不能被诱导，推测它们可能对天然橡胶的生物合成和植株胚胎形成起重要作用。陈月异等从巴西橡胶树乳汁管中克隆出HbWRKY1基因，实时荧光定量PCR分析表明，割胶和乙烯刺激显著上调HbWRKY1基因的表达，但茉莉酸和机械伤害对HbWRKY1的表达没有明显影响，表明HbWRKY1可能在乙烯信号途径对防卫蛋白的调节中起重要作用。邓治等从橡胶树中克隆出细胞内谷胱甘肽（GSH）生物合成的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γGCS），得出健康橡胶树胶乳中γGCS表达量高于死皮树的结论，并认为γGCS可能通过调控橡胶树体内GSH的含量来影响产胶和死皮。聂智毅等克隆出ABC转运蛋白HbGCN1，基因表达分析显示，HbGCN1主要在橡胶树树皮及胶乳中表达，且在乙烯、茉莉酸或机械损伤诱导下上调表达，推测其可能与橡胶生物合成相关。邱琼等克隆出巴西橡胶树HbNAC1基因，指出该基因在胶乳中的表达量较高，经乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量显著增加。许慧敏对该基因进行半定量RT-PCR表达分析，结果表明HbNAC1基因的表达应茉莉酸刺激而显著上调，暗示HbNAC1基因可能是茉莉酸途径中的关键信号分子，推测HbNAC1基因能诱导乳汁管的分化。 Sandeep等克隆出巴西橡胶树中的SRPP启动子后，利用转基因技术将SRPP启动子转入短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）植株中进行组织化学定位和表达分析，证明SRPP启动子主要诱导产乳汁组织中基因的表达，光照、割胶和低温胁迫都对它的表达产生影响，是橡胶生物合成的关键基因。Qin等在橡胶树乳汁转录组数据库和基因组数据库中检索出5种HbROP（HbROP1-HbROP5）基因，实时定量PCR显示5种HbROP基因在乳汁中高度表达，HbROP3和HbROP5与乳汁的再生和死皮病的发生相关，HbROP5还与细胞分裂素介导的信号途径有关，可能参与乳汁管的分化和发育。 此外，还克隆出来一些与乳汁管生长发育相关的基因，如HbMCS1、HbSPS1、HbSUT5、HbHDT1、HbSKP1等，但这些基因在乳汁管分化及乳汁分泌上发挥的实际作用尚未被证实。 3 生态因子对植物乳汁管生长发育的调控 生态因子是影响乳汁管生长发育的重要因素之一。温度和湿度不同，巴西橡胶树的乳汁管分化和分布情况不同。赵中奇对不同温度、湿度条件下巴西橡胶树乳汁管的列数进行比较分析后指出，温度和湿度的增加均有利于乳汁管的发育，高温而无高湿不利于乳汁管发育。他还指出，同一株橡胶树不同侧面的乳汁管发育也有差异，通常在向阳面乳汁管列数和密度较大，这可能与茎干韧皮部接受的日照强度和热量有关。 纬度和海拔对乳汁管发育也有一定影响。种植在低纬度区与高纬度区的橡胶树，不论是乳汁管列数、密度、口径均随纬度增加而减少，相反，纬度降低则列数、密度、口径增加。因此，高纬度是乳汁管发育的限制因素。在同纬度不同海拔高度种植的橡胶树，乳汁管列数、密度、口径均随着海拔升高而减少。因此，同纬度地区，海拔升高是乳汁管发育的限制因素。 土壤类型和土壤中的营养成份也严重影响乳汁管的分化。生长在优质土壤中的橡胶树每年增加的乳汁管列数明显多于生长在贫瘠土壤中的橡胶树，施用适当的矿质元素，乳汁管形成的速率加快。 某些化学元素缺乏也会对乳汁管的分化产生影响，当K、S、N、Mg等元素缺乏时，乳汁管数目和直径均减小;当Fe、Ca元素缺乏时，乳汁管细胞数目增加而直径减小。 4 割胶对植物乳汁管生长发育的调控 割胶能促进天然橡胶的生物合成，是天然橡胶生产的重要环节之一。郝秉中和吴继林通过实验证实割胶能够促进乳汁管分化，后来他们把割胶的作用分解为机械损伤和排胶两个方面，证明割胶促进乳汁管分化主要是排胶的作用。机械伤害可以诱导这些部位的维管形成层分化出次生乳汁管。排胶促进乳管分化能够解释采胶生产中的若干现象，例如未达到割胶标准的幼树预先割胶能使正式割胶时的产量显著提高。于俊红等的实验显示，割胶树和未开割树的有输导功能的韧皮部的细胞层数没有明显差异，但割胶树有输导功能的韧皮部内乳汁管列数约为未割胶树的2倍。因此，割胶显著提高了维管形成层乳汁管的分化。 目前，割胶促进乳汁管发育的分子机制还在探索中。Hao等和杨署光等均通过实验证明割胶诱导胶乳中内源茉莉酸的生成，从而促进乳汁管的分化。Tian等证明割胶和机械损伤显著上调HbJAZ1基因的表达，而这种基因能够响应乳汁管中的茉莉酸信号。 虽然割胶可以促进乳汁管的发育，但割胶后乳汁管伤口堵塞物的形成又会降低排胶速度和产量，关于伤口堵塞物的主要成分目前尚在争议之中，有人认为是橡胶凝块，还有人认为是蛋白质网 和橡胶粒子聚集物。史敏晶等综述了乳管伤口堵塞物形成的调节因子，包括胶乳的pH值、活性氧、活性氧清除系统和乙烯，是否有其他调节因子调控堵塞物的形成还有待研究。 5 生长调节物质对植物乳汁管生长发育的调控 利用生长调节物质等化学调控技术调节橡胶树的产胶和排胶过程，一直是橡胶生产和理论研究的重要内容。生长调节物质能影响维管形成层的活动，从而影响次生乳汁管组织的发育。目前，常被人用来探索乳汁管发育的生长调节剂有IAA（吲哚-3-乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、GA3（赤霉素）、KT（激动素）、乙烯和茉莉酸等。IAA能促进再生树皮中乳汁管列的增加但不影响韧皮部中乳汁管细胞所占的比例，而GA3和2，4-D则使乳汁管列比例下降47-48。 乙烯能促进许多产乳汁植物分泌组织的分化，尤其是次生乳汁管，人们发现施用乙烯利能提高橡胶产量，其增产原因存在4种解释：（1）乙烯利加速乳汁管细胞的糖酵解，使细胞质碱化，促进胶乳的代谢;（2）乙烯利能够延长排胶时间达到增产目的，但其通过何种机制延长排胶时间尚无确切证据;（3）乙烯利诱导乳汁管产生愈伤反应，使水分与养分向愈伤部位运输， 从而强化了产胶与排胶机能， 形成一个短暂的增产小高峰;（3）乙烯利解除胶乳合成过程中关键酶的基因的阻遏作用，使胞液糖酵解途径激活，加快异戊二烯的合成。橡胶树施用乙烯利后，虽然有利于乳胶再生，但是也表现出一定程度的副作用。乙烯利刺激排胶的同时，也将乳汁管中的大量重要化学物质排出，使乳汁管中的防御系统失衡，黄色体破裂，胶乳凝固，引起树皮的局部衰老和死亡。为此，发现新的生物产品或方法来代替乙烯利实现增产还有待探索。 有报道称茉莉酸及其前体物质亚麻酸不仅能诱导橡胶树幼苗次生乳汁管分化，而且能促进开割和未开割成龄橡胶树乳汁管的分化。刘慧芳等研究了茉莉酸和其他激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用，实验结果显示，一定浓度的茉莉酸和6-BA（6-苄基腺嘌呤）同时施用比单独施用茉莉酸能诱导形成更多的次生乳汁管，而一定浓度的茉莉酸和脱落酸共施与单独施用茉莉酸相比，诱导形成的次生乳汁管数目则减少。目前对茉莉酸调控橡胶树乳汁管分化的分子机制依然不清楚，但已有人在基因水平上证实割胶后乳汁内源茉莉酸含量显著高于未开割树，并且通过筛选茉莉酸刺激乳汁管分化时期的橡胶树树皮组织cDNA差减文库，获得了4条与茉莉酸诱导乳管分化相关的AP2/EREBP家族转录因子基因的EST，随后采用RACE法完整地克隆了这4 个AP2/EREBP基因，推测AP2/EREBP基因可能在茉莉酸诱导橡胶树乳汁管分化过程中起着重要的调控作用。 许多研究者使用不同种类和浓度的生长调节物质来进行植物乳汁管的组织培养实验55-57，从而研究乳汁管的发育。Suri等将白花牛角瓜（Calotropis procera）的种子处理后，在MS培养基中加入不同种类和浓度的激素进行组织细胞悬浮培养，发现乳汁管分化是一个依赖细胞分裂素的过程，KT比6-BA和2-IP（异戊烯酰嘌呤）促进乳汁管分化的效果明显，IAA比6-BA和NAA（萘乙酸）效果明显，而2，4-D则抑制乳汁管的分化。当配合使用KT和IAA后，培养基中乳汁管的分化达到了最大值。Post等用乳汁管特异性的潮霉素抗性质粒对短角蒲公英进行了基因转化，然后悬浮培养转基因细胞组织，诱导乳汁管特异生长，发现用含有甲羟戊酸内酯的培养基培养的愈伤组织中顺式1，4-异戊二烯聚合物（天然橡胶的主要成分）的积累增加了17倍，说明甲羟戊酸内酯对橡胶生物合成具有显著的促进作用。 植物乳汁管的生长发育除了与蛋白质、基因、生态因子、割胶和生长调节物质有关外，还与物种基因型和植株的发育阶段有关。 Tan等通过组织化学和免疫组织化学研究了巴西橡胶树花药愈伤组织培养过程中乳汁管的发生规律，证明愈伤组织中乳汁管细胞的发生频率具有基因依赖性，与体细胞的胚胎发生能力呈负相关性。胚胎发生能力低的基因型能产生较多的乳汁管细胞，而且乳汁管簇仅在这些基因型中发现。李政等比较二倍体与四倍体绿玉树（Euphorbia tirucalli）乳汁管发育差异后指出，相同成熟度四倍体绿玉树初级乳汁管的数量和直径都较二倍体显