溶血性贫血图文课件

第五节 溶血性贫血中的应用,2014年12月,红细胞膜的概述,2019/4/28,第 2 页,细胞膜的化学结构,外周蛋白,膜骨架,主体蛋白,2019/4/28,第 3 页,有关细胞膜结构的几个,红细胞膜骨架结构：膜下0.2um胶溶层，包括主体蛋白和外周蛋白 主体蛋白：镶嵌于脂质双层中，多属糖蛋白 外周蛋白：与脂质双层疏松结合，易被水解 血影（ghost）：RBC裂解释放Hb后留下一个保留原形的空壳结构,概念,2019/4/28,第 4 页,人红细胞膜的主要蛋白,2019/4/28,第 5 页,红细胞膜结构示意图,2019/4/28,第 6 页,红细胞膜结构,2019/4/28,第 7 页,红细胞膜结构示意图(主体蛋白，和外周蛋白）,收缩蛋白,锚蛋白,肌动蛋白,2019/4/28,第 8 页,膜骨架功能,维持红细胞的正常形态及变形性,2019/4/28,第 9 页,膜结构最基本的特征,细胞膜的不对称性 细胞膜内外两层的组分和功能有明显的差异，称为膜的不对称性 细胞膜的流动性,2019/4/28,第 10 页,细胞膜的不对称性,膜脂的不对称性：两侧磷脂的比例不同 膜蛋白的不对称性（功能上的方向性不对称）：蛋白激酶C 复合糖的不对称性：受体,细胞膜的不对称性是生物膜完成复杂的在 时间与空间上有序的各种生理功能的保证,2019/4/28,第 11 页,膜脂质不对称性,外小页：PC（胆碱磷脂）、PM（鞘磷脂） 内小页：PE（乙醇胺磷脂）、PS（丝氨酸磷脂） 与细胞老化、调亡、细胞识别和吞饮有关,2019/4/28,第 12 页,膜蛋白不对称性,特性：具有明显方向性和区域性 蛋白激酶C 磷脂酰丝氨酸（内小页）,2019/4/28,第 13 页,复合糖不对称性,特性：糖蛋白、糖脂仅分布于细胞外侧 意义：细胞表面受体、与细胞抗原性有关,2019/4/28,第 14 页,细胞膜的不对称性示意图,2019/4/28,第 15 页,膜流动性,主要指脂质和蛋白质的运动 脂质 液态 晶态 蛋白质 侧向运动、旋转运动 生理意义：保证细胞生理功能必要条件,2019/4/28,第 16 页,细胞膜的生物学功能,为红细胞生命活动提供相对稳定的环境 选择性的物质运输，其中伴随能量的传递 提供细胞识别位点，完成信息传递 提供多种酶结合位点，使酶促反应高效进行 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接 参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构,2019/4/28,第 17 页,膜功能一、稳定内环境,一、屏障作用 二、赋予高度变性能力,2019/4/28,第 18 页,膜功能二、物质跨膜运输,简单扩散 协助扩散 主动运输（由ATP直接提供能量，如：钠钾泵和质子泵；间接由ATP提供能量，如：协同运输） 基团转移 内吞和外排,2019/4/28,第 19 页,膜功能三、细胞识别及信息传递,细胞识别：与寡糖链密切相关 1、血型抗原 2、补体受体（CRI）,2019/4/28,第 20 页,影响红细胞膜稳定因素,化学因素,影响膜稳定和因素,免疫因素,红细胞膜蛋白的遗传性缺陷,酶代谢异常,ATP生成不足,生物因素,2019/4/28,第 21 页,溶血性贫血的分类和诊断,编辑制作杨晓斌,2019/4/28,第 22 页,1、定 义,2019/4/28,第 23 页,溶血性贫血的证据,红细胞破坏过度的表现 红细胞代偿性增生的表现 骨髓增生明显活跃，粒红比例缩小或倒置,2019/4/28,第 24 页,溶血性贫血的血象,2019/4/28,第 25 页,网织红细胞增多,2019/4/28,第 26 页,溶血性贫血的骨髓象,2019/4/28,第 27 页,2.1、溶血性贫血的类型,2019/4/28,第 28 页,2.2、溶血性贫血的发病机制,红细胞过早地被破坏可以发生在血管外或血管内。 血管外溶血即红细胞被脾、肝的单核-巨 噬细胞系统吞噬后破坏。 血管内溶血是红细胞直接在血循环中破裂， 红细胞的内容物血红蛋白直接被释放入血浆。,2019/4/28,第 29 页,2.2、溶血性贫血的发病机制,红细胞,在单核-巨噬细胞中破环,在血管内破环,血管外溶血,血管内溶血,2019/4/28,第 30 页,2.3、溶血性贫血的诊断方法,2019/4/28,第 31 页,血管内溶血和血管外溶血的鉴别,2019/4/28,第 32 页,急性溶血不常有的症状是： A：寒战、高热、腰痛 B：血红蛋白尿 C：休克 D：脾大 E：肾衰竭,2019/4/28,第 33 页,女性，26岁，产后10天感头晕，乏力、尿黄。查体：贫血貌，巩膜黄染，脾肋下1指。Hb=60，白细胞血小板正常。网织红细胞=15%。尿胆原+，尿潜血阴性。血清总胆红素=37，间接胆红素=29，肝功能正常。骨髓：红系增生明显活跃，中+晚幼细胞=59%。该患者为： A、原位溶血 B、血管内溶血 C、混合性溶血 D、血管外溶血 E、微血管病性溶血,2019/4/28,第 34 页,不同类型溶血性贫血试验选择,2.4、溶血性贫血的过筛试验,以鉴别溶血的部位,是血管内溶血还是血管外溶血？,2019/4/28,第 36 页,（一）血浆游离血红蛋白测定,常用邻-甲苯胺法检测，血红蛋白结构中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用，催化过氧化氢释放新生态氧，使无色的邻-联甲苯胺氧化为蓝色。根据显色深浅，即可测出血浆游离血红蛋白的量。,【参考区间】 040mg/L,2019/4/28,第 37 页,【应用评价】正常情况，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。测定血浆游离血红蛋白可判断红细胞的破坏程度。,（一）血浆游离血红蛋白测定,2019/4/28,第 38 页,（二）血清结合珠蛋白测定,结合珠蛋白（Hp）是由肝脏合成的一种2糖蛋白，合成速度较慢； Hp具有结合游离血红蛋白的能力，在血红蛋白降解为胆红素的代谢过程中具有重要的作用，在此过程中Hp本身也被分解，溶血性贫血时Hp因消耗而降低。,用醋酸纤维薄膜电泳法检测，由于Hp具有结合游离血红蛋白的能力，故在测定血清Hp时，于待测血清中加入一定量的血红蛋白液，使之与待测血清中的Hp形成Hp-Hb复合物；再通过电泳法将结合的Hp-Hb复合物与未结合的Hb分开，测定Hp-Hb复合物的量，可测得血清中Hp的含量。,【参考区间】 0.51.5gHb/L,2019/4/28,第 39 页,【应用评价】正常情况下，血浆中的血红蛋白与结合珠蛋白结合形成复合物，在单核-巨噬细胞系统和肝内清除。溶血时血浆中的血红蛋白与Hp结合增多，使血清中结合珠蛋白减少，测定血清中结合珠蛋白的含量可反映溶血的情况。,（二）血清结合珠蛋白测定,2019/4/28,第 40 页,（三）尿含铁血黄素试验,当游离血红蛋白在血液中增多时，血红蛋白通过肾脏滤过形成血红蛋白尿；在此过程中，血红蛋白被肾小管上皮细胞部分或全部吸收，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。,【参考区间】 正常人为阴性,含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，为含铁质的棕色色素，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀，此反应称为普鲁士蓝反应。用显微镜检查尿沉渣，细胞内外可见直径13的蓝色颗粒。,2019/4/28,第 41 页,【应用评价】尿含铁血黄素试验阳性提示 慢性血管内溶血。 无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内 溶血如PNH，本试验即呈阳性，并可持续数周。 但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，上皮细胞 内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时本试验 可呈阴性反应。,（三）尿含铁血黄素试验,2019/4/28,第 42 页,【参考区间】正常人呈阴性,（四）高铁血红素白蛋白试验,2019/4/28,第 43 页,【应用评价】血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。只有在严重溶血时，Hp与Hx均被耗尽，高铁血红素方与白蛋白结合成高铁血红素白蛋白；故血清中出现高铁血红素白蛋白是溶血严重的指标。,（四）高铁血红素白蛋白试验,2019/4/28,第 44 页,第二节 红细胞膜缺陷检查及其应用,复习一下试验,2019/4/28,第 45 页,一、红细胞膜缺陷的实验室检查,常见实验室检查,2019/4/28,第 46 页,（一）红细胞渗透脆性试验,红细胞在不同浓度的低渗盐溶液中，水分通过红细胞膜进入细胞内，当水渗透达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。根据不同浓度的低渗盐溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞对低渗盐溶液的抵抗能力。,低渗盐,低渗盐,红细胞对低渗的抵抗能力与其表面积与容积的比值有关，比值小，说明红细胞容积已胀大，对低渗抵抗力小，渗透脆性增加；反之抵抗力增大，渗透脆性降低。,2019/4/28,第 47 页,【参考区间】 简易半定量法： 开始溶血：3.84.6g/L 完全溶血：2.83.2g/L,（一）红细胞渗透脆性试验,2019/4/28,第 48 页,（三）红细胞自身溶血试验 及其纠正试验,在孵育时，加入葡萄糖和ATP作为纠正物，观 察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。,【参考区间】 正常人红细胞孵育48小时，不加纠正物的 溶血率4.0%，加葡萄糖的溶血率1.0%， 加ATP纠正物的溶血率0.8%。,2019/4/28,第 49 页,（三）红细胞自身溶血试验 及其纠正试验,2019/4/28,第 50 页,（四）酸化甘油溶血试验,遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜脂质减少，表面积/体积的比值降低、细胞球形化，膜蛋白及膜脂质有缺陷,当甘油存在于低渗溶液时，可阻止低渗溶液中的水快速进入红细胞内，减慢溶血过程。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜 脂质逐步溶解而减少。,它们在pH6.85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至50%的时间（AGLT50）明显缩短。,【参考区间】 正常人AGLT50290s 【应用评价】遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩 短（1525s）。自身免疫性溶血性贫血、 肾功能衰竭、妊娠等AGLT50也可缩短。,2019/4/28,第 51 页,（五）酸化血清溶血试验,正常人的血清，在pH6.46.6条件下 酸化，补体被激活,PNH患者体内存在对补体敏感的红细胞，在此条件下发生溶血。而正常人的红细胞不被溶解。将血清加热5630min灭活补体后，血清失去溶血作用。,本实验是PNH的确证实验；其假阳性和假阴性较少见， 但如患者多次输血而使其补体敏感红细胞相对减少时，可 呈弱阳性或阴性。某些自身免疫性溶血性贫血患者溶血发 作严重时也偶呈阳性，此时，如果血清加热破坏补体后， 试验结果由阳性转变为阴性，那么更支持PNH的诊断。,2019/4/28,第 52 页,酸化血清溶血试验,2019/4/28,第 53 页,（六）蔗糖溶血试验,PNH患者因红细胞膜有缺陷而对补体敏感,在低离子强度的蔗糖溶液中，补体与细胞膜的结合加强,使对补体敏感的红细胞膜造成缺损，红细胞溶解破损,【参考区间】 正常人为阴性 【应用评价】本试验比酸溶血试验敏感，但特异性 较差，是PNH简易过筛试验。再生障碍 性贫血、巨幼红细胞性贫血和自身免疫 性溶血性贫血患者也可出现阳性，故必 要时需做酸化血清溶血试验加以鉴别。,2019/4/28,第 54 页,（七）血细胞表型分析,2019/4/28,第 55 页,（八）红细胞膜蛋白电泳分析,将制备的红细胞膜样品进行SDS-PAGE电泳，根据样品中各种蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。,红细胞各种膜蛋白组分百分率变化较大，与正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较。或以带3蛋白为基准，各膜蛋白含量与带3蛋白的比例表示。,许多先天性和后天性溶血性贫血都伴有红细胞膜蛋白异常，各种膜缺陷疾病如遗传球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。,2019/4/28,第 56 页,三、红细胞膜缺陷检查的应用,2019/4/28,第 57 页,红细胞渗透脆性试验可作为遗传性溶血性贫血病因诊断的筛选试验,2019/4/28,第 58 页,（一）遗传性球形红细胞增多症,遗传性球形红细胞增多症,是一种红细胞膜蛋白结构异常所致的遗传性溶血 病，其特点是外周血中出现较多小球形红细胞。 多呈常染色体显性遗传，少数呈常染色体隐性遗 传的HS常合并新的基因突变而发病，研究显示 HS有第8号染色体短臂缺失。 贫血、黄疸和脾肿大，是最常见的临床表现 可诱发再障危象,红细胞膜收缩蛋白自身聚合位点及其结构的区域异常,膜结构与功能的异常,钠泵功能亢进，钠、水进入细胞增多,红细胞呈球形,红细胞内的ATP相对缺乏,钙-ATP酶受抑制，钙沉积膜上，膜的柔韧性降低,该红细胞通过脾脏被截留，于巨噬细胞内破坏,破坏不能被机体代偿时出现溶血性贫血,2019/4/28,第 59 页,实验室检查,遗传性球形红细胞增多症,1血象 血红蛋白和红细胞量多为正常或轻度降低，血片中出现 小球形红细胞为本病的血液形态学特征；网织红细胞增 加，一般为5%10%，急性溶血发作时可高60%70%。 嗜多色性红细胞增多，外周血中可出现少数幼稚红细胞。 2骨髓象 红细胞增生旺盛，粒红比值降低，红细胞系以中、晚 幼红细胞为主，可占有核细胞的25%60%；当发生再 障危象时，骨髓中红细胞系再生低下，有核红细胞减少。 3渗透脆性试验 HS红细胞渗透脆性增高 4红细胞膜电泳分析 SDS-PAGE电泳可得到红细胞膜蛋白各组 分的百分率，80%的患者可发现异常。 5红细胞膜蛋白定量测定 绝大多数HS有一种或多种膜蛋白缺乏 6分子生物学技术应用,球形红细胞较正常红细胞小、厚，且深染，大小比较均一，直径变小（6.27.0m），厚度增加（2.23.4m），染色后细胞中央淡染区消失，小球形红细胞所占的比例在不同的患者中差别较大，多数患者在10%以上（正常人多5%）。,2019/4/28,第 60 页,遗传性球形红细胞增多症,2019/4/28,第 61 页,诊断和鉴别诊断,HS无特异的临床表现和实验室检查，诊断时 应结合病史、临床表现和实验室检查综合分析。 血涂片中小球形细胞大于10%， 红细胞渗脆性增加， 有阳性的家族史，本病的诊断可成立。 注意与自身免疫性溶血性贫血所致继发性球形 红细胞增多症相鉴别，后者Coombs（+）。 对Coombs试验多次阴性者，应作红细胞膜蛋白分析 和组分定量，必要时采用基因序列分析的方法，寻找 诊断依据和进行家系调查以鉴别诊断。,2019/4/28,第 62 页,关于遗传性球形红细胞增多症，下列哪一项是不正确的： A：红细胞膜先天缺陷性疾病 B：主要涉及红细胞骨架蛋白异常 C：本病异常球形红细胞的渗透脆性降低 D：异常红细胞主要在脾脏破坏 E：胆石症是本病的常见并发症,2019/4/28,第 63 页,不能做为遗传性球形红细胞增多症的诊断依据是“ A：骨髓幼红细胞增生 B：贫血、黄疸、肝脾大 C：红细胞膜蛋白电泳发现红细胞膜缺陷 D：网织红细胞计数降低 E：红细胞渗透脆性试验阳性,2019/4/28,第 64 页,（二）遗传性椭圆形红细胞增多症,是一组由于红细胞膜蛋白异常引起的异质性家族遗传性溶血病，其共同特点是外周血中存在大量的椭圆形成熟红细胞。HE大多为常染色体显性遗传，极少数为常染色体隐性遗传。,定义,本病的原发病变是膜骨架蛋白异常，其膜收缩蛋白结构有缺陷，膜骨架稳定性降低。HE的红细胞在骨髓释放入血液循环后由于膜骨架蛋白的缺陷，在通过微循环时由于切变力的作用变成椭圆形后不能恢复正常，同时，红细胞由于膜骨架稳定性的降低容易破坏，大多数椭圆形红细胞在脾脏被破坏。,2019/4/28,第 65 页,诊断和鉴别诊断,遗传性椭圆形红细胞增多症,1血象 有轻重不等的贫血，隐匿型可表现正常。血片中椭圆形 红细胞的比例大于25%。其形状呈椭圆形、卵圆形、棒状或 腊肠形，椭圆形红细胞横径与纵径之比小于0.78，硬度增 加，中心淡染区消失。 2骨髓象 骨髓红细胞系统增生活跃为增生性贫血骨髓象。 3红细胞渗透脆性试验 红细胞渗透脆性试验和 自身溶血试验多增高。 4红细胞膜蛋白电泳分析及低离子强度非变性凝胶电泳膜 收缩蛋白分析 其异常结果有助于膜分子病变的确定。 5分子生物学方法 检测某些膜蛋白基因突变。,依据临床表现、家族调查和相关实验室检查多数病例可确诊， 无阳性家族史时若椭圆形红细胞大于50%也可明确诊断。本病 应与缺铁性贫血、巨幼细胞贫血、骨髓纤维化、骨髓病性贫血、 骨髓增生异常综合征、珠蛋白生成障碍性贫血等鉴别。,2019/4/28,第 66 页,遗传性椭圆形红细胞增多症,2019/4/28,第 67 页,（三）遗传性口形红细胞增多症,是一种罕见的常染色体显性遗传性慢性溶血性贫血。本病的特征是血片中出现较多的口形红细胞，有轻重不一的溶血阳性家族史。HST不是单一的疾病，而是发病机制、红细胞形态和临床表现都不同的一组综合征。,定义,在口形细胞中，钠离子浓度增高，钾离子浓度减低，从而使离子泵的负荷增至610倍，但仍不足以代偿钠钾的失衡状态，导致细胞水肿、肿胀，体积增大，红细胞脆性增高。,根据口形红细胞内钠、钾离子和阳离子总量的多少,水肿细胞型又称水肿细胞增多症，其细胞内钠、钾离子和阳离子总量明显增多，致水分进入细胞内，使红细胞肿胀表现为口形；此型细胞渗透脆性增加，变形能力减弱，在脾扣留被巨噬细胞吞噬破坏。,干细胞型又称干细胞增多症或脱水型细胞增多症，由于细胞脱水致红细胞边缘皱褶或不规则，有时可呈靶形；此种细胞变形能力降低，红细胞渗透脆性降低，主要在单核-巨噬细胞系统内破坏。,其他细胞型,2019/4/28,第 68 页,诊断和鉴别诊断,遗传性口形红细胞增多症,血片中口形红细胞增多，可达10%50%。口形红细胞中心苍白区呈狭窄的裂缝，裂缝的中央较两端更为狭窄，缝的边缘清楚，类似微张的鱼口；而在湿血片中，红细胞双凹面消失而呈单面凹，形似碗状。正常人外周血中也可见到少量口形细胞，一般为小于4%。 贫血一般轻微，血红蛋白很少低于80g/L，多数患者网织红 细胞增多，约1020；红细胞渗透脆性试验增高，也可正常或降低；自身溶血可呈阳性，可被葡萄糖或ATP部分纠正。,依据临床表现、外周血口形红细胞增多和家族史一般可作出诊断。但需要与继发性口形红细胞增多症相鉴别，继发性口形红细胞增多症除口形红细胞增多外，一般无溶血，缺乏家族史，并具有相应疾病的特征。,2019/4/28,第 69 页,遗传性口形红细胞增多症,2019/4/28,第 70 页,（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症,2019/4/28,第 71 页,实验室检查,阵发性睡眠性血红蛋白尿症,1血象 贫血，呈正色素性或低色素性贫血，网织红细胞 常增高，可见有核红细胞及红细胞碎片。白细胞 和血小板多减少，半数患者呈全血细胞减少。 2骨髓象 半数以上的患者三系增生活跃，尤以红系造血 旺盛。随病情变化表现不一，不同穿刺部位增 生程度可明显差异。 3特殊溶血试验 （1）溶血存在的依据：尿隐血试验或尿含铁血黄素试验阳性。 （2）补体敏感的红细胞存在的依据：蔗糖溶血试验、 热溶血试验、酸化血清溶血试验。 4流式细胞术检测发现GPI锚连接蛋白（CD55或CD59） 低表达的异常细胞群，支持PNH诊断。本试验是目前 诊断PNH特异性和敏感性最高且可定量的检测方法。,2019/4/28,第 72 页,诊断和鉴别诊断,阵发性睡眠性血红蛋白尿症,1诊断标准 临床表现符合PNH或上述必须考虑为PNH的表现情况； 有肯定的血红蛋白尿发作或血管内溶血的直接、间接证据； 实验室检查证明有补体敏感的红细胞群存在和检测CD55及CD59 这两种常见的血细胞表面锚蛋白相关抗原的表达情况是确诊试验。 2鉴别诊断 排除其他溶血病，全血细胞减少还应与再障鉴别。 3再障-PNH综合症的诊断 凡再障转化为PNH，或PNH转化为再障， 或兼有两病特征者，均属再障PNH综合征。,再障-PNH综合症再分为四种情况： （1）再障-PNH：指原有肯定的再障（而非未能诊断的PNH早期表 现），转为可确定的PNH，再障的表现已不明显。 （2）PNH-再障： 指原有肯定的PNH（而非下述的第4类）， 转为明确的再障，PNH的表现已不明显。 （3）PNH伴有再障特征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以 PNH为主，但伴有一个或一个以上部位骨髓增生低下、 巨核细胞减少、网织红细胞不增高等再障表现者。 （4）再障伴有PNH特征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以再 障为主，但伴有PNH的实验诊断结果阳性者。,2019/4/28,第 73 页,PNH与再障的鉴别,2019/4/28,第 74 页,女性，42岁。乏力、面色苍白、尿色黄1年。重度贫血貌，巩膜轻度黄染。肝脾肋下未触及。血清总胆红素=27，间接胆红素=19，肝功能酶正常。尿隐血（+）。血红蛋白=55，白细胞=3.5，MCV=70，血小板=72。骨髓象：中幼+晚幼红细胞=66%。网织红细胞9%。问： A：该患者为血管内溶血还是血管外溶血 B：可以作哪些进一步的检查？,见Page 61,2019/4/28,第 75 页,下列哪项分化抗原缺乏将引起PNH A：CD13，CD33 B：CD5，CD3 C：CD134，CD22 D：CD55，CD59 E：CD53，CD59,2019/4/28,第 76 页,男，52岁，半年来逐渐贫血，不发热，无出血症状，尿呈浓茶色，多为凌晨出现，巩膜轻度黄染，肝脾不肿大，HGB78g/L，WBC=4.6，PLT=90，Ret=5%，为确诊首选的检查是： A：尿含铁血黄素试验 B：酸化血清溶血试验 C：抗人球蛋白试验 D：骨髓穿刺 E：血清铁测定,2019/4/28,第 77 页,最常见的为葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症、丙酮酸激酶缺陷症。,第三节 红细胞酶缺陷检查,定义,红细胞酶缺陷是指参与红细胞代谢（主要是糖代谢）的酶由于基因突变导致的酶活性或性质改变所引起的溶血及（或）其他表现的疾病。,2019/4/28,第 78 页,相关试验,高铁血红蛋白还原试验 变性珠蛋白小体生成试验（Heinz body test) 酶活性测定（三种）,2019/4/28,第 79 页,一、红细胞的糖代谢,2019/4/28,第 80 页,二、实验室检查,（一） 高铁血红蛋白还原试验,1. 加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血 红蛋白，正常红细胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP成 NADPH，其脱下的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血 红蛋白（Fe3+）还原成亚铁血红蛋白（Fe2+），比色测定。 2.当G-6-PD缺乏症时，由于NADPH生成减少或缺乏， 高铁血红蛋白不被还原或还原速度减慢，高铁血红 蛋白还原率下降。 3. 正常人高铁血红蛋白还原率75%（脐带血77%）。 4. G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏 （杂合子） 为31%74%，严重缺乏（半合子或纯合子）30%。,2019/4/28,第 81 页,（二） 变性珠蛋白小体生成试验,G-6-PD缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于37孵育24小时，使血红蛋白变性，用煌焦油蓝等碱性染料染色观察红细胞珠蛋白小体的生成情况，计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。 正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般30%。,二、实验室检查,2019/4/28,第 82 页,变性珠蛋白小体,2019/4/28,第 83 页,应用评价,1G-6-PD缺乏症常高于45%，可作G-6-PD缺乏的筛检试验。 但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体 的细胞百分率为75%84%，HbH病和化学物质中毒时也增高。 2变性珠蛋白小体，主要是、珠蛋白链的病变而引起的 溶解度和稳定性降低所致；是一种变性血红蛋白颗粒，一 般附着在细胞膜上，故又称血红蛋白包涵体，变性珠蛋白 小体可被碱性染料着色。该实验与异丙醇试验和热不稳定 实验一样可作为不稳定血红蛋白存在的一种证据。 3G-6-PD活性正常时，红细胞通过磷酸戊糖旁路形成NADPH 使MHb还原成亚铁血红蛋白，因而含变性珠蛋白小体的红细 胞减少，而G-6-PD活性减低时，NADPH减少，MHb增多， 导致含变性珠蛋白小体的红细胞增多，不稳定血红蛋白由于 血红蛋白分子结构发生改变，稳定性减低易被氧化，含变性 珠蛋白小体的红细胞可增多，伯氨喹啉型溶血性贫血，含变 性珠蛋白小体的红细胞也可增多。,（二） 变性珠蛋白小体生成试验,2019/4/28,第 84 页,在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。,（三） G-6-PD荧光斑点试验和活性测定,G-6-PD缺陷见于蚕豆病、伯氨喹啉型药物性溶血性贫血。利用此实验可对高发区域人群或疑诊的新生儿进行筛查。,正常人有很强荧光。正常人酶活性为： （8.341.59）U/gHb（37） （ICSH推荐的Glock与McLean法） （12.12.09）U/gHb（37）（WHO推荐的Zinkham法） G-6-PD缺陷者的荧光很弱或无荧光；杂合子或某些 G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光。,二、实验室检查,2019/4/28,第 85 页,女，22岁，头昏乏力面色苍白4年，巩膜轻度黄染，脾肋下3cm，Hb=56，PLT=32，骨髓增生低下，但红系增生以中晚幼红为主，尿Rous试验阳性，Ham试验阳性，首先考虑： A、IDA B、AA C、MgA D、AIHA E、PNH,2019/4/28,第 86 页,（四） 丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定,在ADP存在的条件下催化PEP转化成丙酮酸，在NADH的作用下，丙酮酸被LDH转化为乳酸，荧光标记NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD，检测以上过程荧光消失的时间反应PK的活性。,荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光2560分钟消失，严重缺乏（纯合子）时， 荧光60分钟不消失。,正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失。 酶活性（15.01.99）U/gHb。,二、实验室检查,2019/4/28,第 87 页,红细胞G-6-PD基因突变致活性降低和/或酶性质改变，是一种X性连锁隐性或不完全显性遗传性疾病。 G-6-PD缺乏时，红细胞膜脂质和膜蛋白巯基的氧化，引起红细胞僵硬，易被脾脏和肝脏中的巨噬细胞破坏导致溶血。,三、红细胞酶缺陷检查的应用,（一）红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症,2019/4/28,第 88 页,实验室检查,1溶血的检查 非遗传性有诱因，急性溶血，血 管内溶血；而遗传性非球形细胞溶血性 贫血具有慢性血管外溶血的实验室特征 2G-6-PD缺乏的筛检试验 高铁血红蛋白还原试 验、荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝纸片 法。荧光斑点试验的特异性最高，高铁 血红蛋白还原试验的敏感性最强。 3G-6-PD确诊试验 G-6-PD活性定量检测能准 确反映酶的活性。,2019/4/28,第 89 页,诊断依据是红细胞G-6-PD活性的实验室检查， 临床表现及阳性家族史。 如筛选试验中两项中度异常；或一项筛选试验中 度异常加上Heinz小体生成试验阳性（有40% 红细胞含Heinz小体，每个红细胞有5个以上 Heinz小体）并排除其他溶血病因；或一项筛 选试验中度异常，伴有明确的家族史；或一项 筛检试验严重异常；或定量测定G-6-PD活性 较正常平均值降低40%以上，均可确诊。,诊断和鉴别诊断,2019/4/28,第 90 页,（二）丙酮酸激酶缺陷症,1.PK基因缺陷，常染色体隐性遗传，仅次于G-6-PD缺陷症 2.PK缺陷时，ATP产生减少，引起血管外溶血，表现为 慢性溶血性贫血。,检验 1筛检试验 红细胞自溶血试验、 PK荧光斑点试验 2酶活性定量试验 PK活性检测 3ATP测定 4中间代谢产物测定 2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG） 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP） 2-磷酸甘油酸（2-PG）,诊断和鉴别诊断 1红细胞PK缺乏的实验室诊断标准 2遗传性红细胞丙酮酸激酶缺乏症主要通过 红细胞PK活性的测定进行诊断。,三、红细胞酶缺陷检查的应用,2019/4/28,第 91 页,第四节 血红蛋白病检查,成熟红细胞内的主要蛋白质是血红蛋白（Hb），占细胞干重的96%，占细胞容积的35%。正常血红蛋白由两对珠蛋白肽链和4个亚铁血红素构成的4个亚基组成的四聚体，形状近似球形的结合蛋白。血红蛋白的合成受铁的供应、原卟啉和珠蛋白合成的影响。,2019/4/28,第 92 页,（一）血红蛋白的结构,正常血红蛋白由两对珠蛋白肽链和4个亚铁血红素构成的4个亚基组成的四聚体，形状近似球形的结合蛋白。血红蛋白的合成受铁的供应、原卟啉和珠蛋白合成的影响。 血红蛋白由四条非共价结合的球蛋白链组成，每条链结合一血红素基团，亦即血红蛋白分子的氧结合位点。,2019/4/28,第 93 页,血红素是铁原子和原卟啉的复合物，是含铁卟啉衍生物，铁原子位于原卟啉的卟啉环中心。血红素是血红蛋白的组成成分，是Hb、Mb、多种酶和多种细胞色素的辅基，其合成于有核红细胞和肝细胞的线粒体内。血红素合成后，离开线粒体，在胞质内与珠蛋白肽链结合为血红蛋白；血红素由脾脏、骨髓、肝脏中的巨噬细胞吞噬降解。在血红素合成过程中酶的缺陷引起卟啉或其前体在体内蓄积可导致卟啉病。,珠蛋白按四级结构与血红素形成血红蛋白，血红蛋白的每个亚基由一条珠蛋白肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下成球形，把血红素分子包在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。,（一）血红蛋白的结构,2019/4/28,第 94 页,（二）影响血红蛋白结构和功能的因素,2019/4/28,第 95 页,二、实验室检查,2019/4/28,第 96 页,（一） 血红蛋白电泳,根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动；反之，Hb带正电荷向阴极泳动，不同的血红蛋白所带电荷和相对分子量不同，可分离出各自的区带。,1通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现 异常血红蛋白区带。如HbH、HbE、Hb Barts、HbS、 HbD和HbC等异常血红蛋白。 2HbA2增多，见于珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要 实验室诊断指标。HbE病时也在HbA2区带位置处增加，但含 量很大。HbA2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。,1pH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 ，适合于检出HbA、 HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与 Hb Barts不能分开和显示。 2pH6.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 主要用于HbH和 Hb Barts的检出。,二、实验室检查,2019/4/28,第 97 页,（二） 抗碱血红蛋白检测,胎儿血红蛋白（HbF）具有比HbA更强的抗碱作用，将待检的溶血液与一定量的NaOH溶液混合，作用1分钟 后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。HbF抗碱变性作 用强，没有变性存在于上清中，而HbA变性沉淀，取上 清液于540nm处测定吸光度，检测出HbF的浓度。,【应用评价】 1HbF绝对增多 珠蛋白生成性贫血时HbF增加，重型者 达30%90%，中间型常为5%30%，轻型小于5%。遗传 性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100% 。 2HbF相对增多 某些血液疾病 3HbF生理性增多 多见于孕妇及新生儿。,【参考区间】 成人2%，新生儿40%,二、实验室检查,2019/4/28,第 98 页,（三） 血红蛋白F酸洗脱试验,HbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比HbA强。 将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含HbF的红细胞 不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红 细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。,【应用评价】 珠蛋白生成障碍性贫血着色细胞增加，重型患者大多数 红细胞染成红色，轻型患者可见少数染成红色的细胞。 遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。,【参考区间】 正常血片含HbF的着色红细胞 0.02（2%）；孕妇可有轻度增加。,二、实验室检查,2019/4/28,第 99 页,（四） 异丙醇沉淀试验,在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键 的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白更快地裂 解沉淀。通过观察血红蛋白液在异丙醇中的 沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检。,【应用评价】 不稳定血红蛋白存在时，常于5分钟时出现沉淀， 20分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多 HbF、HbH、HbE时也可出现阳性结果。,【参考区间】 正常人血红蛋白液为阴性 （30分钟内不沉淀）,二、实验室检查,2019/4/28,第 100 页,（五） 热变性试验,是根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容 易遇热变性，观察血红蛋白液在50时是否 出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。,【应用评价】 血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白的存在。,【参考区间】正常人热沉淀的血红蛋白1%,二、实验室检查,2019/4/28,第 101 页,（六） 红细胞包涵体试验,将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成 包涵体。观察温育2h含包涵体的红细胞是否比温浴10min的阳性细胞 多，可了解是否有HbH等不稳定血红蛋白的存在。,【参考区间】 正常人0.01（1%）,温育10min 10min2h 3h或更长,网织红细胞显现出来,HbH病红细胞包涵体形成,其它不稳定血红蛋白形成珠蛋白变性沉淀,【应用评价】 1不稳定血红蛋白病 孵育13小时多数红细胞内可出现 变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。G-6-PD缺乏或细胞 还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。 2HbH病 孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体。,二、实验室检查,2019/4/28,第 102 页,三、血红蛋白病检查的应用,血红蛋白病: 由遗传性或基因突变所致的珠蛋白肽链结构异常或合 成肽链速率的改变，而引起血红蛋白功能异常所致的疾病,2019/4/28,第 103 页,地贫家系,父母均为-地贫基因携带者。 姐15岁，妹11岁，均为重型-地中海贫血者,2019/4/28,第 104 页,检 验,血象 贫血轻重不等，红细胞大小不均, 异形、靶形红细胞增多常大于10% 珠蛋白生成障碍性贫血 HbF和HbA2 增加； 珠蛋白生成障碍性贫血 有HbH或HbBarts增加。,2019/4/28,第 105 页,2019/4/28,第 106 页,（一）珠蛋白生成障碍性贫血,2019/4/28,第 107 页,1珠蛋白生成障碍性贫血,是珠蛋白生成障碍性贫血中发病率最高的一种类型。 第11号染色体上控制珠蛋白链合成的基因突变，珠 蛋白链合成受到抑制，杂合子的链的合成速度比链快 2.02.5倍，纯合子的链合成的速度超过链更多， 甚至可完全没有链合成。,多余的链将导致： （1）链聚合成不稳定的四聚体（4）增加，HbA2和HbF含量增加。 （2）很不稳定，容易发生沉淀，形成靶形红细胞； （3）链包含体附着于红细胞膜，使红细胞僵硬，导致无效造血。 （4）红细胞对钾离子的通透性增加，能量代谢能力降低，生存期缩短。,（一）珠蛋白生成障碍性贫血,2019/4/28,第 108 页,（一）珠蛋白生成障碍性贫血,2019/4/28,第 109 页,2珠蛋白生成障碍性贫血,由于珠蛋白基因的缺乏或缺陷使珠蛋白链合成 速度明显降低或几乎不能合成引起的。 由第16对染色体上两对联锁的珠蛋白基因（父母 双方各继承两个）所控制。,（一）珠蛋白生成障碍性贫血,2019/4/28,第 110 页,（一）珠蛋白生成障碍性贫血,2019/4/28,第 111 页,各型珠蛋白生成障碍性贫血的血红蛋白电泳结果,（一）珠蛋白生成障碍性贫血,2019/4/28,第 112 页,海洋性贫血说法，错误的是： A：a地中海贫血是由于a珠蛋白基因缺失或缺陷所致 B：B海洋性贫血是常染色体隐性遗传 C：血红蛋白Bart胎儿水肿综合症是a海洋性贫血最严重的类型 D：本病尚无根治办法 E： B海洋性贫血最多见于地中海区域,2019/4/28,第 113 页,（二）异常血红蛋白病,镰状细胞贫血（HbS病）,出现异常血红蛋白S的常染色体显性遗传疾病。因 HbA的链形成HbS（Hb226谷缬），当血氧过低时 HbS互相聚集，形成纤维状多聚体。当有足够的多聚体 形成时，红细胞即由双面凹盘状变成镰刀形，此过程称 “镰变”。,【实验室检查】血红蛋白降低，红细胞大小不均，出现异形 细胞、多染性红细胞、有核红细胞、靶形红细胞等，镰状 红细胞不多见。网织红细胞常大于10%。红细胞镰变试验 阳性，红细胞渗透脆性明显降低。血红蛋白电泳，可见 HbS带位于HbA和HbA2间，采用基因分析，可作出基因诊断。,HbS病有三种表现形式： 纯合子形式，即镰状细胞贫血； 杂合子形式，即红细胞镰状细胞性状； HbS和其他异常血红蛋白的双杂合子状态,2019/4/28,第 114 页,血红蛋白E病（ HbE）,是链第26位谷氨酸被赖氨酸替代的异常血红蛋白(2226谷-赖)。HbE病是出现血红蛋白E的常染色体不完 全显性遗传性血红蛋白病，为我国最常见的血红蛋白病。,【实验室检查】多为小细胞低色素性轻度贫血，红细胞渗透 脆性降低，血红蛋白电泳显示HbE占75%92%， 因HbE不稳定，异丙醇沉淀试验阳性和热变性试 验弱阳性；变性珠蛋白小体检测阳性。,三种类型：HbE纯合子、HbE特征和HbE/珠蛋白生成障 碍性贫血。临床表现一般为轻度溶血性贫血， 脾不肿大或轻度肿大，呈小细胞低色素性贫 血，易感染并使贫血加重。,（二）异常血红蛋白病,2019/4/28,第 115 页,不稳定血红蛋白病,是由于控制血红蛋白的肽链的基因突变，某些维持稳定性的氨基酸被取代或缺失，致使血红蛋白结构不稳定，称为不稳定血红蛋白。,本病诊断有重要意义的是变性珠蛋白小体检查、热变性试验和异丙醇沉淀试验为阳性，一般用异丙醇试验筛选，热变性试验和变性珠蛋白小体检查诊断。 多为正细胞性贫血，红细胞大小不均，有异形和碎片， 有时可见靶形红细胞，网织红细胞增高。 血红蛋白电泳仅有部分病例可分离出异常血红蛋白区带。,易变性和沉淀，形成变性珠蛋白小体， 相应临床表现差异大。,（二）异常血红蛋白病,2019/4/28,第 116 页,第五节 免疫性溶血性贫血的检查,检查抗体性质,明确诊断方向,判断效价水平,评估疾病程度,查找疾病原因,检查目的,编辑制作李克勤,2019/4/28,第 117 页,一、概述,免疫性溶血性贫血-是由于免疫功能紊乱产生某种抗体能与自己正常红细胞表面的抗原结合或激活补体，引起红细胞过早破坏而导致的一组获得性溶血性贫血，统称免疫性溶血性贫血。,定义：,2019/4/28,第 118 页,免疫性溶血性贫血的分类,一、概述,2019/4/28,第 119 页,二、实验室检查,（一）直接抗人球蛋白试验（DATG） 【原理】自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（IgG），是不完全抗体，结合在红细胞表面，使其致敏。直接抗人球蛋白试验（DAGT），是应用抗人球蛋白试剂（抗IgG和或抗C3d）与红细胞表面的IgG分子结合，并出现凝集反应。红细胞表面如果不存在自身抗体，则凝集反应呈阴性。,2019/4/28,第 120 页,（二）间接抗人球蛋白试验（IAGT）,【原理】 间接试验是检查血清中游离的不完全抗体的试 验。本试验是应用已知红细胞与抗人球蛋白血清，检测被检者血清中是否含有相应的不完全抗体，如果存在，则已知红细胞被致敏，再加入抗人球蛋白血清，可出现凝集。,2019/4/28,第 121 页,【 DAGT 与IAGT临床意义】,自身免疫性溶血性贫血,药物诱发性免疫性溶血性贫血,新生儿溶血病 ；结缔组织病,Rh和ABO血型不合的妊娠,（IAGT） 阳性见于：,（DAGT） 阳性见于：,2019/4/28,第 122 页,（三）冷凝集素试验（CAggT）,【原理】冷凝集素为IgM类完全抗体，在低温时可使自身 红细胞、0型红细胞或与受检者血型相同的红细胞发生凝集，凝集反应的高峰在04，当温度回升到37时凝集消失。,【试剂】 1.正常O型或与受检者相同血型2%红细胞悬液 （悬液制备方法同DAGT法）。 2.生理盐水,2019/4/28,第 123 页,（四）冷热溶血试验（D-LT）,【原理】 冷热溶血试验，是模拟病人发病的体外试验。将病人的血液置于O4冰箱中，此环境能使DL型冷反应性抗体与红细胞牢固结合，并同时结合补体，但无溶血，之后再将温度升至37使补体激活，并发生溶血，以此与PNH鉴别。,2019/4/28,第 124 页,三、免疫性溶血性贫血检查的应用,（一）温抗体型自身免疫性溶血性贫血（温抗体型AIHA） 温抗体型自身免疫性溶血性贫血，根据病因可分为原 发性和继发性两种，20%30%病例原因未明称原发性，其余为继发性。IgG是引起该贫血的主抗体，与红细胞的最适反应温度为3540的自身抗体称为温抗体。,2019/4/28,第 125 页,【温抗体型AIHA实验室检查分析】,正常色素性贫血，血片上可见红细胞大小不一。可见嗜多色性红细胞；点彩红细胞；数量不等的球形红细胞及幼红细胞。网织红细胞增高，极个别可达50% 。其溶血主要发生在血管外。,骨髓有核细胞增生，以幼红细胞增生为主，粒/红比例倒置，幼红细胞可呈巨幼样变，但血清叶酸及维生素B12测定都在正常范围。再生障碍时呈再障危象，为全血细胞减少骨髓象变化。,1.温抗体型AIHA外周血象,2.温抗体型AIHA骨髓象,2019/4/28,第 126 页,3.温抗体型AIHA直接Coombs试验： 直接抗人球蛋白试验(DAT)阳性，是诊断温抗体型自身免疫性溶血性贫血重要指标。,【温抗体型AIHA实验室检查分析】,2019/4/28,第 127 页,【温抗体型AIHA鉴别诊断】,温抗体型AIHA，是由于抗体附着在红细胞表面，导致红细胞呈球形，故应注意与遗传性球形红细胞增多症(HS)相鉴别，HS可有阳性家族史，但无抗自身红细胞的温抗体。,2019/4/28,第 128 页,诊断温抗体型溶血性贫血最重要的实验室检查是： A、Ham试验 B、Coombs试验 C、红细胞渗透脆性试验 D、免疫球蛋白测定 E、血红蛋白电泳,2019/4/28,第 129 页,女性，26岁，产后10天感头晕，乏力、尿黄。查体：贫血貌，巩膜黄染，脾肋下1指。Hb=60，白细胞血小板