一项高效的基因沉默技术rnai 南京凯基生物科技发展有限公司课件

一项高效的基因沉默技术RNAi,2011-09-28,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,What is gene silencing?,Essentially, it is the lack of expected expression from a gene,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,简介,1,研究进展,2,分子机制,3,RNAi的应用,4,CONTENTS,前景展望,5,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,简介,1,Gene expression,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，然而越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比RNA我们早前设想的更为重要。,RNA干扰（RNA interference）是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。,RNA干扰的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。,小RNA,内源性,外源性,广义RNAi：siRNA、miRNA,早期RNAi：siRNA,siRNA,miRNA,研究进展,2,1990年，Rich Jorgensen 在矮牵牛花中发现转基因沉默。,1995年，researchers Guo 和Kemphues 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1 基因的表达；三年后，Fire等注入双链RNA到线虫中发现比注入单链更有效，随后发展了通过RNAi进行线虫基因敲除的策略。,近年来，显微注射，基因枪，基因工程手段诱导RNAi也成为果蝇研究中的反向遗传学工具。,2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。,1990年，科学家给矮牵牛花插入一种生红色素的基因，希望能够让花朵更加鲜艳。 但是意想不到的事发生了：矮牵牛花褪色，花瓣变成了白色。,正常 实验 预期,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,1995年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par1 基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par21基因的表达，但是奇怪的是,注入正义链RNA 作为对照,也同样阻断了基因的表达。 这个奇怪的现象直到3年后才被解开华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA 正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。,颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制， 解释了困惑这一研究者们许久的难题。” “像在 清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。,安德鲁法尔 出生：1959年 任职于：美国斯坦福大学,克雷格梅洛 出生：1960年 任职于：美国马萨诸塞大学,2006年诺贝尔生理学或医学奖,RNAi广泛存在,最新研究：,1、Nature：肥胖根源在于microRNA？(2011-6),“MicroRNA 103和107 调节胰岛素敏感性” 这项发现可能会给人类潜在的肥胖治疗指明方向。,2、Cell：一新miRNA影响干细胞分化(2011-3),3、Nature Genetics：新型抑miRNA广谱药（2011-3）,miR166/165能影响参与分裂组织细胞发育的一种基因，从而影响干细胞分化。,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,4、Nature：哺乳动物直接复制RNA首获证实（2010-8）,6、Science：可调节胆固醇动态平衡的MicroRNA（2010-7）,7、Nature：能够抑制可卡因上瘾的microRNA（2010-7）,这是首次证明人类细胞能像复制DNA一样复制RNA。该发现强调了人类细胞中RNA群体的多样性，这些新型RNA对于开拓治疗新路径，尤其对诊断学的发展有重要意义。,5、Nature：miRNA在帕金森氏症中的作用（2010-7）,MicroRNA-33(miR-33)有助于调节高密度脂蛋白胆固醇的动态平衡。这意味着它或许能够成为心血管疾病和新陈代谢疾病的潜在标靶。,研究发现表明，受损的、由微RNA调控的沉寂作用与特定微RNA目标的失控表达之间有一个联系，它能造成帕金森氏症的发病；而且这些发现还提出了基于微RNA的可能治疗方法 。,“miR-212”能够降低对可卡因的欲望，但只是在长期使用该药物的大鼠身上才会是这样，而不是在对该药物没有依赖性的大鼠身上。这项工作提出一个可能性：调控非编码RNA的药物也许能够有效逆转药物上瘾。,9、Nature：首次实现利用RNAi治疗癌症（2010-3）,10、Nature：与基因沉默有关的特殊基因RDM1（2010-4）,8、Nature：RNAi干扰抑制癌症活跃基因（2010-5）,RNAi干扰可以促使Argonaute蛋白增加基因沉默 。医学界一直期盼有朝一日可以结束依靠化疗方法治疗癌症，而该项发现朝着癌症患者个性化基因治疗方向迈出了重要的一步。,科学家们合成了一种直径仅为70纳米的微小载体。这种携带了特定RNA的载体进入血液后，不会引起免疫系统的排异反应，可随着血液流动到达发生癌变的部位，然后进入癌细胞释放出RNA，而剩下的载体物质由于太过微小可随着尿液排出。,科学家们发现了一种特殊基因，没有它，植物细胞内其他一些基因就只能保持沉默。科研小组将发现的特殊基因名为RDM1，它可以编码生成一种小蛋白，从而参与指导其他基因的表达。,RNAi研究越来越受到科学家们的青睐！,分子机制,3,DNA,Ribosome,mRNA,Transcription & Translation,ER,相关酶及复合体,一种与RNAi有关的RNaseIII家族的酶，是生物进化中非常保守的序列，可以将dsRNA切割形成21-23nt的siRNA。,Dicer,RNase III 特异核酸酶,RdRP,(RNA-dependent RNA polymerase),以单链RNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成双链RNA。,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,RISC,(RNA-induced Silencing Complex),mRNA,解旋酶,核酸内切酶,Argonaute protein,siRNA,？,RISC包含siRNA中的一条链（反义链）,21-25 nts RNA,small interfering (si) RNA and secondary siRNA,siRNA,Ds RNA,RISC,SDE1/SGS2,trigger dsRNA,High levels of transcript,21-25 nts RNA,aberrant RNA,研究RNAi的技术路线,关键,目标,前提,效率,结果,目的基因的确立,siRNA序列的设计,siRNA序列的合成,siRNA导入目标细胞,RNAi的效果检测,siRNA序列的设计,1、从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 2、将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。 3、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。,一个严谨的siRNA实验应设有阴性对照。 作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。,负对照的设置,获得siRNA序列的方法,化学合成,尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要是价格昂贵。,获得siRNA序列的方法,体外转录,以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。,最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学 合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。,获得siRNA序列的方法,用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA,其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是2001000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。,获得siRNA序列的方法,优点：可以跳过检测和筛选有效siRNA序列 的步骤，为研究人员节省时间和金钱。 缺点：就是有可能引发非特异的基因沉默，特 别是同源或者是密切相关的基因。 现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺 失的表型。 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一 个特定的siRNA进行研究，特别是 基因治疗,用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA,获得siRNA序列的方法,siRNA表达载体,siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基 因沉默。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序 等较为费时、繁琐的工作）。,siRNA表达框架,获得siRNA序列的方法,siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。,最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动 子。 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了） 。,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,获得siRNA序列的方法,转染细胞,siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。 例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90%，但是其转染效率只有10%，那么总的抑制率只有9%。 目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。QIAGEN公司有专门的RNA转染试剂，其原理也是基于脂质体技术，可用于多种真核细胞的RNAi研究。,RNAi的效果分析,RNAi效果的分子水平检测主要通过mRNA和protein两个方面。 对于mRNA,主要采用RT-PCR，荧光定量PCR，或者通过Northern blot进行分析。 由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可以通过Western blot、ELASA、IF等来进行分析。 RNAi效果的分析只是前期的结果，RNAi最大以及最终的结果是细胞的代谢过程，生理生化系数等参数发生的明显变化。,What can RNAi do for us?,How does RNAi perform in the lab?,RNAi的应用,4,转录后水平的基因沉默机制（PTGS）,高效性：相对少量的dsRNA就可以 使相应的基因表达受抑制,可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的 效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代,RNAi特点,应用一：探索基因功能,在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。 由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。 在RNAi技术出现以前，基因敲除是主要的反向遗传学研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。,基因沉默的工具,应用一：探索基因功能,RNAi文库的构建,随着人类基因组计划的完成和蛋白质组研究的开展，标志着后基因组及蛋白质组时代的来临。我们的视野不再局限于单个的基因，整个研究领域都在期待呼唤更为强大的、全基因组高度的基因功能研究工具。,RNAi文库(RNAi library)是人工构建的能通过诱导沉默众多不同基因表达的组合文库，可以用于建立功能缺陷(loss of function) 的生物或细胞库，进行表型的筛选。对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。,应用二：基因治疗领域,病毒性疾病的治疗,例一：治疗HIV感染,RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。,Jacque等针对HIV-1基因组的长末端重复序列LTR(Longterminal repeate，LTR)、附件基因vif和nef设计了siRNA，将siRNA转染进HIV后，这些基因的水平降低了95。,应用二：基因治疗领域,病毒性疾病的治疗,例二：治疗肝炎病毒感染,据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了凋亡相关蛋白质（FAs）基因所导致的。 Jude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默” FAs基因的siRNA，发现有90的肝细胞接收到了这种RNA分子，FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受RNAi治疗的实验鼠有40在天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。,应用二：基因治疗领域,遗传性性疾病的治疗,美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi与脆性染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。,遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。为单个或多个基因相互作用导致的疾病提供新的治疗前景。,应用二：基因治疗领域,肿瘤的治疗,RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长。,Scher 等以引起慢性髓性白血病和bcr ab1阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr ab1癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。 Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表达也取得了成功。 因此基于 RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。,应用二：基因治疗领域,肿瘤的治疗,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,应用三：整形外科领域中的应用前景,研究已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变,而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。,使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。,瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，目前尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-II型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。 剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和III型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子（TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。,应用三：整形外科领域中的应用前景,应用四：药物筛选中的应用及市场,ONeil NJ, Martin RL, Tomlinson ML, Jones MR, Coulson A, Kuwabara PE. RNA-mediated interference as a tool for identifying drug targets. Am J Pharmacogenomics. 2001;1(1):45-53 线虫Caenorhabditis elegans是第一个测出基因组全序列的多细胞有机体，是功能基因组分析中一种重要的模式生物。 RNAi是一个高效高通量的破坏基因功能的方法，结合线虫的表型筛选即可作为研究药物筛选中基因靶位点分析，杀虫剂机制等的有效工具。,南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812,2007年7月5日，阿斯利康和英国一家RNA干扰公司S