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色谱分析法 Chromatography,第一章 色谱法引论,一、概述 问题 问题1：什么是色谱法？ 问题2：为什么色谱法能将混合物分开？ 问题3：色谱法的分类？ 问题4：各种色谱法的应用范围？,1、什么是色谱法？,茨维特的实验 茨维特：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作，在1906 年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。,茨维特的实验,碳酸钙,石油醚,什么是色谱法？,Chromatography 色谱法是一种分离方法。 特点：有两相，一是固定相（stationary phase），一是流动相（mobile phase），两相作相向运动。 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。 因此色谱分析是一种分离、分析法。,2、色谱法分离原理,当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,3、色谱法的分类,按流动相状态的不同，可分为以下三类： 气相色谱法 (Gas Chromatography, GC) 液相色谱法 (Liquid Chromatography，LC) 超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromatography，SFC),色谱分析仪器流程,流动相携带进样装置引入的混合试样进入色谱柱 混合试样在色谱柱中进行分离 各组分依次进入检测器检测 检测响应信号导入计算机 得到色谱图,什么是气相色谱法？,以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatogaphy，简称GC 按固定相状态的不同可分为： 气固色谱(GSC) 气液色谱(GLC),应用范围： 用于分离分析易汽化（在-190-500范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。,什么是液相色谱法？,以液体为流动相的色谱法 Liquid Chromatography，简称LC 应用范围： 用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,其他分类方式,按固定相使用的形式可分为 柱色谱（column chromatography） 将固定相装在色谱柱内 纸色谱（Paper Chromatography） 用滤纸做固定相或固定相载体的色谱 薄层色谱（Thin Lay Chromatography） 固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上,应用 TLC:,1 2 3 4 5 6 7 8 9,Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside Rg1 4 Ginsenoside Rf 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Ginsenoside Rb1 8 Notoginseng 9 Notoginsenoside R1,Identification of Ginseng, America ginseng and Notoginseng,二、色谱法基本理论,拟解决的问题 色谱相关术语 色谱法理论的概况 色谱中的动力学理论 色谱分离情况的评价方法 影响色谱分离的主要因素及条件选择（从理论的角度加以判断）,1、色谱相关术语,关于色谱峰 关于保留值 关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,关于色谱峰的术语,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为：W=4，Wh/2=2.354 拖尾峰 伸舌峰 鬼峰、假峰 畸峰 峰底 基线漂移 基线噪声 谱带扩张,关于保留值的术语,死时间（t0，tM）：无保留组分出峰时间 保留时间（tR）： 调整保留时间（tR）：,关于保留值的术语,死体积（V0，VM）： 保留体积（VR）： 调整保留体积（V R）：,关于保留值的术语,相对保留值（ri,s）： 相对保留值又称为选择性因子（） 在气相色谱中，相对保留值的大小仅与固定相种类和柱温有关。,关于保留值的术语,保留指数（I）：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：,关于分配平衡,分配系数K（distribution coefficient ）,关于分配平衡,分配比k：又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,关于分配平衡,相比： 色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。,2、色谱基本理论概述,研究理论的目的 解决色谱峰的分离问题 三个色谱基本理论问题 色谱热力学问题发展高选择性色谱柱 色谱动力学问题发展高效能色谱柱 分离条件的最优化问题分离条件优化,3、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素 塔板理论 速率理论,塔板理论,塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：,塔板理论,当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量W，是峰高定量的理论基础。 当n越大，柱效越大，Cmax/W越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。 Cmax反比于tR，tR小，Cmax大， 保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小， 保留时间大的组分峰低且宽。,柱效,由流出曲线方程导出： H=L/n,柱效,n是峰相对展宽的量度 n是柱效的量度 n是常数时，Y与tR 成正比 n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。 导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。 导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。 不能解释流速对理论塔板数的影响。 有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,4. 色谱相关术语,关于色谱峰 关于保留值 关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为： W=4，Wh/2=2.354 拖尾峰 伸舌峰 鬼峰、假峰 畸峰 峰底 基线漂移 基线噪声 谱带扩张,关于保留值的术语,死时间(tM): 无保留组分出峰时间 保留时间(tR): 调整保留时间(tR): 死体积(VM): 保留体积(VR): 调整保留体积(VR):,相对保留值(ri,s): 保留指数(I)：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：,关于分配平衡,分配系数K (distribution coefficient ) 分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,相比 色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。,二、色谱分析法基本理论,研究理论的目的 解决色谱峰的分离问题 三个色谱基本理论问题 色谱热力学问题发展高选择性色谱柱 色谱动力学问题发展高效能色谱柱 分离条件的最优化问题分离条件优化,1、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素 塔板理论 速率理论,（1）塔板理论,推导 塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：,为标准偏差,当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量C0，是峰高定量的理论基础。 当n越大，柱效越大，Cmax/ C0越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。 Cmax反比于tR，tR小，Cmax大， 保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小， 保留时间大的组分峰低且宽。,对色谱流出曲线方程的讨论,柱效,由流出曲线方程导出： H=L/n n是峰相对展宽的量度 n是柱效的量度 n是常数时，Y与tR 成正比 n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。 导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。 导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。 不能解释流速对理论塔板数的影响。 有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,速率理论,速率理论是1956年荷兰学者Van Deemter等提出，因此又称作范第姆特方程 运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素,速率方程的导出,根据塔板计算公式： n=5.54(tR/Y1/2)2 速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。 H=A+B/u+Cu,涡流扩散项,A=2dp,涡流扩散项,均匀性因子,粒径,涡流扩散项,涡流扩散项A：由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。,分子扩散项,B/u B=2Dg,弯曲因子,扩散系数,分子扩散项,分子扩散项：由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展,传质阻力项,气相传质阻力项,气相传质阻力项Cg：试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,气相传质阻力项表达式,Cgu Cg =,容量因子,液相传质阻力项,液相传质阻力项CL：试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,液相传质阻力相表达式,CL u CL =,液膜厚度,液相扩散系数,气相色谱中的速率方程,速率方程给我们的什么启示,为柱型的研究和发展提供理论依据 为操作条件的选择提供理论指导 为色谱柱的填充提供理论指导,对柱型研究和发展的影响,A=0? Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentube） 毛细管柱A=0，H=B/u+Cu H，N，分离能力大大提高,对柱型研究和发展的影响,B=0? 溶质在液体中的扩散系数DL10-5cm2/s 溶质在气体中的扩散系数Dg10-1cm2/s DL Dg 当采用液体作流动相时 B0 液体作流动相时可用更细的固定相，A HPLC柱效比GC要高23个数量级,操作条件对柱效的影响,载气线速度（流速）的影响,最佳流速：u=(B/C)1/2 实用最佳流速：比最佳流速更快 A与流速无关 B/u：当流速小时，对H的大小起主导作用 Cu：当流速大时，对H的大小起主导作用,容量因子k的影响,不同组分k不同，测出的柱效不同 在气相传质阻力相中，k ，Cg 理论上说k越小柱效越高，实际不可取 在液相传质阻力相中，k ，Cl先， 后当k=1时，最大。 希望k在一个合适的范围内，通过改变柱温，固定相，柱型参数等可实现。,柱温的影响,间接影响、十分复杂 对k影响，对扩散系数影响，从而对柱效产生影响，但影响情况难以判断,对色谱柱的填充提供理论指导,柱径：根据速率方程，柱径越小，柱效越高，但柱径越小，固定相越难填充均匀。 柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但柱长增加，分离时间将增加。 固定相粒径dp：根据速率方程，粒径减小，A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充，同时A项增大。,对色谱柱的填充提供理论指导,液膜厚度df：从柱效角度考虑，液膜越薄，柱效越高（根据速率方程），但允许的进样量减小。固定液与担体的配比一般在5:100-25:100之间，但现在更低配比的固定相也应用广泛。 更重要的是：不同沸点的物质，应采用不同配比的固定相。,影响谱带扩张的其他因素,非线性分配色谱 载体表面活性吸附中心造成的拖尾 柱外效应 色谱柱外引起色谱峰扩展的因素：如进样系统及进样方式、系统连接管、检测器死体积，检测器响应时间常数等因素引起的谱带宽展。,速率理论方程式的偶合式,H=(1/A+1/Cgu)-1+B/u+Clu A= (1/A+1/Cgu)-1为偶合项 已被普遍接受,2. 色谱分离基本方程,对于常规分析工作，一般选用： 选择性系数（相对保留值）与保留指数I来评价固定液 有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件 以分离度R作为柱的总分离效能指标,（1）几个概念选择性系数,定义与相对保留值(ri,s)基本相同 不同之处在于选择性系数是两个相邻峰的调整保留值之比（后峰比前峰，1），而不是被测物与标准物质的调整保留值之比（可小于1） 它是评价固定液选择性的指标。选择性系数越大，该柱对此相邻峰的分离越好。,几个概念有效塔板数N有效,在气相色谱中，通常用有效塔板数N有效和有效塔板高度H有效来评价柱子的分离效能，它扣除了死体积对分离的影响，更好地反映了柱子的实际分离效能。 柱效越高，该柱的分离能力越好。,几个概念分离度R,R越大，说明两组分分离得越好。 由于该定义综合了色谱动力学和热力学因素，可作为色谱柱的总分离效能指标。,(2)色谱分离基本方程（Purnell方程）,公式推导,（3）色谱分离基本方程的启示,要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，可以采取以下措施： 提高柱效N 提高选择性系数 增大容量因子k,N的影响，如何提高N？,分离度R与理论塔板数N的平方根成正比关系，增加塔板数，有利于提高分离度。 增加柱长可增加N，改善分离，但分析时间将大大延长，峰产生扩展。 减小塔板高度H： 根据速率方程的启示制备一根性能优良的色谱柱是十分重要的。 根据速率方程选择合适的色谱条件同样有效。,K的影响，如何改变k？,分离度与容量因子有关，容量因子越大，分离越好。 k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00 但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是1k10。,改变容量因子的方法有： 改变柱温 改变相比，即改变固定相的量和改变柱死体积，其中死体积对k/(k+1)的影响很大，使用死体积大的柱子，分离度将受到很大损失。 在高效液相色谱中改变流动相的配比是最简便、最有效的方法,的影响，如何改变？,越大，分离效果越好。 增大是提高分离度最有效的手段。 改变柱温也可改变。 因此在气相色谱中，增大最有效的手段是改变固定相，选择合适的固定相种类是解决分离问题的关键 在高效液相色谱中，流动相的种类和配比是改善分离最简便有效的方法。,（4）分离度究竟要多大？,一般来说R应大于1.5。 具体工作中应根据样品要求和定量方法来确定。 例如：含量50%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2=1.28，而采用峰面积定量R1/2需1.00。含量1%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2=1.83，而采用峰面积定量R1/2需2.37。,3. 气相色谱操作条件的选择,流速 柱温 气化温度 检测器温度 进样量 载气种类 固定相种类,流速u（Fc）,根据速率方程，可计算求出最佳流速，此时柱效最高。在实际工作中，为缩短分析时间，往往使流速稍高于最佳流速。 具体的：对于填充柱，氮气的实用最佳线速为10-15cm/s；氢气为15-25cm/s；氦气介于两者之间。若填充柱内径为3mm，则体积流速为氮气15-25ml/min，氢气30-50ml/min。,柱温Tc,直接影响分析效能和分析速度。 每一种固定液都有它的最高使用温度，柱温不可超过这一温度，否则固定液挥发流失。 柱温太高，组分挥发度靠拢，不利于分离。但柱温太低，被测组分的扩散速度下降，分配不能快速达到平衡，影响峰型，柱效下降，并使分析时间大大延长。 柱温选择的原则是，在保证难分离物质有良好分离的前提下（分离度满足要求），可以采取较高柱温，以缩短分析时间，保证峰型对称。,混合物bp 柱温 固定液含量 300 低于bp100-200 1-3% 200-300 低于bp100 5-10% 100-200 平均bp的2/3 10-15% 气体 室温 15-25% 吸附剂 沸程范围100 程序升温,具体的,汽化温度,一般进样方法下，汽化温度比柱温高30-70。 进样量大时高一些好，保证瞬间汽化。 保证不可超过试样的分解温度。 其它气化温度与具体进样方式有关。,检测器温度,一般大于或等于柱温，具体与检测器种类有关。,进样量,液体试样一般进样量0.1-5l。 气体试样一般进样量为0.1-10ml。 具体视柱类型，固定液含量（不能超过柱容量） 、进样方式、检测器的灵敏度和线性范围等确定。,流动相（载气）种类,流动相的种类要视检测器种类确定。 常用的有氢气（热导用）、氮气（氢火焰用）、氦气（均可用，但价格较高）。 氢气和氦气适合于快速分析。 氮气做载气峰型较好，柱效较高。,三、色谱定性与定量方法,人参药材的HPLC图谱,5,1,人参皂苷标准品的HPLC色谱图,Rg1,Rb1,Re,丙二酰基人参皂苷Rb1,面积归一：Rg1=1.0%, Rb1=3.5% 外标法：Rg1=0.2%, Rb1=0.5%,（1） 色谱定性分析,利用保留值及其规律定性 各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。 利用纯物对照定性 利用文献值对照定性,纯物质对照定性,实现方法 利用保留时间和保留体积定性,用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性,应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。 优点：应用简便，不需要其他仪器。 缺点：定性结果的可信度不高。 提高可信度的方法：双柱、双体系定性,文献值对照定性分析 （GC）,实现方法 测定相对保留值ri,s 测定保留指数I 优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。 缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。 适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。,与其它仪器或化学方法联合定性,离线联用方式 化学法 仪器法 在线联用方式 化学法 仪器法,离线联用方式,收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷却后收集 应用范围：无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析 缺点：麻烦,在线联用方式,用化学方法辅助定性 柱前反应：在色谱柱前装上预处理柱，带有某些官能团的化合物在预柱中发生物理化学变化，其色谱峰会消失或移动，与反应前色谱图比较，可初步判断试样中含那些官能团。 柱后反应：在色谱柱后装上型毛细管分流器，将各组分导入官能团试剂反应管，利用官能团反应对组分进行定性。,与其它仪器联用定性 混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS 其它仪器相当于色谱仪的检测器。 使用范围：复杂样品的定性。 优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。 缺点：需要特殊仪器或设备。,GC-MS,（2）色谱定量分析,定量基础 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：,定量要解决的问题,峰面积的测量和计算 校正因子的测量与计算 色谱定量方法及其应用,峰面积的测量与计算,积分仪或色谱工作站 简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。 手动测量与计算,峰高乘半峰宽法：适于对称峰 峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰 峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰 峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。,重叠峰的测量,切线分峰 垂线分峰,连线分峰 计算机拟合