针刺干预脑出血大鼠模型实验中的体会与思考.doc

针刺干预脑出血大鼠模型实验中的体会与思考The realization and reflection on the experiment research of intracerebral hemorrhage rats treated by acupuncture褚鑫，蔡恩丽，方涛，武煜明CHU Xin,CAI En-li,FANG Tao,WU Yu-ming通讯作者：武煜明（云南中医学院，云南昆明 650500）(Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming Yunnan，650500）云南省应用基础研究面上项目（项目编号：2011FZ157）作者简介：褚鑫（1984），男，河南南阳人，在读硕士研究生，研究方向：中西医结合防治疾病机理研究地址：云南省昆明市呈贡区雨花路1076号云南中医学院2011级研究生1班褚鑫收邮编：650500电话箱：349898181【摘要】针刺防治脑出血（ICH）疗效肯定，具有广阔前景，但由于各种因素的制约，致使针刺干预ICH的实验研究中存在不少问题。笔者结合自身开展针刺对ICH大鼠实验研究的体会，对ICH的动物模型和针刺实验研究进行分析，并就灌注取脑的方法、制作脑组织石蜡切片各环节的时间进行总结，为针刺防治ICH实验研究方法的统一提供参考，从而促进ICH研究的发展。【关键词】针刺，脑出血，大鼠模型，实验研究脑出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）即原发性非外伤性脑实质内出血，是严重威胁人类生命的常见病、多发病，因其致死、致残率极高，一直是医学界研究的热点。ICH根据其症状和体征可归属于中医学“中风”范畴，针刺治疗ICH具有悠久的历史，已成为一种疗效肯定的治疗方法，在世界范围内得到广泛运用和推广。近年来，随着针刺干预ICH研究的深入，不仅有许多有效的治疗方法得以推广，而且在针刺干预ICH实验研究方面也有大量有益的探索。但就总体而言，实验研究依然存在局限性，不利于临床中针刺治疗ICH水平的提高。为此，笔者在目前针刺防治ICH研究现状的基础上，结合自身体会，对针刺干预ICH大鼠模型的实验研究做出如下思考：1 对ICH大鼠模型的分析ICH动物模型与人类ICH的近似程度直接关系到自发性ICH实验研究的价值。随着老龄化社会日益明显，临床ICH患者大多是在动脉硬化和高血压的基础上导致小动脉透明脂质化及纤维素样坏死，小动脉弹性下降，最终形成动脉瘤破裂出血。ICH患者有多种临床表现，病情严重程度、持续时间、早期血肿扩大与继发性的出血等与脑血管的基础病变有很大的相关性，并且ICH患者大多存在不同程度的残疾。动物实验中，一个良好的ICH模型应最大程度地再现人类ICH的病理生理过程，但目前常用的四种ICH动物模型，均与人类ICH的发生存在一定的差距。如自发性ICH模型由于遗传性血管损害及制作过程中不稳定等因素的制约，使其应用大大受限；微球囊充胀是一种单纯的机械压迫，由于不能模拟血液成分如红细胞、血浆蛋白等在ICH后脑损伤中所起的作用，因此，该模型在近年来已经很少使用；胶原酶诱导ICH的出血区是弥漫性渗血与脑组织混合在一起，并非一个完全的血肿，病理上类似于出血性梗死。而且胶原酶注射后需要一定时间才能诱导出血，此外胶原酶诱发的炎症反应比人ICH更强烈，与临床自发性ICH的发病情况不同；自体血注入法用于大动物时产生的血肿大小形态比较一致，重复性较好，但用于大鼠等小动物时重复性差，尤其是血肿大小等难以掌握。并且该模型不能模拟人ICH时深穿支动脉破裂的过程，注血速度稍快，血流往往顺针道溢出，进入蛛网膜下腔，且易破入脑室。由于自体血注入法相对来说比较接近临床，大量的实验工作者进行了有益的探索，如二次注血法、二次注血改良法、三次注血法、注射凝固血法等，并且取血方法也各有不同，有断尾取血法、股动脉取血法、尾动脉取血法、心室取血法等。但迄今为止自体血注入法亦存在不同的缺点，比如造模后均存在自愈的问题，有动物实验1-3发现用自体血建立ICH大鼠模型，出血后6h大鼠出现行为学改变,3d时达高峰,7d时基本恢复正常。包括三次注血法大鼠的行为学7d时也基本恢复正常，本实验大鼠的行为学亦存在不同程度的恢复，与上述实验结果相符。注射凝固血法虽然看似解决了血液随针道溢出的问题，但血液凝固后，血清的逆流影响血肿的大小也是需要考虑的问题。有研究4, 5表明临床ICH患者较大比例存在一定程度的血肿扩大，时间多位于24h之内，尤其是6h内。而对ICH急性期针刺治疗的争议之一便是刺激血肿扩大，显然自体血注入法存在血肿不可能扩大的缺陷。至今大多数ICH模型用健康、年轻的动物制作，其脑动脉无基础损伤、脑血流自动调节功能和侧支循环良好，病理改变容易自愈，导致模型动物对治疗的反应性与临床实际有较大差距，实验结果缺乏可靠性。有学者指出6在ICH动物实验中证明有效的治疗方法在临床应用中却疗效甚微，其主要原因就是动物模型与人类ICH发病情况不符合。甚至有学者认为7，用现阶段的ICH模型反而会妨碍ICH治疗水平的提高。2 对针刺实验研究的分析随机对照实验是针刺实验不可回避的问题，尤其是实验中假针刺组的设立至关重要。目前在假针刺对照组的设立方面多数为安慰针刺法、以经穴旁开为假针对照组、在传统经穴处浅刺、选择它经之穴及非穴处进行针刺，但均存在不同程度的漏洞。如果从另一角度思考，采用临床上公认确实有疗效的治疗方法或常规治疗作为针刺治疗的对照组，可能更有利于评价针刺疗法的整体效应。另外，目前国内外普遍采用的针刺大鼠固定方法为束缚固定法，但此类方法会引起大鼠束缚应激效应，严重干扰了对针刺效果的客观分析。针刺实验中常用的大鼠固定方法还有器械固定、手部抓取固定和狭小空间固定方法等，但亦存在与束缚固定类似的缺陷。参照大鼠置高台固定方法8，利用大鼠恐高的特性，将其置于一定高度的窄板上，可以有效地减少因束缚应激效应对大鼠的影响，更加真实地反应针刺的效应。但高台固定方法的缺点是在选择穴位时尽量选择背部及头面部等部位的穴位，避免选择腹部的穴位。在电针治疗过程中，还应密切观察大鼠并及时有效阻止其洗脸动作，防止针具频繁脱落。同时，如果针刺选择了百会等穴位时，在制作ICH大鼠模型的皮肤切口应当选择头顶正中线旁开的位置，以免影响针刺的部位。3 灌注取脑与制作脑组织石蜡切片针刺干预后，大鼠需要固定液灌注后取材以最大程度地保护脑组织结构不被自溶所破坏。高永强等9比较了不同时间的灌注方法，发现进行脑深部核团结构研究时选择1h灌注组即长期灌注组脑组织结构固定保留好。因ICH大鼠模型脑出血的位置一般在尾壳核附近，本实验采用4%多聚甲醛长时间灌注。多聚甲醛灌注液的配制亦需要一定的技巧:因多聚甲醛不易溶解,配置过程中可将蒸馏水适当加热,持续搅拌使多聚甲醛粉末完全溶解,有时需加少量的NaOH才能使溶液清亮；或者将配好的灌注液放置3天左右，多聚甲醛亦可以完全溶解。灌注时穿刺针头一定要刺入左心室,否则会出现灌注液从大鼠鼻腔滴出等灌注不成功的现象。灌注全程及灌注之后取脑均宜在冰浴中进行，取脑过程也应尽量避免损伤脑组织。由于大鼠脑组织在含水量等与其它组织存在一定的差异，且磷脂含量高，水与其结合牢固不易脱出，为了避免后期实验过程中出现问题，在脱水透明过程中时间的控制尤为重要。本实验经过比较所采用的脱水方法对后期的检测等环节没有影响，方法如下：固定脑组织30-40分钟后冲水2-3h，脱水透明（将脑组织依次浸入70%乙醇3h，80%乙醇2h，90%乙醇过夜，95%乙醇2h，无水乙醇0.5h，无水乙醇0.5h，二甲苯20min，二甲苯20min），浸蜡（将脑组织依次浸入石蜡、石蜡各2h），包埋切片后放入60烤箱2h备用。综上所述，针刺干预ICH大鼠模型的实验已经取得了不少的成果，但目前仍缺乏既有类似人类高血压、动脉硬化的病理生理基础,又较接近人类ICH发病情况、出血量及出血部位均有较好重复性的ICH动物模型，ICH恢复期的动物模型则更加缺乏。因此继续寻找与人类ICH急性期与恢复期接近的ICH动物模型是动物实验研究的当务之急。虽然针刺治疗ICH的记载可追溯至2000余年前的黄帝内经，如“大怒则形气绝，而血菀于上”、“血之于气并走于上，使人大厥”、“大风在身，血脉偏虚，虚者不足，实者有余，轻重不得，倾侧宛伏，泻其有余，补其不足，阴阳平复，用针若此，疾于解惑”等，如今针刺防治ICH更是具有丰富的经验，但针刺疗法如何进行随机对照实验仍然是亟待解决的问题。总之，针刺治疗ICH的实验研究只有处理好继承、发展与创新之间的关系，进行合理的设计，通过科学的研究手段，建立更接近临床的ICH动物模型，规范实验中的各个环节，才能更加有效地服务和指导临床。参考文献1 李红玲，刘瑞春，缑元冲，等. 自体血三次注入法建立脑出血大鼠模型J. 中国康复理论与实践. 2006(08): 651-653.2 张朋奇，朱贤立，赵甲山，等. 一种大鼠脑内出血模型的建立与评价J. 中国临床神经外科杂志. 2005(01): 38-40.3 张祥建，刘春燕，祝春华，等. 大鼠自体动脉血脑出血动物模型的建立J. 脑与神经疾病杂志. 2003(06): 341-344.4 褚晓凡，曲松滨，石峰，等. 高血压脑出血继续出血问题研究(附50例CT与尸体解剖研究)J. 中风与神经疾病杂志. 1998(01): 26-28.5 Brott T B J K R. Early hemorrhage growth in patients with intracerebral hemorrhageJ. Stroke. 1997(28): 1-5.6 Neff. Clincal relevance of stroke modelsJ. Stroke. 1989(20(4)